文摘
特发性肺纤维化(IPF)是最常见的间质性肺病的特征的持续激活myofibroblasts导致细胞外基质蛋白的过度沉积和深刻的组织重构。在目前的研究中,表达的肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)是解决bleomycin-induced肺纤维化的关键。这两个在活的有机体内和在体外研究表明,Gr-1+小道+来源于骨髓的骨细胞阻塞肺myofibroblasts的激活。虽然可溶性TRAIL在等离子IPF患者增加,小道的存在+髓系细胞显著减少IPF肺活检,从这个病人组和主肺成纤维细胞表达的TRAIL受体2 (DR5)相比,适当的正常样本。IL-13 DR5表达的是一个强有力的抑制剂在正常成纤维细胞。在一起,这些结果发现线索+髓细胞作为一个关键机制在肺纤维化的决议,针对促进其功能和策略可能在IPF治疗的潜力。
1。介绍
IPF是最常见的临床的间质性肺疾病的预后生存中值在诊断和没有有效的药理干预(3 - 5年之后1- - - - - -3]。IPF的特徵是组织学上成纤维细胞的焦点,这被认为是该网站的活跃组织重构和沉积的细胞外基质蛋白激活成纤维细胞或myofibroblasts的存在。IPF的纤维化的触发器是未知的但这是推测,一个持久损伤肺导致肺泡上皮细胞的死亡和随后的异常修复机制切除肺泡(4- - - - - -11]。相关的一个关键特性的异常修复过程中纤维间质性肺疾病是激活myofibroblasts的持久性,这是抵抗和/或缺乏必要的组件响应proapoptotic信号(9- - - - - -14]。
跟踪缺陷之前已经报道过加剧bleomycin-induced肺纤维化小鼠(15),但痕迹的方式促进了肺纤维化的决议目前未知。跟踪是一种有效的诱导凋亡细胞死亡和结合各种死亡受体细胞通过一个数字在人类中有五个:TRAIL-R1 (DR4) TRAIL-R2 (DR5) TRAIL-R3, TRAIL-4,和osteoprogenin(功能);在老鼠和四个:mTRAIL-R2 (mDR5) mDcTRAIL-R1, mDcTRAIL-R2和功能。DR4、DR5和mDR5包含一个完整的细胞质死域,可以激活内在和外在凋亡的死亡通路响应绑定的小道(了16])。然而,TRAIL-R3 TRAIL-R4、mDcTRAIL-R1和功能缺乏一个完整的死域和被认为是诱饵受体。TRAIL-based癌症治疗的上下文中都进行了广泛的研究,但取得了有限的临床成功由于变量敏感性的癌细胞proapoptotic因素。一个策略,加强跟踪报道易感性癌症包括改变配体的表达在骨骨髓来源间充质细胞17]。这些细胞肿瘤的网站,因为他们的再生能力持续在这些网站。事实上,骨髓细胞的重要来源的间充质和造血起源保护、再生,恢复后的肺纤维化(18- - - - - -25]。后者的造血细胞与强有力的免疫调节特性,包括髓细胞由随之而来的表面特征的表达CD11b和老鼠Gr-126- - - - - -31日]。
在此,我们采用clodronate脂质体(土块脂肪)和anti-Gr-1马伯策略来调节Gr-1的存在和功能+来源于骨髓的骨头人口bleomycin-challenged老鼠。Anti-Gr-1马伯治疗已被证明耗尽这个群体,而clodronate脂质体可以动员骨髓髓系的释放和其他细胞类型(32,33]。我们发现Gr-1的损耗+髓细胞阻止bleomycin-induced肺纤维化的决议,而从骨髓动员或孤立Gr-1过继转移+髓细胞之前或之后博来霉素挑战增强纤维的速度分辨率在这个模型中通过TRAIL-dependent myofibroblasts神经细胞凋亡。临床上,IPF患者表达水平升高循环路线,但组织切片的IPF患者表现出一些线索+髓细胞,降低DR5的表达与正常样本。显著减少DR5表达在IPF人类成纤维细胞与正常成纤维细胞相比,这种受体的表达被IL-13抑制。因此,这些数据显示,的存在+来源于骨髓的骨头肺部细胞群施加强有力的antifibrotic通过促进myofibroblast细胞凋亡的影响。促进TRAIL-dependent proapoptotic活动对人类成纤维细胞可能为IPF提供急需的治疗选择。
2。材料和方法
2.1。Bleomycin-Induced肺纤维化
男,C57BL / 6小鼠(6 - 8周的年龄)从泰康利农场购买Inc .(纽约哈德逊)和维护特定的无菌条件下密歇根大学医学院。密歇根大学的动物的使用和护理委员会批准在这项研究中使用的所有协议。老鼠与氯胺酮麻醉/甲苯噻嗪(100毫克/公斤),每个老鼠收到0.05 U的硫酸博来霉素(Bristol-Meyers制药)溶解在50μ通过口咽滴剂l (PBS。bleomycin-challenged小鼠组( /组)收到anti-Gr-1马伯(100μg /注射;RB6-8C5 (anti-Ly6G);eBioscience)或同形像控制(eBioscience)通过一个ip注入21天,和肺进行评估后42天博来霉素的挑战。促进释放从骨髓髓细胞,巨噬细胞使用clodronate-encapsulated脂质体(购自被损耗http://clodronateliposomes.com,提供5毫克/毫升的解决方案)。实现一个完整的巨噬细胞耗竭,剂量为0.1毫升/ 10 g是推荐的制造商(http://clodronateliposomes.com)。然而,在我们的研究中,利用0.1毫升/ 20克,在动员Gr-1有效+细胞治疗动物没有clodronate-induced毒性的证据。简单地说,老鼠组(n= 5 - 10 /组)治疗0.1毫升的ip clodronate-encapsulated注射脂质体(缩写土块脂肪)前1天或14天之后,博来霉素的挑战。同样体积的PBS-encapsulated空白脂质体(缩写为脂肪)是用来控制一天之前,博来霉素。liposome-treated组的老鼠进行了分析在第五天,14日,博来霉素后和/或21的挑战。
2.2。收集和肺Gr-1过继转移+髓细胞
老鼠收到clodronate-encapsulated脂质体博来霉素治疗(即之前有一天。D−1)。肺Gr-1+从这些小鼠骨髓细胞纯化后第五天博来霉素通过magnetic-activated细胞排序(mac;Miltenyi anti-Gr-1马伯的生物技术)通过使用。组的老鼠( /组)在第五天或14博来霉素后收到了mac的挑战- - - - - -纯化Gr-1+髓细胞(1×105细胞在50μl (PBS)麻醉下经口咽的路线。分析了两组在博来霉素后21天。
2.3。与纯化Gr-1 Coculture肺成纤维细胞+髓细胞
肺成纤维细胞分离从天真的老鼠详细如前所述34)和镀在5×105细胞/在6-well细胞培养板。Cocultures创建的MACS-isolated肺Gr-1+髓细胞(1×105细胞/)24小时的培养的成纤维细胞。浮在表面的游离收集来确定蛋白质的水平,和其余的贴壁细胞在这些cocultures受到RNA定量PCR的隔离。其他cocultures受到共焦显微镜可视化附着成纤维细胞胶原蛋白的表达。短暂,贴壁成纤维细胞被固定和permeabilized和孵化anti-collagen-1马伯(Abcam) 24小时后跟Alexa面粉594 -共轭二次抗体(生命技术)。然后每个幻灯片用Prolog金Anti-Fade包含DAPI(技术),盖玻片上,与蔡司LSM510共焦显微镜和图像分析C-Apochromatic 40 x物镜(卡尔蔡司)。图像被组装为Mac使用Adobe Photoshop CS2。在其他的实验中,培养小鼠成纤维细胞暴露在浓度增加sTRAIL 24 h和RNA定量PCR分析被孤立。
2.4。组织学和细胞分析
马森Formalin-fixed和石蜡包埋肺部分沾色检测胶原沉积。Cytospin样本支气管肺泡灌洗样本准备,固定和染色使用Quick-Diff染色设备。
2.5。RNA隔离和实时TaqMan PCR
总RNA制备使用试剂盒试剂从肺样本根据制造商的方向(生命技术)。RNA是reverse-transcribed cDNA使用M-MLV逆转录酶(技术)。GAPDH是作为内部控制。实时定量PCR进行了使用TaqMan 7500序列检测系统(应用生物系统公司)。测量标准化GAPDH水平和数据提出了从天真的褶皱变化组。
2.6。ELISA
il - 10 - 2, IL-13, il - 4、CCL22 CCL17 TGF -β干扰素-γ和水平测定在整个肺匀浆使用一个标准化的夹心ELISA技术(研发系统)。重组小鼠蛋白质被用来生成标准曲线(研发系统)。结果归一化总蛋白量由布拉德福德试验和测量每个蛋白质的检测极限一直高于50 pg / ml。
2.7。流式细胞术
肺组织保持酶的消化,沾染了细胞内或表面抗体(BD Pharmingen)详细如前所述35]。固定细胞悬浊液受到多色流式细胞术(Cytomics fc - 500;贝克曼库尔特)。数据分析与FlowJo软件(TreeStar)。
2.8。人类的样本
血浆、肺活检和初级纤维母细胞线路从nondiseased获得和IPF患者使用常规免疫组织化学技术和分析、ELISA和定量PCR,详细描述了在其他地方(36,37]。批准使用这些血液、组织和细胞样本从一个机构审查委员会获得密歇根大学医学院。知情同意是获得包含之前所有的病人描述的研究。所有的研究都是按照指导方针和有关规定执行。
2.9。统计分析
所有结果都表示为±SEM。学生的t以及或单向方差分析统计分析是用来检测差异。值≤0.05被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。系统性Clodronate脂质体治疗促进CD11b的积累+Gr-1+纤维化肺和骨髓细胞与减少肺纤维化有关
土块脂肪一直以前用来动员骨骨髓来源的细胞进入循环;然而,这样的动员的效果在急性肺部炎症反应引起气管内的博来霉素以前没有报道。系统性的管理土块脂肪来动员骨髓细胞(即之前有一天。D−1)博来霉素挑战,分析了整个肺后5天博来霉素管理。作为一个控制对于任何非特异性脂质体的影响,在对照组小鼠注射空白脂质体(即。,脂肪)在同一时间。老鼠接受土块脂肪比例显著增强(即展出。CD11c,从2.9%到13.5%)−Gr-1+髓细胞在肺样本删除后第五天博来霉素挑战而Lipo-treated组(图1(一))。有趣的是,巨噬细胞的数量没有区别(CD11b+F4/80+),树突细胞(CD11b+CD11c+),CD3+t细胞,CD19+b细胞,γδt细胞或NKT细胞纤维化肺的两个治疗组(即。,脂肪和土块脂肪)(图1(一))。我们也观察到,大约65%的CD11c−Gr-1+髓细胞脂肪或土块也表示CD11b脂肪治疗,只有0.1%和3.2%的这些细胞表达F4/80 CD80,分别。
(一)
(b)
(c)
(d)
调查Gr-1的角色+髓细胞在肺纤维化组小鼠用土块治疗脂肪在D−1或(即后14天。,D + 14)博来霉素的挑战和全肺在博来霉素后21天样品进行了分析。土块脂肪治疗D−1明显组织学检查的数量明显减少(即。,trichrome staining) lung fibrosis when compared to Lipo-treated (D−1) mice at day 21 after bleomycin (Figure1 (b))。当土块脂肪在D + 14,肺纤维化也减少相比Lipo-treated (D−1)老鼠在博来霉素后21天,但在这组大于三色的染色观察D−1土块Lipo-treated组(图1 (b))。不过,两个笨蛋Lipo-treated组显著降低记录原骨胶原3、纤粘连蛋白的表达1博来霉素后21天在肺样本分析(图1 (c))。整个肺细胞因子分析表明,干扰素-没有差异γ和il - 4,有低水平的TGF -β、CCL22 CCL17但高( )水平的IL-13 D−1土块Lipo-treated组相比Lipo-treated组(图1 (d))。进一步的ELISA分析整个肺样本D + 14组干扰素-证明没有差异γ、il - 4、IL-13 TGF -β,或者CCL17但CCL22水平低这组相比Lipo-treated组(图1 (d))。在一起,这些数据表明,动员Gr-1的释放+骨髓髓系细胞用土块脂肪明显减毒bleomycin-induced肺纤维化。
3.2。Gr-1+髓细胞被雇来在决议阶段纤维化肺Bleomycin-Induced纤维化
时间进程分析Gr-1的存在+髓细胞在bleomycin-induced纤维化。博来霉素滴剂进入肺诱发炎症/早期纤维化阶段约14天,纤维化反应峰值阶段大约21天,,最后,决议阶段后42天博来霉素灌肠。如图2(一个),Gr-1+髓细胞没有出现在天真的老鼠的肺或老鼠后第14天博来霉素管理。然而,在天21和42博来霉素后,流仪分析表明Gr-1+髓细胞在整个肺样本,与这些细胞数量的峰值出现在天42(图2(一个)),大约22%的Gr-1+髓细胞也表达了F4/80和细胞的百分比表达CD80 < 6%(图2(一个))。这是这些Gr-1指出+细胞缺乏髓过氧化酶(MPO)和CXCR2表达式(数据未显示);都是成熟的中性粒细胞的标志。
(一)
(b)
(c)
(d)
进一步探索Gr-1的角色+髓细胞在bleomycin-induced纤维化,博来霉素后21天组老鼠在收到控制免疫球蛋白抗体或anti-Gr-1马伯和肺从这些团体在42天的老鼠进行了分析。消耗Gr-1+髓细胞以这种方式明显增强的程度trichrome-stained肺纤维化透露在分析部分(图2 (b))和成绩单原骨胶原3、纤粘连蛋白的表达(图12 (c)),这两个显著增加在anti-Gr-1 mAb-treated IgG-treated对照组小鼠相比。总的来说,这些数据表明Gr-1+CD11b+CD11c−来源于骨髓细胞被雇来的骨头纤维化肺,这些细胞促进纤维化的决议。
3.3。过继转移的Gr-1+髓细胞减少Bleomycin-Induced肺纤维化
进一步Gr-1表型+髓细胞动员纤维化肺、形态学和流量仪分析采用肺和骨marrow-purified这些细胞的数量与土块Lipo-treated老鼠(D−1)博来霉素后第五天。通过光学显微镜形态分析表明,这些细胞是由粒细胞和单核细胞(图的混合物3(一个)左面板)。如前所述,这些Gr-1+骨髓细胞为阴性MPO和CXCR2(数据没有显示)。流仪分析来源于CD11b的肺和骨的+Gr-1−和CD11b+Gr-1+人群表示,一个更高比例的后者细胞染色积极CD80、CD86, MHCII、CD62L(图3(一个)、中、右面板)。而发现F4/80 CD11b > 80%+Gr-1−CD11b髓细胞,大约20%+Gr-1+表达了这个巨噬细胞标记(图3(一个)、中、右面板)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
自CD11b Gr-1一般都是表达对癌症相关的骨髓抑制细胞(MDSC;(30.,38,39]),lung-purified Gr-1+髓细胞的土块脂肪——或者Lipo-treated博来霉素模型分析了博来霉素后第五天几个MDSC标记的表达。相比之下,Gr-1+髓细胞与小鼠仅接受博来霉素,脂肪治疗没有效果的转录表达MDSC标记如精氨酸酶、一氧化氮synthase-2 (NOS2),吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)和il - 10,但所有这些标记在Gr-1显著降低+髓细胞从土块Lipo-treated老鼠(图3 (b))。这些数据表明,无论是单独脂肪还是土块治疗脂肪动员成熟中性粒细胞从骨髓或MDSC本身。这些发现还表明,在活的有机体内土块脂肪治疗Gr-1表型的改变+髓细胞相比,相同的骨髓细胞纯化Lipo-treated老鼠。
阐明Gr-1是否+髓细胞在保护关键组件和/或纤维化,纯化Gr-1+髓细胞从肺的土块Lipo-treated bleomycin-challenged老鼠在第五天通过口咽滴剂过继转移到其他组小鼠的肺在博来霉素后第五天或14。组织学分析整个肺从这些老鼠透露,这些细胞的过继转移在第五天或14导致显著降低肺纤维化的程度与未经处理的bleomycin-challenged肺(图21天3 (c),中间,和左面板),大大降低了原骨胶原3、纤粘连蛋白的表达在肺纤维化(图1成绩单3 (d))。此外,没有水平的差异干扰素-γ、il - 4和IL-13但低水平的TGF -β、CCL22 CCL17肺样本中发现了老鼠收到Gr-1+髓细胞和那些没有(图3 (e))。因此,这些结果表明,动员骨骨髓来源Gr-1+髓细胞不同于MDSC和在解决bleomycin-induced肺纤维化中发挥作用。
3.4。的Coculture Gr-1+髓细胞原发性肺成纤维细胞纤维母细胞纤连蛋白1的表达减少,胶原1,原骨胶原3,TGF -β
因为Gr-1存在的增加+髓细胞有显著影响ECM蛋白质如胶原3、纤粘连蛋白的表达1和profibrotic中介,TGF-β,我们假设这些细胞可能抑制myofibroblast ECM的一代。为了验证这个假设,纯化Gr-1+髓细胞与鼠标cocultured Gr-1主肺成纤维细胞(+:成纤维细胞的比例1:5)24 h。在成纤维细胞胶原蛋白表达随后可视化使用共焦显微镜。Gr-1的存在+Gr-1时从Lipo-treated小鼠骨髓细胞减少+髓细胞从土块Lipo-treated老鼠废除在成纤维细胞胶原染色(图4(一))。此外,定量PCR分析表明cocultured Gr-1+髓细胞纤连蛋白1的转录表达减少,胶原1,原骨胶原3,TGF -β在更大程度上成纤维细胞髓细胞来自土块Lipo-treated而不是Lipo-treated老鼠(图4 (b))。然而,当Gr-1+骨髓细胞的脂肪——但不是笨蛋Lipo-treated老鼠cocultured IL-13面前,有一个显著增加纤连蛋白1和减少胶原蛋白3和TGF -β在成纤维细胞(图表达4 (b))。在一起,这些结果表明,Gr-1+髓细胞可能通过直接抑制解决肺纤维化对激活肺成纤维细胞的影响。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
为了进一步描述Gr-1的抑制作用+髓细胞在肺成纤维细胞,RNA分析从lung-purified Gr-1+骨髓细胞脂肪和土块Lipo-treated老鼠在博来霉素后第五天,和凋亡诱导因素决定的表达。虽然没有显著差异的表达granzyme或穿孔素,TRAIL的表达有显著增加的髓细胞来源于土块Lipo-treated Gr-1相比+从Lipo-treated小鼠骨髓细胞(图4 (c))。这些记录数据符合流仪数据表明CD11b的百分比+Gr-1+小道+髓细胞是高土块Lipo-treated肺与Lipo-treated相比肺后21天在博来霉素(5.77%和2.69%,分别地;图4 (d))。因此,这些数据表明Gr-1+髓细胞可能在TRAIL-dependent方式抑制成纤维细胞活性。因此,额外的在体外实验进行中,鼠标主肺成纤维细胞暴露在重组sTRAIL(0、0.01、0.1、1或10 ng / ml) 24 h后,记录分析TGF -β3,原骨胶原及胶原进行。如图4 (e),有一个明显的剂量依赖性降低TGF -β3,原骨胶原及胶原表达TRAIL治疗原发性小鼠成纤维细胞的反应。因此,这些结果表明Gr-1+髓细胞可能通过TRAIL-dependent解决bleomycin-induced纤维化机制。
3.5。轨迹表达式是调节在解决Bleomycin-Induced纤维化
进一步描述角色bleomycin-induced纤维化的小道,小道在小鼠的肺部蛋白表达决心天0,14日,21日,博来霉素后42个政府。TRAIL蛋白水平显著降低在21但这种蛋白质标准化(类似于水平观察到天0)后42天博来霉素(图5(一个)期间),这表明TRAIL表达调节的分辨率bleomycin-induced纤维化。此外,与增加Gr-1一致+骨髓细胞招聘进入肺部,这是观察到土块脂肪预处理(D−1)之前,博来霉素管理整个肺TRAIL蛋白表达明显增加脂肪相比,预处理小鼠(图5 (b))。此外,当老鼠对待anti-Gr-1马伯21天,小道mRNA表达在42天明显下降而IgG-treated组(图5 (c)左面板)。此外,转录水平的酶类6,小道抑制剂(40),显著增加小鼠的肺中对待anti-Gr-1马伯相比IgG-treated组(图5 (c)右面板)。口咽Gr-1的滴注法+博来霉素后髓细胞在5天或14挑战TRAIL蛋白表达增加受体小鼠的肺博来霉素后21天(图5 (d))。最后,anti-TRAIL马伯治疗(通过腹腔注射)从天14到21岁后博来霉素滴剂显著增加胶原1及胶原3的表达与免疫球蛋白的对照组相比,肺(图5 (e))。因此,这些结果进一步表明,Gr-1+小道+髓细胞促进bleomycin-induced肺纤维化的决议。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。等离子体浓度增加在IPF患者
虽然这些结果表明轨迹的一个重要的角色+骨髓细胞实验bleomycin-induced肺纤维化的决议,目前尚不清楚这些发现临床纤维化肺病有任何关系。因此,nondiseased控制和IPF肺组织,等离子体,主要人类成纤维细胞筛选痕迹的存在。组织学分析总结表1,表明位移植TRAIL蛋白表达高于正常肺组织与IPF肺活检(数字6(一)和6 (b)、职责)。TRAIL-R2或DR5表达在肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞在正常肺部分(图6 (c)),而在IPF肺部分,有焦DR5染色vascular-rich地区和一些分散染色在间质(图6 (d))。此外,正常的肺部分包含许多CD33+细胞,但几乎没有这些髓细胞在IPF肺部分数据6 (e)和6 (f))。有统计上显著的增加的浓度sTRAIL等离子体从IPF患者(图6 (g))。事实上,小道升高,但其受体表达下调基因表达数据集从IPF肺活检和外植体相对于正常肺外植体(数字S1一个和S1B,职责)。此外,被大量表达TRAIL受体microdissected增生的上皮细胞相邻成纤维细胞的焦点(图S2但不是在成纤维细胞的疫源地(图S2B)相对于正常肺nondiseased地区。最后,基因表达阵列BAL细胞从两个不同的群IPF患者显示跟踪记录的损失表达相对正常供者BAL(数字S3一个和S3B)。小路和DR5转录表达在很大程度上是缺席主IPF成纤维细胞与主正常成纤维细胞(图6 (h))。跟踪和DR5的损失的一种解释IPF成纤维细胞可能与IL-13-enriched环境从它们派生37]。的确,TRAIL及其受体的表达在正常的肺成纤维细胞暴露于强烈降低IL-13 24 h(图6 (h))。在一起,这些发现表明,尽管在IPF小道以可溶性形式存在,缺乏线索+髓细胞在IPF肺样本和IPF成纤维细胞缺乏DR5的表达,推测,部分IL-13的抑制效应。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
4所示。讨论
目前的研究解决了一个新颖的机制bleomycin-induced肺纤维化是鼠标解决。Bleomycin-induced肺损伤被广泛用于探索antifibrotic治疗尽管老鼠生存一个肺内的博来霉素挑战通常解决的大多数的纤维化(41]。我们解决机制导致纤维化的分辨率在这个模型中通过探索骨骨髓来源Gr-1的存在和作用+骨髓细胞。评估骨髓衍生Gr-1的角色+髓细胞在肺纤维化,clodronate-loaded脂质体被腹腔注射到老鼠。腹腔内的土块脂肪之前已经观察到耗尽骨髓、脾脏、肝脏、血液、淋巴结、腹膜巨噬细胞和树突细胞(http://clodronateliposomes.org/)。在我们的研究中,我们利用脂质体剂量的0.1毫升/ 20克的体重,这是大约一半的制造商推荐的剂量减少巨噬细胞和树突细胞。这个剂量,没有改变lung-associated F4/80+巨噬细胞或CD11b+CD11c+细胞;然而,有一个重要的海拔Gr-1+CD11c−髓细胞在肺部的土块Lipo-treated组。鉴于clodronate在耗尽巨噬细胞的作用,我们假设Gr-1升高+土块细胞治疗脂肪组织巨噬细胞消耗的结果。事实上,CD11c+在小鼠骨髓细胞耗竭导致动员和增加肺的Ly6G(也与anti-Gr-1检测抗体的标记)表达细胞在小鼠42]。这些结果表明,巨噬细胞和树突细胞通过土块消耗脂肪治疗在我们的模型中可能引起骨髓动员和增加肺招聘居民Gr-1+细胞。
使用clodronate liposome-based、免疫抗体和细胞过继转移方法,我们观察到Gr-1+髓细胞产生了显著影响肺纤维化的决议。这些细胞通过TRAIL-dependent肺纤维化机制解决了在体外和在活的有机体内。小径出现在IPF等离子体和活检,成绩单高架在IPF肺活检和外植体但迷失在IPF BAL细胞;然而,记录其主要受体表达下调IPF肺活检和外植体和蛋白质含量的主要受体,DR5,很大程度上是缺席IPF活检和初级IPF成纤维细胞。最后,IL-13对DR5的表达有抑制作用主要通过正常的人类成纤维细胞。综上所述,TRAIL-mediated解决实验性肺纤维化是一个有吸引力的治疗方法在临床肺纤维化疾病,需要进一步调查。
硫酸不致命的剂量的博来霉素通常诱导早期肺部炎症反应,周围的山峰后第一周的挑战,这是紧随其后的是纤维化阶段,峰值约21天(43]。纤维化不坚持在这个模型中,主要解决这个病理特性通常是观察博来霉素后42天左右的挑战。我们推测,一个骨骨髓来源的细胞可能参与这项决议过程和最初clodronate脂质体探索这一假设。Clodronate最近显示诱导骨marrow-resident巨噬细胞的凋亡从而导致释放造血和骨髓的间充质干细胞(32,33]。以来这是我们感兴趣的其他先前的报告表明,方法导致的动员骨髓细胞(包括但不限于造血干细胞、内皮细胞、上皮细胞祖细胞)减少bleomycin-induced肺纤维化(20.,21,44而消融的骨髓细胞增加了纤维对博来霉素对小鼠(18]。此外,骨骨髓来源间充质干细胞已被证明对博来霉素和autoimmune-induced发挥保护作用小鼠肺纤维化(18,25]。在目前的研究中,Gr-1+骨髓细胞识别不匹配的解决bleomycin-challenged肺成熟中性粒细胞或MDSCs的形象。MDSCs强有力的免疫调节特性由于其表达和精氨酸酶的活性,NOS2,被罩,NADPH, il - 10,前列腺素(29日,30.,38,39,45,46]。博来霉素模型,脂质体治疗动员MDSCs, Gr-1+细胞纯化的土块Lipo-treated bleomycin-challenged老鼠表现出的精氨酸酶显著更少,NOS2,我和il - 10表达相同的细胞纯化Lipo-treated相比,bleomycin-challenged老鼠。有更多Gr-1+髓细胞在肺纤维化的土块Lipo-treated与Lipo-treated老鼠相比,我们假设是由于这些细胞的浓缩前者由于Gr-1的损失+F4/80+人口。形态,这些土块Lipo-treated Gr-1+细胞与骨髓髓系细胞最接近人口的髓细胞据报道被招募进LPS-challenged哮喘小鼠的肺29日]。然而,进一步的研究来证实这些细胞的身份是必需的。因此,骨髓是独特的髓细胞的来源与antifibrotic和组织修复的属性。
Gr-1的方式+细胞减毒bleomycin-induced肺纤维化是当前研究的主要焦点。而profibrotic细胞因子和趋化因子水平的变化,如IL-13 [47],CCL17, CCL22 [43)观察小鼠的肺中对待土块脂肪或与Gr-1过继转移+细胞,这些变化不一致之间的土块Lipo-treated团体和/或没有达到统计学意义。然而,当老鼠对待土块纯化Gr-1脂肪或接收+细胞,有一个一致的减少ECM的表达蛋白在肺纤维化的暗示Gr-1+细胞可能抑制myofibroblast激活和ECM蛋白表达。这是确认在体外由coculturing纯化土块脂肪诱导Gr-1+原发性肺成纤维细胞的细胞。在这些研究中,我们利用一个Gr-1+细胞的纤维母细胞比率1:5。尽管低Gr-1的相对数量+髓细胞在coculture研究中,我们观察到Gr-1+细胞抑制胶原蛋白的表达和其他ECM标记,如纤连蛋白原骨胶原,TGF -β培养的成纤维细胞。这些coculture实验也表明Gr-1+死细胞促进和/或抑制培养的成纤维细胞的可行性。可能这些影响可能更突出的髓细胞,和未来的研究是必要的,以便更好地描述这些Gr-1的影响+肺成纤维细胞的细胞。
在一个正常的伤口愈合反应,抑制纤维化通常是通过myofibroblast细胞凋亡的诱导48]。已知细胞的膜相关分子调查proapoptotic因素显示,小道Gr-1上突出的表现了+骨髓细胞群。小道的凋亡细胞死亡是一个著名的中介所表达的许多骨骨髓来源的细胞包括中性粒细胞(49]。最近的证据表明,TRAIL-induced凋亡参与减少bleomycin-induced肺纤维化就是明证TUNEL显著下降+细胞在肺部−−/老鼠与跟踪+ / +老鼠在博来霉素后23天的挑战[15]。此外,这种蛋白质最近扮演一个重要角色在肝纤维化和肝硬化的改良的决议50- - - - - -54]。这里,最大的小道信使rna和蛋白质水平检测在肺癌样本决议在本博来霉素模型阶段,一个阶段,成熟的中性粒细胞通常缺席肺。这种变化轨迹水平与Gr-1招聘的增加有关+髓细胞进入肺纤维化,达到峰值后42天博来霉素滴剂,这表明这些细胞可能是肺纤维化的小道的主要来源。有趣的是,在酶类的表达有显著增加,小道抑制剂(40),小鼠接受anti-Gr-1马伯之前博来霉素表明除了proapoptotic受体的表达,Gr-1+髓细胞也可能下调抑制剂在博来霉素诱导纤维化的决议。
分析人血浆、肺组织和主要的成纤维细胞显示,我们的实验结果可能有重要的治疗效用在诊所。虽然我们的等离子体数据不同于血清由麦格拉思等生成的数据。15]在小道浓度观察到明显降低血清IPF患者与正常人相比,这两项研究的结果表明,可能有一个缺乏跟踪和TRAIL-mediated IPF患者肺部的影响。这是支持的报告研究TRAIL及其受体的表达在正常和IPF肺,TRAIL蛋白和其受体表达的上皮细胞相邻成纤维细胞的焦点,在较小程度上,在成纤维细胞的疫源地;但是,与增生的上皮细胞,成纤维细胞在凋亡诱导p53蛋白的焦点都没有(55]。
成纤维细胞的缺乏响应轨迹可能会由于缺少小道配体(由于减少表现和/或骨髓细胞招聘进入肺部,揭示了降低CD33的细胞),TRAIL受体的内化,提高IPF IL-13或其他内在差异和正常的肺成纤维细胞。我们的研究结果表明,这些影响可能在玩的组合。基底,正常但不IPF肺成纤维细胞表达充分的小径和DR5成绩单和敏感TRAIL-mediated细胞凋亡。此外,使用IL13刺激明显减少了蛋白质在正常肺成纤维细胞。尽管使用IL13受体的表达升高,IL13Rα1,IL13Rα2,IPF相对于正常的肺成纤维细胞(37)、转录组分析建议使用IL13在IPF并不表示肺纤维母细胞文化(没有显示)。总的来说,这些结果表明,缺乏跟踪和DR5表达IPF肺成纤维细胞可能是由于其他机制除了使用IL13信号。事实上,在我们实验室实验数据表明,抵抗TRAIL-mediated IPF肺成纤维细胞凋亡可能在一定程度上是由于这些细胞的衰老状态(数据没有显示)。然而,考虑到有一个使用IL13刺激对TRAIL及其受体的表达,DR5 nondiseased成纤维细胞,使用IL13 mRNA的表达升高IPF相对于正常肺(56),针对IL-13信号可能有助于提高肺成纤维细胞的一个子集小道IPF患者的影响。
总之,我们证明Gr-1+小道+髓细胞促进实验性肺纤维化的决议。临床上针对TRAIL-resistant癌细胞已经有问题的,因为这些细胞表达多种凋亡抑制剂和prosurvival信号如c-FLIP和PI3K / Akt途径激活。不幸的是,IPF myofibroblasts表达这些因素和异常路径(9- - - - - -11]。基于目前的研究,仍然是一个有吸引力的治疗目标在IPF战略确定后,进行宣传myofibroblasts TRAIL-induced抑制效果。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
安娜Paula Moreira, David m . Habiel Ugur b Ismailoglu这项研究同样起到了推波助澜的作用。
补充材料
补充1。图S1:表达凋亡介质在IPF诊断肺活检和晚期IPF肺外植体。公开的基因表达数据集(GSE24206)开采从NCBI的地理数据的数据库。基因表达值提取IPF肺活检与正常肺(左)和IPF肺移植组织与正常肺(右)使用NCBI的Geo2R基因表达分析工具,和表达数据上载到独创性音标。显示是独创性的修改版本的规范化途径凋亡,覆盖与GSE24206基因表达(底部)和褶皱变化值(顶部)。Red-upregulated≥1.5倍和成绩单值≤0.05;green-downregulated≥1.5倍和成绩单值≤0.05。
补充2。图S2:表达凋亡介质在microdissected IPF上皮细胞和成纤维细胞的焦点。公开的基因表达数据集(GSE35309)开采从NCBI的地理数据的数据库。为增生的上皮细胞基因表达值提取相邻成纤维细胞的病灶与正常组织(左)和成纤维细胞的病灶与正常肺组织(右)使用NCBI的Geo2R基因表达分析工具,和表达数据上载到独创性音标。显示是独创性的修改版本的规范化途径凋亡,覆盖与GSE35309基因表达(底部)和褶皱变化值(顶部)。Red-upregulated≥1.5倍和成绩单值≤0.05;green-downregulated≥1.5倍和成绩单值≤0.05。
补充3。图S3: IPF BAL细胞凋亡的表达介质。公开的基因表达数据集(GSE70867)开采从NCBI的地理数据的数据库。基因表达值提取IPF BAL锡耶纳队列(A)和弗莱堡组(B)与正常供者BAL使用NCBI的Geo2R基因表达分析工具,和表达数据上载到独创性音标。显示是独创性的修改版本的规范化途径凋亡,覆盖与GSE70867基因表达(底部)和褶皱变化值(顶部)。Red-upregulated≥1.5倍和成绩单值≤0.05;green-downregulated≥1.5倍和成绩单值≤0.05。