文摘

背景。炎症是最重要的发病机制之一,血栓闭塞性脉管炎(道)。的NLRP3 inflammasome起着至关重要的作用在身体的免疫反应和疾病发展。它可以被各种各样的病原体激活或危险信号。炎症反应的核心,NLRP3 inflammasome可能提供一个新的目标治疗各种炎症。Levistilide (LA)是一个四氯苯酞二聚物隔绝伞状花科的植物。其药理作用主要是未知的。本研究揭示了LA对内皮细胞活化的影响,NLRP3, il - 1β肿瘤坏死因子-α、IL-32 CCL-2、VCAM-1 MCP-1,脾酪氨酸激酶(麦克米兰)——p38 /物信号轴及其对血管炎大鼠的影响。结果。抑制内皮细胞激活和il - 1的表达β肿瘤坏死因子-α,CCL-2 IL-32 VCAM-1, MCP-1。洛杉矶直接阻碍麦克米兰磷酸化存在剂量依赖的相关性和活动方式,抑制了人们的活动和物,减少NLRP3人类脐静脉内皮细胞的表达与血管炎和维管组织的老鼠。结论。LA抑制NLRP3基因表达通过阻断麦克米兰,p38 /物途径和减少破坏老鼠的肢体血栓闭塞性脉管炎模型。

1。介绍

血管炎是一种炎症细胞浸润血管壁,血管,伴随着血管损伤,纤维素沉积、纤维化,内皮细胞和肌细胞坏死。血管炎的特点是系统性炎症和内皮损伤(1]。内皮细胞激活和损伤发病机制的基础。内皮细胞激活和伤害增加内皮细胞粘附的表达和引起凝血内皮切换表现型。血栓闭塞性脉管炎(道)或血栓闭塞性脉管炎(BD)血栓性闭塞的,nonatherosclerotic节段性炎性疾病,导致中小血管缺血肢体的末端。道是由高度单核细胞表现为节段性血栓性遮挡血栓。内皮功能障碍可能在BD(发挥着至关重要的作用2]。BD患者有能力减少endothelium-dependent血管舒张和更高水平的一些循环炎症标记物,如白细胞、c反应蛋白、细胞间粘附molecule-1 [3]。

Levistilide (LA)(图1(一))是一个四氯苯酞二聚物隔绝当归chuanxiong和当归,他们都属于伞形科草本植物家族(4- - - - - -7]。这些草药经常使用在东方传统药用公式,如Danggui-Shaoyao-San (DSS)。目前,洛杉矶研究很少有报道。LA抑制PDGF-BB-activated肝星状细胞增殖;机制可能涉及细胞周期抑制和细胞凋亡机制。拉可能是一个潜在的antifibrotic药物对肝纤维化的治疗和预防8]。洛杉矶也可以诱导结肠癌细胞凋亡通过活性氧(ROS)调解的内质网(ER)应力路径(9]。他口头等人管理LA老鼠和测量一些主要药代动力学参数;消除的速度是0.183±0.02 h⁻¹,吸收的速度是0.781±0.08 h⁻¹的速度分布是0.815±0.06 h⁻¹,是3.789±0.38 h,是0.857±0.09 h,是0.5±0.05 h,是1149.2±103.43 ng / mL (10]。

熊等人证明,洛杉矶是一个消炎小金县日隆药片质量标记(11];熊等人的论文可能是唯一的报告描述了洛杉矶的抗炎作用有关。然而,关于洛杉矶的抗炎生物机制的研究尚未报道。蔡等人发现川芎内酯可以减弱血管炎症(12]。洛杉矶是一个二聚体川芎内酯;可以推测,洛杉矶和血管炎之间可能存在某种联系。本研究的目的是探索的抗炎作用,其生物机制,拉上道的影响。

2。材料和方法

实验分为两个部分,一个在体外实验对人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)和一个在活的有机体内实验老鼠。

2.1。材料

所有化学品都购买商业来源。HUVECs (crl - 1730)写明ATCC买来(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。洛杉矶(纯标准)是购自上海道易生物科技有限公司(上海,中国)。单克隆鼠标anti-GAPDH(甘油醛3 -磷酸脱氢酶)和辣根过氧化物酶,(合)共轭抗体(KC-5G5)从康晨购买生物科技有限公司(上海,中国)。p-Syk (Tyr535/526), ERK(4695年代),p-ERK(4370年代),p38(8690年代),p-p38(4511年代)、物(9258年代),p-JNK(4668年代)和il - 1β(12703年代)抗体购自细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。反人类的pro-IL-18 (M156-3)和地震(D043-3)抗体购自医疗和生物实验室(日本名古屋)。麦克米兰酶系统(V3801)和ADP-Glo激酶试验(V9101)从Promega购买(WI麦迪逊,美国)。人类pro-IL-1β(MAB6964-SP)抗体购自研发系统(明尼阿波利斯,美国)。高容量cDNA逆转录工具包,Lipofectamine 2000和试剂盒试剂购自生命技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。一个增强化学发光(ECL)止动剂西方化学发光合衬底(WBKLS0500)购买的微孔(美国MAS Billerica)。物抑制剂(SP600125)和p38抑制剂(SB203580)从Selleck购买化学品(美国休斯顿,德克萨斯州)。

钠月桂酸盐是化学试剂购自国药控股有限公司有限公司(产品编号:30168127;中国上海)。医疗胶水购买从广州白云医用胶粘剂有限公司有限公司(广州)。

2.2。在体外实验

2.2.1。细胞培养

HUVEC和HKE293细胞维持在37°C公司5%₂杜尔贝科修改鹰的介质中含10%胎牛血清。每2天中被改变,细胞与trypsin-EDTA通道。在段落4 - 8细胞用于研究。

2.2.2。单核细胞粘附实验

单核细胞U937细胞生长在罗斯威尔公园纪念研究所1640中含10%胎牛血清。附着力化验,HUVECs融合在6-well组织培养板,后100 ng / mL的脂多糖(LPS)添加一个额外的16 h诱导VCAM-1的表达,在洛杉矶的存在与否(0、5、25、50和100μmol / L)。控制,单层细胞处理鼠标反人类的单克隆抗体对VCAM-1 (E1/6)。通过添加1毫升的附着力进行了化验集中U937细胞(密度为10⁶细胞/毫升)每个单层旋转条件下(63 rpm) 21°C和孵化了10分钟。不依从细胞后被轻轻洗3次磷酸盐,贴壁细胞6-well板块和1%多聚甲醛固定。贴壁细胞的数量是通过计算6个不同领域使用目镜网格和20 x的目标。字段计算附着在half-radius U937细胞被随机选择距离的中心层。数量在三个独立的实验。

2.2.3。体外麦克米兰活动分析

麦克米兰活动测量根据制造商的协议(美国Promega)。简而言之,麦克米兰(100 ng /μ底物(0.2 L)μ克/μL)、三磷酸腺苷(ATP) (10μ0.05 mol / L),以及洛杉矶(-50000 nmol / L)被稀释在激酶缓冲区,和5μL的抑制剂,10μL一种酶,10μL衬底/ ATP的混合物被添加到每个96孔板。在室温下孵化后60分钟,25岁μL(二磷酸腺苷(ADP)如果™试剂添加到每个好,其次是在室温下孵化了40分钟。最后,10μL激酶检测试剂添加到每个好,其次是在室温下孵化了30分钟。化学发光信号(积分时间:1 s)记录使用Varioskan Flash微型板块分光光度计(美国热科学)。

2.2.4。RNA分离和定量聚合酶链反应

从细胞中提取总RNA表达载体试剂盒试剂(生命技术)根据制造商的协议。第一链互补dna(互补)使用高容量cDNA逆转录合成工具(技术)。获得cDNA混合Maxima SYBR绿色定量聚合酶链反应(qPCR)主(技术)和混合gene-specific引物(上海Generay生物技术,中国)。引物的序列如表所示1。QPCR使用7500执行快速实时PCR系统(美国应用生物系统公司)根据制造商的指示。放大条件由最初15分钟变性步骤在95°C,紧随其后的是40变性的周期为15秒95°C, 30年代退火在55°C, 72°C伸长30年代。解离曲线进行了分析,以确保一个单一PCR的扩增产物。三个独立为每个引物进行了分析。的cDNA计算每个样本的标准曲线。归一化后的相对表达了GAPDH基因表达的。

2.2.5。免疫印迹

细胞细胞溶解在冰冷的radioimmunoprecipitation分析缓冲区(50更易与L三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值8.0,150更易/ L氯化钠,2更易/ L原钒酸钠,1%诺乃清洁剂p 40,钠脱氧胆酸盐1%,十二烷基硫酸钠0.1%,0.1 L更易与二硫苏糖醇,更易与0.05 L phenylmethylsulfonyl氟化物,0.002毫克/毫升aprotimin,和0.002毫克/毫升亮抑酶肽)和用使用JY92-2D超声均质器(浙江宁波Scientz生物技术,中国)。溶菌产物在12000×g事先批准通过离心10分钟在4°C。整除的细胞溶解产物(50或100年μg的每个样本)解决在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和涂抹到硝化纤维膜笼罩在中国,上海,中国。5%脱脂牛奶的膜被一夜之间在4°C。其次是孵化主要抗体2 h和暴露于辣根peroxidase-conjugated二级抗体在室温下1 h。可视化进行了使用ECL止动剂西方化学发光合衬底(微孔)。膜被暴露在一个高性能autoradiographic电影(富士胶片、东京、日本)和可视化使用ECL止动剂西方化学发光底物合(WBKLS0500;微孔)。使用一个软件数量进行定量分析。免疫印迹实验至少进行三次。

2.3。在活的有机体内实验

2.3.1。动物伦理语句和动物

动物保健符合指导实验室动物保健和使用的由美国国家卫生研究院出版。本研究的动物实验动物伦理委员会批准上海中医药大学(批准号SZY201602004)。

雄性Wistar鼠买来重要河流实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京)。老鼠被安置在笼子里每笼(3)保持在恒定的温度和湿度(65%±5%)(24°C±1°C) 12小时的光暗周期。老鼠被允许随意访问自来水和食品在整个实验协议。36个雄性Wistar鼠随机分成四组(9老鼠在每个):对照组、阳性对照组(月桂酸钠注入到下肢的股动脉道模型),阴性对照组(生理盐水注入到下肢的股动脉),和陶拉组。老鼠在道与LA LA组治疗16天(20毫克/公斤/天,2天前手术,手术后2周)。相比之下,老鼠在对照组,阳性对照组和阴性对照组仅考虑到辅助CMC-Na (0.30%)。两周后手术,老鼠使用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉的剂量45毫克/公斤。血从腹主动脉,血清分离;右下肢动脉被隔离,然后储存在−80°C。

2.3.2。鼠道模型

在手术之前,基线血液流动是通过激光散斑测量flowmetry PeriCam PSI系统(Perimed AB,斯德哥尔摩,瑞典)。腹腔内注射3%戊巴比妥钠(45毫克/公斤)是管理麻醉每个老鼠;每个注入老鼠被固定在盘子里。右腹股沟作为手术的位置,与碘载体剃和消毒。腹股沟的中点是切入大约1.5厘米,皮下组织和肌肉组织都直言不讳地解剖,暴露股动脉。动脉夹是用来阻止血液流动的近心端分离的表面部分腹部动脉(约0.5厘米),和10毫克/毫升钠月桂酸盐0.2毫升注射到远端方向(13- - - - - -15];此外,医疗胶用于关闭穿刺点。接下来,动脉夹开放手术后1分钟,确认没有出血后,缝合在应用于皮肤。相同的手术方法是用于负对照组,但0.2毫升的生理盐水注射代替钠月桂酸盐。手术后,老鼠放在热垫10分钟恢复体温。手术证实了利用激光散斑的影响flowmetry手术后30分钟。血流监测2,5,8,11和14天。

2.3.3。酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)进行使用鼠il - 1β酶联免疫试剂盒(RLB00、研发系统、美国),大鼠白细胞介素- 6 (ERC003.96 Xinbosheng生物科技有限公司,深圳,中国),和c反应蛋白(CRP) ELISA测定包(H126、南京建成生物工程研究所、南京、中国);所有包都使用根据制造商的指示。

2.4。统计分析

数据分析使用GraphPad棱镜5、SPSS 15.0软件。一个配对以及用于比较两组,单向方差分析被用于组内比较。数据表示为 偏差(SD) 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。体外结果

要测试的抗炎作用,采用实时qPCR检测的信使核糖核酸(mRNA)表达不同的促炎基因。HUVECs使用LPS刺激后6 h, il - 1的mRNA表达β肿瘤坏死因子-α,IL-32β,CCL-2 MCP-1和VCAM-1增加了1.13 - 1.83倍与对照组相比。然而,预处理(50μmol / L) 1小时前LPS刺激几乎完全封锁了增强mRNA表达接近或低于基线(图1 (b))。洛杉矶在单核细胞粘附的影响内皮细胞由VCAM-1检查。提出了图1 (c)孵化后,HUVECs有限合伙人(16 h)、附着U937单核细胞显著增加到74.0±3.9细胞/毫米²几乎完全被治疗,用鼠标反人类的单克隆抗体E1/6 VCAM-1。与各种剂量的预处理(5 - 100μmol / L)抑制U937单核细胞粘附在剂量依赖性的方式。单核细胞粘附HUVECs显著降低了LA治疗后从34.5±6.4细胞/毫米²(5μmol / L, ),20.0±2.8细胞/毫米²(100μmol / L, )。

接下来,LA麦克米兰活动检测的影响。结果显示,LPS诱导麦克米兰磷酸化和nonphosphorylated麦克米兰损耗,而增加剂量的LA抑制麦克米兰磷酸化(图2(一个))。为了确认是否LA介导增殖蛋白激酶(MAPK)通路,ERK的活化,p38和物被免疫印迹检测。结果表明,LA抑制激活p38和物LPS-stimulated HUVECs。与LPS组磷酸化水平的p38和物在洛杉矶进行预处理细胞减少了1.74和4.36倍,分别(图2 (b))。直接测试拉是否阻塞麦克米兰活动,麦克米兰激酶分析工具被用来确定拉的抑制效果;结果显示,洛杉矶剂量依赖性抑制麦克米兰活动方式的EC50值0.129μmol / L(图2 (c))。

观察的影响拉上NLRP3(麦克米兰的下游基因,NLRP3的表达是通过rt - pcr检测的。HUVEC细胞被LPS刺激后6 h, NLRP3 mRNA表达的对照组相比增加了1.33倍。然而,预处理前拉1 h LPS刺激NLRP3的表达低于对照组的0.84倍。结果表明,洛杉矶可以下调NLRP3基因表达(图3(一个))。的NLRP3 inflammasome负责成熟il - 1的表达β和地震。西方墨点法用于阐明拉的作用LPS-induced il - 1β和释放的地震。结果表明,LA大大阻止了LPS-induced upregulation il - 1β和地震与治疗相比,有限合伙人。这种效果是类似物和p38抑制剂(数字3 (b)和3 (c))。这些结果表明,拉的促销可能会减少NLRP3 inflammasome抑制炎症。

3.2。体内的结果

与月桂酸钠注射后,不同程度的缺血性坏死发生在右下肢阳性对照组的老鼠和道+ LA组(图4(一))。根据血管炎模型评分标准(16),阳性对照组的得分显著高于道+ LA组术后2周(图4 (b))。然后,激光散斑flowmetry被用来确定的下肢的血液流动在每组大鼠。阴性对照组的血流量高于阳性对照组和t + LA组手术后30分钟。道+ LA组治疗intragastrically手术前2天;道+ LA组的血流量高于阳性对照组。正确的腿部的血液流动负对照组手术后2周内恢复正常,而道的血流在正确的腿+ LA组和阳性对照组低于对照组,血流量和强度在道+ LA组高于阳性对照组(图4 (c))。手术后两周,右下肢肌肉的每组检查用苏木精和伊红染色(他)。肌肉炎症坏死的程度正对照组明显高于t + LA组(图4 (d))。

炎性细胞因子的水平通过ELISA检测。血清il - 1β、il - 6、CRP的阳性对照组高于对照组和阴性对照组。与阳性对照组相比,血清il - 1β、il - 6、CRP水平明显降低在道+ LA组大鼠(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。洛杉矶的表达减少NLRP3在老鼠的下肢动脉(图5 (d))。

4所示。讨论

刘等人提出,炎症和免疫系统扮演中心角色在TAO发病机理17]。有限合伙人是革兰氏阴性细菌的一个组成部分,参与了大量的促炎基因的转录。有限合伙人是一种常用的刺激炎症模型和通常用于在体外道的机制研究18,19]。toll样受体4 (TLR4)由LPS激活。TLR4可以诱导促炎介质的生产;TLR4的这种效应可以应用于消除细菌。CD14转移有限合伙人TLR4 / MD-2复杂,使二聚和触发MyD88——TRIF-dependent促炎细胞因子和I型干扰素的生产20.]。LPS-activated TRL4激活NFkappaB通路和所有三个MAPK通路(ERK、物/ SAPK和p38)。有限合伙人也刺激NLRP3 inflammasomes,最NLR分子,导致成熟的释放il - 1β和地震21]。

研究显示,洛杉矶直接抑制麦克米兰活动和麦克米兰磷酸化。麦克米兰在适应性免疫受体信号传导中扮演着关键角色,许多生物过程,包括细胞粘附,先天免疫识别、破骨细胞的成熟,血小板活化,血管发展22]。麦克米兰活动是由有限合伙人,TNF -α、il - 1、凝血酶、C-response蛋白质,最低限度氧化低密度脂蛋白,和高葡萄糖水平23- - - - - -29日]。暂时性的招募是一个复杂的包含MyD88, TLR4, IRAK-1 LPS刺激和电离(24]。值得注意的是,TLR4酪氨酸磷酸化恰逢早期的动力学波麦克米兰酪氨酸磷酸化。麦克米兰也与MyD88适配器蛋白质所需的细胞因子的生产途径(30.]。大量研究表明,Syk-mediated增殖蛋白激酶在炎症基因的表达发挥至关重要的作用[31日- - - - - -33]。麦克米兰介导NLRP3 inflammasome激活(34- - - - - -36]。因此,可以推断通过抑制麦克米兰的磷酸化,LA抑制p38 /物的活性,减少NLRP3的表达和分泌il - 1相关的蛋白质β和地震(图6)。

道是一种罕见的病因不明的疾病,尽管它发现一个多世纪以前,几乎没有取得任何进展在决定其机制和适当的治疗。在thrombohemorrhagic血管炎模型中,老鼠血管壁麦克米兰酪氨酸激酶信号通路被触发。这导致中性粒细胞弹性蛋白酶释放,导致出血,纤维蛋白沉积,血栓形成(37]。太阳和他的同事们从遗传和免疫反应性的角度提出潜在机制为其初始和显示,道的发病机理是由于一种基因多态性导致免疫炎症性血管炎,这是高度与HVECs和TLR-MyD88-NFkB通路(38]。中性粒细胞聚集及其与内皮细胞和血小板的交互以及neutrophil-derived微粒子促进血栓闭塞的一代,纤维蛋白积累,和出血39- - - - - -41]。单核细胞聚集导致血栓的形成。研究表明,巨噬细胞渗透到内部板和VCAM-1和ICAM-1道病变的血管内皮细胞表达42,43]。内皮细胞实验表明LA抑制单核细胞与内皮细胞的粘附。动物研究表明,LA减少下肢坏死程度的道老鼠,改善血液供应,减少NLRP3在血管的表达。拉可能实现这些好处减少麦克米兰活动和炎症损伤内皮细胞。这个假设尚未验证在活的有机体内实验;缺乏确认可能是本研究的局限性之一。广泛性功能动脉在TAO患者肱动脉的功能恶化可能与水平的提高各种炎症标记物(3]。血清il - 6水平和引发的显著减少后道治疗与常规治疗(44]。这是符合降低血清中il - 6,引发,在治疗后CRP道有洛杉矶的老鼠。

一些药物和手术以外的选项可用来治疗TAO道治疗除了中止吸烟的45]。强效的血管舒张的频繁使用,如iloprost,应用波生坦,西地那非,或alprostadil,缓解症状,减少截肢的风险。虽然两个随机试验证明静脉iloprost的功效,没有证明口服药物可有效治疗道。这项研究提供了一种生物的抗炎作用机制和发展的理论基础药物治疗道。

5。结论

LA显示抗炎作用;一些潜在的机制Syk-p38 /物信号通路。这项研究的结果表明,洛杉矶可以治疗血管疾病与炎症有关,如道。

缩写

GAPDH:	甘油醛3磷酸脱氢酶
HEK293:	293年人类胚胎肾细胞
合:	辣根过氧化物酶
HUVECs:	人类脐静脉内皮细胞
IL:	白介素
拉:	Levistilide一
有限合伙人:	脂多糖
MCP-1:	单核细胞趋化蛋白1
PBS:	磷酸盐
麦克米兰:	脾酪氨酸激酶
U937:	人类白血病单核细胞淋巴瘤细胞株
VCAM:	血管细胞粘附分子
道:	血栓闭塞性脉管炎。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者确认他们没有利益冲突。

作者的贡献

会宁郭执行大多数实验工作和写论文。李太阳的一部分进行实验。凌霜执行最初的实验,揭示了毒品活动。Jin-Wen徐研究的构想。

确认

这项工作是由美国国家科学和技术支持中国科技部重大项目(2009 zx09311 - 003),中国国家自然科学基金(81274130),中国上海市教委创新项目(12 zz1225),和085年上海世博会项目高等教育内涵建设(085 zy1202)。