文摘

催乳素是一种激素,起着重要的作用在许多生理过程的调节包括哺乳,繁殖,脂肪代谢和免疫反应。催乳素的分泌可以被免疫压力通常伴随感染。本研究旨在确定细菌的影响endotoxin-lipopolysaccharide (LPS)——催乳素(PRL)的基因表达和催乳素释放的绵羊的垂体前叶(美联社)外植体收集的盐水,LPS-treated母羊在卵泡期。toll样受体4的表达式(TLR4)和促炎细胞因子白介素- 1 (IL)β、白介素和肿瘤坏死因子(TNF)α基因也化验。研究结果表明LPS刺激泌乳素的分泌和il - 6基因表达在美联社外植体,但其行动lactotrophs取决于动物的免疫状态。证明了一个重要的角色在增强的效果有限合伙人在垂体saline-treated母羊是由LPS-binding蛋白质(LBP)——“适配器分子”LPS结合到细胞表面受体CD14和TLR4。同时,发现细菌内毒素作用于垂体前叶细胞可提高泌乳素分泌,这有限合伙人可以介导il - 6的影响称为prolactin-releasing因素。识别的神经内分泌和免疫相互作用调节泌乳素分泌可能有助于发展新的和更有效的治疗障碍与激素分泌紊乱。

1。介绍

200 -氨基酸肽,催乳素是最多才多艺的激素的生物之一。它是由腺分泌细胞(lactotroph细胞)前脑垂体(美联社)。这种肽作用不仅在内分泌,也自分泌和旁分泌的方式(作为生长因子、神经递质或免疫调制剂)(1]。催乳激素的释放是由很多因素。多巴胺被认为是其分泌的主要负监管机构;然而,它还可以抑制乙酰胆碱,心房利钠肽,bombesin-like肽、白血病抑制因子、前列腺素,细胞因子il - 1等β(1- - - - - -3]。虽然多巴胺被认为是主要的催乳素抑制因子,主要prolactin-releasing因素尚未定义。然而,刺激泌乳素分泌的影响由雌二醇展出,催产素,γ-氨基丁酸,去甲肾上腺素,血清素,salsolinol, il - 6 (1,3- - - - - -7]。此外,发现促性腺激素释放激素(GnRH)可能显著刺激脑下垂体泌乳素分泌lactotrophs [8,9]。

通常,泌乳素被称为激素对乳腺功能至关重要,因此哺乳期的规定,但也参与调节许多过程包括复制、增长、发展、脂肪代谢,头发脱落,细胞分化,渗透调节和免疫反应1,10]。扭曲的催乳素释放通常伴随着许多疾病,如不孕不育、阳痿,骨质疏松症,癌症,还有一些自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、佐剂关节炎,和囊性纤维化11]。此外,增强释放催乳激素发生在细菌内毒素引起的免疫应激(12,13]。在研究的动物模型中,静脉注射免疫应激诱导的细菌endotoxin-lipopolysaccharide(有限合伙人)14]。这是革兰氏阴性细菌外膜的一个组件,并释放到循环复制和细菌细胞死亡(15]。内毒素刺激动物细胞发生通过与一些蛋白质包括信号级联CD14蛋白质,MD-2蛋白质,和LPS-binding蛋白质(LBP),相应的有限合伙人的必要组成部分receptor-Toll-like受体4 (TLR4) [16]。有限合伙人与枸杞多糖,是一种急性期蛋白,进入血液中。然后,LPS-LBP复杂CD14蛋白结合,这对TLR4的激活是必需的。CD14、MD-2和TLR4受体细胞有限合伙人(17,18]。激活后内毒素,TLR4能传感其炎症通过复杂的细胞内信号通路,导致转录因子的激活,如核转录因子激活B细胞(NF - kappa-light-chain-enhancerκB), c-Jun n端激酶(物)和蛋白激酶p38,或诱导细胞凋亡16- - - - - -18]。TLR4不仅出现在免疫细胞,其表达在美联社还发现细胞(16,19,20.]。它表明垂体激素分泌的变化发生在细菌感染可能引起的,至少部分,有限合伙人达到脑下垂体和直接影响其分泌功能。

因此,本研究的假设是有限合伙人调节泌乳素分泌垂体前叶的外植体收集的盐水,endotoxin-treated母羊发情周期的卵泡期,和这个动作可以依赖于枸杞多糖的存在。

2。材料和方法

2.1。体外实验

所有程序对动物进行华沙当地伦理委员会同意大学生活Sciences-SGGW(波兰华沙;授权号码50/2013)。

体外实验进行的组织收集12个成年人,3岁的黑头粉刺母羊发情周期的卵泡期。标准化的实验条件,母羊发情周期的同步的Chronogest®CR(默克动物卫生、Boxmeer荷兰)根据其它地方描述的方法(21]。

动物们被分成两个子组:控制(生理盐水治疗, )和LPS处理( )。母羊和一个适当的注入颈静脉的有限合伙人大肠杆菌055:B5 (400 ng /公斤)(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)溶解在盐水(0.9%w/v氯化钠)(美国巴克斯特,迪尔菲尔德中学,IL)。注射LPS的最大体积的解决方案(10 mg / L)从未超过2.5毫升。对照组收到同样体积的生理盐水(基于他们的体重)。三个小时有限合伙人或注射生理盐水后,所有的动物都有直肠体温测量;38.0±0.3,39.6±0.4°C的盐水,LPS-treated组,分别。三个小时有限合伙人或注射生理盐水后,所有的动物都被斩首安乐死,收集前脑垂体后被分成6外植体和立即转移到24-well板块(实验室的器具,正欲富兰克林湖,新泽西,美国)。外植体的体外孵化199年媒介执行消息灵通的修改(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)penicillin-streptomycin解决方案的剂量10毫升/ L (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和孵化37°C、O的87%₂,5%的公司₂。所有组织于800年preincubated 2 hμL 199年“纯”媒介。预孵化期间,每30分钟,新鲜的媒介改变了4次一洗血和从垂体激素剩余片段出来。然后,收集从每个外植体生理盐水和LPS-treated母羊被分成6部分和随机分配到一个实验小组如下:我控制(“本地”):“纯”中孵化199;II-GnRH控制:治疗促(100 pmol /毫升);III-LPS:处理有限合伙人(10 ng / mL);IV-LPS +促:培养介质中有限合伙人(10 ng / mL)和促性腺(100 pmol /毫升);V-LPS +枸杞多糖:接受有限合伙人(10 ng / mL)和枸杞多糖(120 ng / mL);激性腺素释放素:VI-LPS +枸杞多糖+ LPS处理(10 ng / mL),枸杞多糖(120 ng / mL),促(100 pmol /毫升)。4 h孵化后,外植体和媒体都冻结在−80°C,直到进一步的化验。

2.2。未及的催乳激素

催乳素的浓度介质被RIA double-antibody化验方法使用特定anti-ovine-PRL和anti-rabbit -γ球蛋白抗血清(如前所述)(22]。碘化的催乳激素标准是根据获得的其它地方描述的方法(23]。灵敏度是2 ng / mL;intra-assay 9和interassay系数变化和12%,分别。

2.3。相关基因表达分析

NucleoSpin®RNA工具包(MACHEREY-NAGEL GmbH Co ., Duren,德国)被用来隔离前移植组织的总RNA。孤立的RNA的纯度和浓度是量化spectrophotometrically使用NanoDrop 1000仪器(热费希尔科学Inc .)、沃尔瑟姆,妈,美国)。孤立的完整性RNA电泳证实了使用1%的琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。Maxima™第一链cDNA合成装备RT-qPCR(美国马热费希尔科学、沃尔瑟姆)被用来执行互补脱氧核糖核酸的合成。作为起始物料cDNA反转录反应合成,1μ使用g的总RNA。实时PCR进行了使用热FIREPol EvaGreen®qPCR混合+(索利斯生物因素、塔尔图、爱沙尼亚)和高效液相色谱级以前设计的寡核苷酸引物(表(基因组,华沙,波兰)1)。一个管包含4μL PCR反应混合液(5倍),14μL RNase-free水,1μL引物(0.5μ浓度为0.25 L,工作μ米),1μL cDNA模板。管是运行在Rotor-Gene Q(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)。使用以下协议:15分钟在95°C激活热态启动DNA聚合酶,最后PCR包括30个周期在95°C变性10秒,60°C退火20秒,10秒在72°C扩展。周期后,最终融化曲线分析在连续荧光测量进行确认的特异性扩增。相对基因表达比较量化计算使用option [24]-Rotor-Gene问软件(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)。三个看家基因检查:glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH),β肌动蛋白(ACTB),组蛋白脱乙酰酶1 (HDAC1)。的意思表达这三个看家基因用于规范化分析基因的表达。这项研究的结果发表在任意单位,比目标基因表达的意思表达的看家基因。催乳素和TLR4基因表达分析、基因表达的平均相对数量的对照组垂体前叶外植体收集saline-treated母羊被设置为1.0。在所有检查促炎细胞因子基因表达的情况下,平均相对数量的肿瘤坏死因子基因表达的对照组垂体前叶外植体收集saline-treated母羊被设置为1.0。

2.4。数据分析

原始数据,通过正常测试后,受到重复测量三方方差分析(ANOVA、GraphPad棱镜、圣地亚哥、钙、美国),后跟一个事后Sidak的多重比较检验。建立了统计学意义 。

3所示。结果

3.1。有限合伙人的体外影响泌乳素释放

这是发现促性腺激素刺激( )泌乳素释放外植体的生理盐水和LPS-treated母羊。在外植体从saline-treated收集动物,LPS刺激的增加( )泌乳素释放行为只与枸杞多糖。另一方面,添加枸杞多糖不是LPS-dependent所需的刺激( ),催乳素释放的外植体从endotoxin-treated动物。此外,发现外植体从saline-treated母羊co-treated促,有限合伙人,枸杞多糖表现出最高的催乳素释放实验人群。然而,这种添加剂的影响伴随治疗促,有限合伙人,枸杞多糖并没有发生在外植体的情况下从LPS-treated动物(图1)。

3.2。有限合伙人的体外效果光杆载荷在美联社外植体基因表达

这是确定促提高( )光杆载荷在所有治疗AP外植体基因表达。外植体的形式收集saline-treated母羊,LPS-dependent增加光杆载荷基因表达组中发现只有相伴LPB处理。有限目的银行模式的存在并不需要刺激( 有限合伙人的)影响光杆载荷基因表达的外植体endotoxin-treated动物。发现的美联社外植体收集LPS-treated母羊伴随治疗促性腺激性腺素释放素,和有限合伙人以及有限合伙人,枸杞多糖具有显著( )的高表达光杆载荷基因与治疗组相比只有促或有限合伙人或有限合伙人和枸杞多糖(表2)。

3.3。有限合伙人的体外效果TLR4、IL-1βil - 6, TNFα在美联社外植体基因表达

无效的治疗基因的表达TLR4 IL-1β,TNFα被发现。另一方面,在美联社外植体saline-treated母羊体外处理有限合伙人和枸杞多糖,增加( )il - 6基因表达。而在美联社从endotoxin-treated外植体动物,LPS-dependent增加( )的水平il - 6mRNA水平指出无论添加有限合伙人单独或连同枸杞多糖(表3)。

4所示。讨论

压力的一个重要指标是泌乳素的许多属性之一。其期间增加分泌炎症通常被认为是压力造成的影响免疫系统的激活(25]。在以前的在活的有机体内研究,结果表明,免疫应激引起的周边管理内毒素刺激泌乳素释放在羊12,13]。在非繁殖母羊,催乳素分泌增加后静脉注射脂多糖和与信使rna编码转录增加催乳素在美联社13]。认为细菌内毒素引起的炎症刺激泌乳素分泌下丘脑水平通过激活不同的过程。建议在研究老鼠,压力诱导泌乳素释放可能是由于促肾上腺皮质激素的释放因子(CRF)因为I型受体的封锁导致的循环浓度明显降低催乳素(26]。此外,催乳素水平的升高血液中免疫应激期间可以促炎cytokines-central中央行动的结果与il - 1治疗β显著增加的催乳素分泌鼠(27]。同时,泌乳素分泌的变化可能是由于中央有限合伙人的作用。在在活的有机体内在雄性大鼠,研究结果表明:intracerebroventricular (icv)管理有限合伙人的第三脑室脑引起血清催乳素水平的增加在注射后12到24小时,只在24小时(尽管这种增长是显著的28]。值得一提的是,越来越多的研究表明,在感染期间,有限合伙人,尤其是它的组件,脂质,穿过血脑屏障穿透大脑实质(29日];因此,它的直接行动集中监管流程不能被边缘化。

然而,我们的研究表明,炎症可能会影响通过过程发生在垂体泌乳素的分泌水平。在我们的体外实验,证明了有限合伙人影响PRL基因表达和催乳素释放美联社外植体从盐水和收集LPS-treated母羊。然而,建议这种刺激作用有限合伙人在催乳素的分泌,至少部分,结果从本地合成il - 6的作用。在发现il - 6基因表达显著增高LPS-treated外植体。这一发现与之前的研究一致通过TLR4作用脂多糖刺激folliculostellate细胞释放等促炎细胞因子il - 6 (20.]。建议增加催乳素分泌炎症过程中可能引起的il - 6影响垂体的分泌活动的直接刺激垂体lactotrophes释放催乳素(6,7]。此外,il - 6受体在大脑中已发现在脑下垂体和证实这个白介素刺激泌乳素由垂体前叶分泌腺[30.]。的基础版本的多克隆抗血清催乳素是抑制鼠il - 6,显示泌乳素分泌的il - 6参与(31日]。然而,在我们的研究中,这是证明增加催乳素分泌发生与免疫挑战,至少部分,可能导致直接行动的循环在垂体lactotrophs细菌内毒素。虽然我们的数据基础上,很难判断哪种类型的垂体前叶细胞是细胞因子的主要来源。它可以认为深刻的垂体释放il - 6 folliculostellate细胞。前所述,folliculostellate脑下垂体细胞的源和目标促炎细胞因子,如il - 1、il - 6和TNFα(32,33),他们可能在其他垂体细胞旁分泌和自分泌途径。有限合伙人的缺乏影响治疗il - 1的基因表达β和肿瘤坏死因子α美联社外植体的控制(生理盐水治疗动物)和有限合伙人(有限合伙人动物)治疗组是惊人的:然而这可能源于自分泌和旁分泌il - 6的行动垂体细胞和抑制这些细胞因子转录。众所周知,细胞因子il - 6是一个独特的多效性的展示都赞成和消炎作用,其他行为,抑制il - 1β和肿瘤坏死因子α生产(34]。

有限合伙人干扰垂体细胞的能力可能是由于其相应的受体TLR4的表达腺。TLR4受体的存在在美联社也证实了我们之前的研究非母羊(16),以及在体外实验中对美联社从母羊外植体在卵泡期19]。目前的体外研究证实TLR4在美联社外植体的存在从盐水和LPS-treated动物,但任何实验治疗这个受体的基因表达的影响。结果表明:LPS-dependent刺激泌乳素分泌从美联社外植体收集完整,saline-treated动物所需枸杞多糖的存在,而在组织收集的动物受到免疫压力,这种蛋白质的增加不需要有限合伙人的行动。这一事实再次支持我们之前研究的结果表明,有限合伙人的活动在绵羊的垂体细胞完整的动物需要枸杞多糖的存在(19]。枸杞多糖的能力提升有限合伙人的反应也证明了在这两个在活的有机体内和在体外研究[35,36]。然而,在某些情况下,有限合伙人可以刺激TLR4单独但有限合伙人的自发扩散单体cellular-binding网站速度非常慢,和转让的枸杞多糖提高免疫反应有限合伙人高达1000倍在体外(36]。值得一提的是,枸杞多糖的生物学作用浓度依赖性。枸杞多糖可以抑制LPS浓度高生物活性在体外和在活的有机体内(37]。外植体的事实从LPS-treated动物的存在期间没有必要表明,枸杞多糖endotoxin-induced免疫压力脑下垂体的枸杞多糖水平足以使行动的有限合伙人AP外植体。

我们的研究结果也证实刺激促对泌乳素分泌的影响无论是在生理盐水,LPS-treated动物。对人类垂体单层细胞培养实验中,也发现,由直接作用于垂体促性腺激素刺激泌乳素分泌细胞在体外(38]。我们的体外研究外植体收集的动物在生殖季节可刺激促性腺的影响深远的重要性。前所述,在光周期物种,促性腺激素刺激泌乳素释放lactotrophs只在繁殖季节(9]。值得注意的是,尽管有限合伙人和促一般刺激泌乳素分泌,PRL基因表达在我们的研究中明显高于群体的外植体同时激性腺素释放素相比,接受有限合伙人和有限合伙人的团体或促单独添加。这表明,这些治疗的生物刺激效应可能是通过不同的细胞通路。

5。结论

总结,结果表明,在美联社外植体LPS刺激泌乳素的分泌,这种效果,至少部分,可能是介导的il - 6基因表达在外植体内毒素治疗后升高。然而,这一行动的有限合伙人垂体似乎依赖于动物的免疫状态。同时,证明了一个重要的角色在增强的效果有限合伙人在垂体saline-treated母羊扮演LPS-binding protein-an分子“适配器”LPS-binding细胞表面受体CD14和TLR4。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由法定基金Kielanowski研究所的动物生理和营养,波兰科学院。