文摘

圆锥角膜是一个逐步角膜扩张,可能导致严重的视力损害由于不规则散光引起角膜变薄。除了与特异反应性的协会,眼摩擦,或遗传因素,后期报告显示的参与炎症疾病的发病机理。我们的目标是确定的浓度il - 4、il - 6、il - 10,咆哮,干扰素γ,肿瘤坏死因子α在患者的泪膜圆锥形角膜家庭成员和他们的第一个学位。我们分析了48个参与者观察横断面研究。圆锥形角膜的诊断必须确认除了至少47 D角膜屈光权力角膜地形Placido-based地形系统提供的数据和分析的模式:不规则散光不对称的“蝶形领结。“至于其他群体,最重要的诊断标准是一个正常的地形模式规则散光。17个圆锥形角膜患者中,16个亲戚,和15控制后被招募临床评估作为研究的一部分。细胞因子的平均值是类似圆锥形角膜组和亲戚的样本,但与对照组相比显著提高。圆锥形角膜之间重要的差异被发现il - 4水平之间的病人和亲属和亲戚和控件(平均差302.42, 和219.16, ,图基HSD过程)。圆锥形角膜组织,使用CORR过程,我们发现统计上强烈的相关性的il - 6浓度泪与疾病阶段( , )、角膜散光计( , ),pachymetry ( , ),角膜滞后( , )。细胞因子过度表达可能与圆锥形角膜的炎症病因相关。总之,对于一些一级家庭成员,高撕裂生物标志物可能代表一个补充风险因素。

1。介绍

圆锥角膜是一种角膜扩张描述为非对称和进步条件显著影响视力和隐含的对病人的生活质量1]。圆锥形角膜角膜基质的特点是逐渐变薄导致组织的结构改变。圆锥形角膜引起不规则散光。角膜扩张影响通常年轻人在青春期和可以进展到三号到四号十年当生理角膜交联被认为是疾病的稳定因素(2]。圆锥形角膜的确切病因仍然不明。尽管大多数情况下的圆锥形角膜是零星的,许多研究已经报道的一个重要数量家族圆锥形角膜继承通过一个常染色体显性或隐性的模式。一次最近的研究描述了风险与积极发展圆锥形角膜(家族史的家庭成员3,4]。液态氧(胶原蛋白交联酶赖氨酰化氧)基因负责交联胶原蛋白和弹性蛋白被认为是一个潜在的圆锥形角膜的发展,可靠的因素导致了角膜的结构。等其他基因,DOCK9、IL1RN SLC4A11, HGF, TGFBI, ZNF469, ZEB1, VSX1已进行过研究并参与圆锥形角膜的可能遗传元素(5,6]。至于环境因素,眼摩擦的一个最重要的是异位性密切相关。主题与过敏的风险更高发展圆锥形角膜(7]。

检测不到发炎圆锥形角膜第一次被描述为一个迹象扩张。相反,多发表的最近的研究证据表明,突出可能炎症病因(8- - - - - -11标记通过促炎细胞因子的存在如il - 6、il - 1β,γ干扰素、肿瘤坏死因子α泪膜的圆锥角膜患者。

一个新奇的失衡是圆锥形角膜炎症的发病机理和免疫反应的辅助细胞(Th)。Th细胞分为5个不同的亚型,2的相关研究:Th1、Th2。而细胞分化成Th1促进免疫细胞反应通过刺激细胞毒性T细胞的产生和增加巨噬细胞的活动,Th2细胞导致过敏状态的发展,诱导嗜酸性粒细胞和肥大细胞的增殖12]。Th1细胞产生2、IL-3干扰素γ和肿瘤坏死因子α和β。IL-5效应Th2细胞合成il - 4, il - 6、il - 10, IL-13 [13,14]。il - 1、il - 1α2蛋白质组成和il - 1β细胞来源的巨噬细胞和单核细胞,和他们的目标是T细胞,成纤维细胞,上皮细胞,导致诱导促炎的蛋白质。il - 4来源于Th2细胞和目标T细胞和B细胞,刺激生产的B细胞和移植二类MHC在B细胞的表达15]。至于il - 6,这似乎影响许多自身免疫和炎症性疾病的发病机理。体外研究表明,il - 6 transsignaling增加CXCL5趋化因子激活,CXCL6, CCL8 [16]。Th2-derived因子,il - 10,会使表面二类MHC分子的表达,抑制作用等某些细胞因子il - 1β,il - 6、il - 10,肿瘤坏死因子α(17,18]。产品完全有区别的Th1细胞干扰素γ控制广泛的生物功能。干扰素γ调节proapoptotic活动并能促进细胞凋亡增强的表面表达肿瘤坏死因子α受体(19]。另外,干扰素γ上调一些溶酶体蛋白酶如组织蛋白酶B和L (20.]。肿瘤坏死因子是由激活的巨噬细胞和CD4 +淋巴细胞与一个完整的信号通路。肿瘤坏死因子α也参与细胞凋亡的诱导21]。

2。方法

本研究在遵守赫尔辛基宣言,和之前他们登记在这项研究中,我们从所有参与者获得书面知情同意。研究遵循制度伦理准则和道德委员会批准的大学的医学和药学布加勒斯特“卡罗尔·戴维拉”。所有48个对象是从Oftaclinic眼科诊所,布加勒斯特,罗马尼亚,从2016年1月至2017年7月。

2.1。病人

前瞻性研究包括48例分为三组。我们最初招募了17双圆锥角膜的亲戚。但是考虑到一个家庭成员有边界变化的地形数据,我们决定排除。因此,研究由17个圆锥形角膜患者、16一级家庭成员的病人,15个对照组。包含标准圆锥形角膜的圆锥形角膜组积极的诊断评估角膜地形,pachymetry,角膜生物力学,和裂隙灯检查以下疾病临床症状取决于阶段:近中心基质变薄,“油滴”反射,沃格特细沟,弗莱舍环,老李的迹象。至于组织一次家庭成员和控制,正常biomicroscopic所代表的标准检查,正常的角膜地形数据,正常生物力学测量。排除标准为所有三个民意调查都眼或全身过敏,使用隐形眼镜,眼部手术史(角膜胶原蛋白交联,翼状胬肉、白内障手术和屈光手术),当前系统或局部炎症、自身免疫状况,和干眼病。

2.2。程序

所有的目光接受眼科检查如下:(我)完整的个人和家庭历史包括使用任何类型的抗炎、抗过敏药眼部或系统性药物。(2)临床检查:最佳矫正视力、裂隙灯检查。(科目但超过10秒,Schirmer至少10毫米的测试包括在这项研究。)(3)Paraclinical考试:角膜地形(Topcon),眼部反应分析仪(ORA, Reichert,位于纽约州迪普市,新泽西),pachymetry(或中央角膜厚度(CCT)),和地形指数(最大角膜散光计阅读(Kmax)和圆锥形角膜预测指标(KPI))。圆锥形角膜的阶段是对Amsler-Krumeich分类分级阶段我(的意思K< 48 D),第二阶段(48-53 D,有条件现金转移支付> 400μ米),第三阶段(53-55 D,有条件现金转移支付= 300 - 400μ米),四期(< 300 > 55 D,有条件现金援助μ米)。关于角膜生物力学,我们评估某些体内参数使用奥拉如角膜滞后(CH),角膜阻力系数(CRF)和圆锥形角膜匹配概率(公里)。

撕裂集合的时候,没有参与者给历史的局部或全身性过敏或炎症。在单边圆锥形角膜的情况下,我们选择收集的液体眼病。此外,一些圆锥角膜患者已经经历了一只眼睛角膜交联,因此包含在研究影响眼睛。这项研究的挑战是尊重所有的纳入和排除标准为了结果尽可能的准确。泪水集合进行仔细没有局部麻醉,在低照明的房间。50μL毛细管被用来收集至少15μL的眼泪体积差结膜死胡同(避免反射撕裂)通过毛细吸引力,然后转移到埃普多夫管。对于每一个样本,我们使用新的微细管和埃普多夫超小型电子管。集合后,眼泪样本存储在−1小时内80°C不离心,直到分析。

MILLIPLEX映射细胞因子/趋化因子磁珠面板工具包7-plex面板组成的il - 1β干扰素γ,il - 10、il - 4、il - 6,咆哮,肿瘤坏死因子α(美国默克密理博,Billerica的)评估根据制造商的指示22]。准备的标准浓度,使串行稀释,从3.2到10000 pg / mL,分析缓冲被认为是背景(标准0 pg / mL)。简单,样品(眼泪)珠集孵育,缓冲区,和细胞因子标准,质量控制1和2,在96孔板中提供工具在一夜之间在4°C。一个卷25μL标准/控制/样品添加相应的井,紧随其后的是25μL分析缓冲区和25μL珠的混合物。所有进一步的孵化项目,包括生物素化的检测抗体,随后与streptavidin-phycoerythrin孵化,实现在室温下,在黑暗中,用颤抖的500 rpm。所需的清洗步骤进行了使用磁档板。多路数据采集和分析进行了使用Luminex 200平台(美国Luminex Corp .)、奥斯汀、TX)和xPONENT软件3.1版。每个微球是被自己的“珠签名”和量化之后,基于荧光记者信号。每个分析物的质量控制研究的范围1和2也提供卡插入内的装备,和质量控制范围生成隔夜化验使用血清矩阵MILLIPLEX工具包中提供的格式。重复样本用于所有标本,校准曲线生成5-parameter物流配合。每个分析物的曲线是充分调整以优化符合预期的范围。关于试验敏感性,最低检测浓度,以pg / mL,计算使用xPONENT 3.1软件,也提供了在每个分析物的工具。最低检测浓度下降了0.4 - -0.8 pg / mL范围内。 The data was presented as the mean SD of duplicate, and the two-tailed小于0.05的值被认为是表示使用学生的显著差异t以及。

2.3。统计分析

病人的数据收集和引入一个OpenOffice的PC,版本以下4.4.1©2014。统计分析完成后用以下程序:SAS 3.4.0大学版9.3版和R版本。

2.3.1。描述性统计

对于分类变量,我们确定了绝对和相对频率。我们用图形表示的箱线图。

2.3.2。干扰的统计数据

连续变量的对比3民意调查是由如下:如果3批次上变量的分布可以近似高斯分布,最初是使用一个方差分析测试。如果方差分析测试显示显著差异,我们也进行了事后post-ANOVA过程称为图基HSD测试。如果变量的分布不能近似正态分布,克鲁斯卡尔-沃利斯测试进行了邓恩测试(事后post-Kruskal-Wallis过程)的一个统计上显著的结果。变量之间的相关性进行了确定r皮尔森相关指数(如果变量的分布可以近似正常)ρ斯皮尔曼相关指数(如果分布不能由一个高斯分布)。测试用值≤0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

共48例患者纳入本研究:17眼中17圆锥形角膜患者(64.71%的男性和35.29%的女性),16的眼睛角膜的一级亲属(56.25%的男性和43.75%的女性),和15 15控制正常的眼睛(男性40%,女性60%)。组圆锥形角膜,范围从13岁到59岁的平均值为23.35 (±11.80;值= 0.0006),而亲属组(平均年龄18.81±6.13;值= 0.7645)从9 - 30和控制的平均年龄28.66 (±3.03;值= 0.9529)范围23 - 34。3组之间的最小年龄差异存在,但所有主题都包含在年轻人的范畴。

根据Amsler-Krumeich分类3(18%)的圆锥形角膜患者分级I期,5阶段II(29%), 4例(24%)为第三阶段,第四阶段5 (29%)。

调查在圆锥形角膜炎症的作用,来分析是否也有炎症组件在圆锥形角膜患者的一级亲属中,我们进行了一项观察横截面研究。xMAP细胞因子检测的试验都是在泪水中可检测除了1患者的βil - 1和il - 4 2例。他们的平均值和分布如表所示1和图1。

所有变量的分布(细胞因子)除了以上咆哮是正常的在所有组(类似于高斯分布)。为了调查3组均值之间的差异是否具有统计意义,我们使用方差分析测试和观察到的几乎所有细胞因子的增加是统计学意义除了咆哮,没有重要的差异3投票。虽然所有变量的方差分析测试显示统计学意义( ),图基诚实的显著差异测试后,结果变化。β干扰素γ的方式,il - 10、il - 1、il - 4、il - 6、TNF有圆锥角膜患者和正常人之间的显著差异。βil - 1和il - 4给出了最著名的圆锥形角膜之间的显著差异和对照组之间的亲属和正常的受试者。没有统计上显著的差异圆锥形角膜病人和他们的亲戚,见表2和3正如ilustrated数据2和3。

进一步,我们集中研究圆锥形角膜和控制组织和开展一些细胞因子之间的相关性和疾病的重要参数。我们把细胞因子之间的相关性进行水平和疾病的严重程度的圆锥形角膜组织。弱和中等,但积极的相关性被发现但不是全部显示统计学意义。我们观察到中等正相关与统计学意义除了il - 10和肿瘤坏死因子α,也就是说,在疾病的发展阶段是伴随着更高价值的炎症生物标记。

泪水炎性生物标志物水平与角膜散光计读数直接相关。结果,如表所示4,一个积极的迹象,媒介,在il - 6的情况下显著相关。至于有条件现金转移支付在圆锥形角膜患者中,我们发现消极的,强,统计上显著的相关性。分析表4,我们可以,il - 6水平提出了最重要的与严重程度的相关性,角膜散光计,pachymetry ( , ; , ;和 , 、职责)。积极和直接相关的角膜散光计意味着增加角膜散光计读数伴随着眼泪细胞因子的过度。另一方面,有关pachymetry负相关表明,中央角膜厚度越低,细胞因子浓度越高的泪水圆锥角膜患者。

此外,在圆锥形角膜角膜生物力学研究,我们检查了CH和CRF与细胞因子之间的相关性,发现负强的变量之间的相关性,暗示这一事实撕裂细胞因子水平的增加伴随着减少CH和CRF表中反映出来2最引人注目的il - 10的情况下( 和 CH和 和 CRF)。

4所示。讨论

广泛研究的病因圆锥形角膜,但它仍然还不清楚。作用的细胞因子、蛋白酶和氧化应激是一个中心研究人员争论,因为它是假设炎症介质圆锥角膜患者泪膜的可能原因之一的组织退化病变角膜扩张的发展。

许多研究与角膜变薄的微环境之间的不平衡水平的提高蛋白水解酶和抑制剂的水平下降23]。

Galvis等人的结论是在一个完整的和结构化的评论在圆锥形角膜炎症的存在炎性细胞因子之间的恶性循环,蛋白酶及其抑制剂在另一方面,过度的氧化应激,导致细胞凋亡增加(24]。

据我们所知,这在罗马尼亚研究首次检查中炎性细胞因子的浓度的眼泪圆锥角膜患者及其一级家庭成员。由于遗传因素是一个证明的事实,我们考虑了当地的可能性炎性改变病人的家属。我们发现增加细胞因子的表达两组相比(圆锥角膜患者及其亲属)控制。

因此,我们回顾了大多数相关研究文献中对圆锥形角膜炎症通路来比较我们的结果。只有少数研究由免疫bead-based多路复用设备,而许多使用了标准的ELISA测试比多路检测的灵敏度较低。我们的研究结果表明IL-1b的表达升高,il - 4、il - 6、il - 10,干扰素γ,肿瘤坏死因子α在keratoconic眼中的泪水以及第二组(亲戚)与对照组相比。il - 1的细胞因子家族有很强的促炎的行动和负责金属蛋白酶和胶原酶的激活,以及超表达的il - 6 (25,26]。

在一项由利康et al ., keratoconic眼角膜呈现增加il - 1受体表达与正常角膜(27]。据威尔逊等人的实验中,角膜基质IL-1b可以诱导细胞凋亡,改变正常的结构组织在圆锥角膜患者28]。在我们的研究中,我们发现水平的提高IL-1b圆锥形角膜和亲戚的组与正常人相比。这个结果是按照Sorkhabi等人,但在与小君等人IL-1b撕裂水平保持不变在圆锥角膜患者9,29日]。

下面是概述研究炎症介质的眼泪在圆锥形角膜测量流体不同细胞因子抗体阵列。2010年,Pannebaker等人报道没有统计上的显著差异圆锥形角膜的眼睛和正常的参与者之间细胞因子水平。另一方面,他们发现一个显著增加矩阵metalloproteinase-one(金属蛋白酶- 1)圆锥形角膜组织(30.]。细胞因子的测量小君等人的研究显示增加il - 6和减少肿瘤坏死因子α干扰素γ,il - 4, CCL5圆锥形角膜而控制眼泪(29日]。我们的研究结果证实il - 6撕裂程度增加,而其他生物标志物水平与我们的结果不同。可能造成这些差别的原因可能是使用不同的免疫bead-based多路复用系统和病人的平均年龄显著差异之间的研究。当小君等人招募患者平均年龄38±10圆锥形角膜主题,在我们的研究中,我们有一个平均年龄23.35标准差为11.08。虽然研究的范围很小,我们可以提高质疑年龄影响免疫反应和隐性疾病进展,因为这些因素之间的相互作用。年长的圆锥形角膜患者炎症相互作用的假设非常低可以解释相互矛盾的结果之间的差异。Balasubramanian等人在2012年出版的一系列结果表明il - 4的表达增加,IL-5,肿瘤坏死因子α,il - 10、il - 6在圆锥角膜患者的泪水,因此分类圆锥形角膜炎症性疾病。这些研究结果与我们的相似,以及细胞因子正相关的角膜散光计读数(31日]。

使用常规ELISA试验,眼肌等人观察增加水平的il - 6和TNF在keratoconic眼中,这是符合我们的研究中,虽然Sorkhabe等人衡量降低il - 10水平与正常人相比,这种情况与我们的结果(8,9]。

Kolozsvari等人反映在圆锥形角膜的严重程度之间的相关性和细胞因子,证明CCL5之间的正相关关系(咆哮),分别il - 6和keratometric指数,表明炎症越高,更重要的是疾病的严重程度(10]。这个观察还发现在我们目前的研究中,显示介质IL-1b之间正相关,il - 4、il - 6和角膜扩张的严重性。

这是第一个研究在罗马尼亚与角膜生物力学相关撕裂生物标志物。关于文学,有许多研究,揭示了显著降低角膜滞后和角膜阻力系数的值相比,keratoconic眼睛健康的眼睛以及他们在监测疾病进展中的作用。我们的实验符合公布的结果,再次声明,圆锥角膜患者改变了生物力学属性(32- - - - - -35]。更进一步,我们发现圆锥形角膜组织的炎性细胞因子是消极和统计上显著相关的两个重要参数,CH和CRF。

我们所知,这是第一个在罗马尼亚研究评估圆锥形角膜的炎症状态的第一学位的家人。我们的结果,这可能有更多的全局考虑,表现出过度的几种细胞因子水平与控制。虽然这些测量无法预测是否亲戚将开发这种疾病,他们可能会考虑一个更广泛的筛选。

我们的研究有一定的局限性等少量的参与者和缺乏血清细胞因子的测量。我们有我们的研究基于小君等人的研究发现圆锥角膜患者和正常个体之间没有显著差异对血清细胞因子浓度,表明圆锥形角膜与系统性炎症无关(29日]。然而,尽管其局限性,现在报告可以被视为一个试点研究,需要进一步深入研究。

5。结论

总的来说,这项研究揭示了细胞因子浓度变化的眼泪圆锥形角膜患者及其一级家庭成员,支持假说的炎症信号通路的疾病。此外,我们提高诊断准确性的问题有关的眼泪炎症生物标记和诊断能力的重要细胞因子水平作为附加参数的角膜成像测试,一个潜在的未来的研究重点。关于亲戚的数据还不能确认可能的风险因素在发展中圆锥形角膜;因此,前瞻性研究多年需要调查和密切关注一级圆锥角膜患者和家属确认高撕裂介质在一个更大的人口。

数据可用性

数据(在Excel中,SAS大学版版本9.3和R - 3.4.0被用于数据分析)用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者都没有任何的利益冲突。

作者的贡献

所有作者都平等的贡献和参与。

确认

这项工作是由罗马尼亚民族权力机构的资助科学研究和创新,加工中心/ CCCDI-UEFISCDI,项目没有。pn - III - p2 - 2.1 - ped - 2016 - 0187,在PNCDI三世。