文摘

我们的目标是调查的一些致病的介质人体包虫病和获得更新对包虫病病例的流行病学研究结果在卡拉布里亚,意大利南部。包虫病的诊断是基于成像、血清学调查,和分子分析。事实上,实时PCR显示G2和G3基因型的存在棘球绦虫granulosus复杂。关于发病机理,免疫抑郁的相关小说工具应该被视为降低血清MCP-1水平。同时,我们发现了一个以前未报告的VEGF,可能与新血管形成相关要求的寄生虫囊肿新陈代谢。细胞因子资料建议向Th2免疫的偏见和Treg反应。一氧化氮水平表现出明显降低手术前一周后治疗和基础水平测量和/或化疗。增加血清总IgE类和IgG4子类中被发现棘球绦虫艾滋病患者和控制。我们的数据表明一个流行蔓延,至少在省Catanzaro和邻近的卡拉布里亚地区,这种寄生虫病与小说女性克服男性病例数的问题。总之,这部小说研究发现血清VEGF增加和减少MCP-1研究的情况下,以及数量棘球绦虫来华的女性克服受感染的男性。

1。介绍

罹患囊型包虫病(CE)是一种重要的绦虫感染被报道作为世界范围内最普遍的人畜共患病之一(1,2]。罹患囊型包虫病(CE)是一种慢性传染病造成的绦虫的幼虫阶段棘球绦虫granulosus并反映人类特有的主机/寄生虫交互。物种的分类/基因型导致罹患囊型包虫病包括大肠granulosus理智lato s.l。复杂的群体,大肠granulosus美国这篇(砂岩)(G1 / G2 / G3),e .马(G4),大肠ortleppi(G5),e .黄花八国集团(G6 /七国集团(G7) / / G10)大肠felidis(“狮子应变”)(3]。

CE是一种潜在严重疾病和可能涉及重要器官如肝、肺、脑。它主要是一种食草动物的疾病,人是不小心感染,通过摄入受粪便污染的食物棘球绦虫明确的主机(如狗、狼和狐狸)(4]。疾病的临床特征可能经常改变,取决于所涉及的器官,囊肿的大小和他们的网站在受影响的器官,囊肿破裂引起的并发症,随后通常致命的免疫反应(5,6]。

从文学,众所周知,发病机制有关棘球绦虫感染可能是利用评估对比力量之间的关系由细胞和体液免疫增强药和免疫抑制介质。据报道,抑制活性的Th2和Treg免疫反应可能发挥关键作用的逃避宿主防御,导致持续的蠕虫感染。细胞因子和其他介质的宿主免疫力的角色在包虫病似乎非常复杂,可能与寄生虫的种类不同,大小,生存能力和位置主机内的囊肿,其代谢的产物,物种的主机5,7,8]。此外,细胞因子相互矛盾的发现已经被不同的调查报告9]。尽管一氧化氮与parasiticidal影响临床和实验设置,很少观察已发表在一氧化氮棘球绦虫感染人类。

流行病学的棘球绦虫已经彻底调查在欧洲和意大利部分地区。相反,逍遥的出版物和数据处理棘球绦虫流行病学在卡拉布里亚,最南端的大陆地区的意大利,绵羊,山羊和牛育种是目前广泛讨论Tamarozzi et al。10]。

因此,本研究的目的是评估在卡拉布里亚地区包虫病的流行病学方面的,以及细胞因子的概要文件和其他主要体液介质棘球绦虫感染。

2。材料和方法

2.1。主题,寄生虫材料和血清样本

在过去的十年里,共有53名患者被诊断为感染棘球绦虫种虫害超声(美国)检查和血清学方法,Catanzaro大学医院。在这样的棘球绦虫艾滋病患者,血清样本和棘球蚴囊肿液体只有19个学科,手术后或一对(穿刺,愿望,注入protoscolicidal代理,和reaspiration)技术。此外,10控制棘球绦虫——与nonparasitic感染者肝囊肿(Echin底片),以及12名健康志愿者(CON),包括控制在这个研究。两对照组受试者被美国和血清学测试检查,和那些棘球绦虫艾滋病患者的诊断方法被排除这样的对照组。其他排除标准为所有注册志愿者的存在肿瘤疾病,严重的代谢改变,主要的肝脏和肾脏损伤。

研究协议Catanzaro大学的伦理委员会批准,所有科目给他们通知书面同意。

2.2。显微镜检查

显微手术获得囊肿液进行离心后整除的标本。显微镜幻灯片准备用生理盐水或与革兰氏染色剂染色,光学显微镜观察。其他准备工作是由荧光显微镜观察11)有或没有荧光染料吖啶橙。

2.3。分子生物学
2.3.1。DNA提取

从棘球蚴囊肿囊性液体收集和储存在−20°C到DNA提取。DNA提取使用QIAamp DNA迷你包(试剂盒、希尔登,德国)后修改程序;500年一个整除μl的标本是离心机(1500 为5分钟),颗粒在180年resuspendedμ与400年l (QIAamp ATL缓冲区μg蛋白酶K和DNA提取后,制造商的建议,从工具列筛选了100年第四卷μl (12]。

EasyMag (bioMerieux、意大利)是用于自动提取从500年μl血液样本。DNA样本筛选了最后一个55岁的体积μl

2.3.2。实时PCR试验

LightCycler系统(罗氏诊断、意大利)LightCycler由于“快速上手”项目DNA主人SYBR绿色我用于放大和实时检测。genus-specific实时PCR分析,提出12 s F GTTAAGCTAAGTCTATGTGCTGC和反向primers12S R CTCTCTTCACATCAACAAACTCATTTAA [13)被用来放大126 bp的部分12 s mtDNA基因。聚合酶链反应混合物包含2μl中提取DNA, 0.25μ1.2 l的底漆,μl MgCl2, 2μl SYBR绿色,和14.3μl H2O为PCR工具包提供的。PCR扩增条件激活的聚合酶(95°C 3分钟),和40个周期进行了放大,每一个包括94°C 30年代,62°C 30年代,30年代和72°C,紧随其后的是最后一个在72°C扩展了7分钟。荧光信号测量在每个周期结束时扩展步骤。融化的实验进行了从45°C到99°C 0.2°C / s连续荧光监测。放大后,融化曲线分析是评估一个Tm(熔点)76.4±0.15°C基因型G1和77.0±0.13基因型G2和G3。

每个PCR运行包括消极提取控制(无菌水)和一个包含5 - PCR控制μl DEPC-treated H2O而不是DNA提取,验证任何可能存在的污染DNA测试。样品和控制在重复运行。

2.4。一氧化氮(NO)的确定

亚硝酸盐,主、稳定和非易失性产品的,量化的间接关联没有生产。病人血清为亚硝酸盐含量的方法进行了分析描述米兰达和他的同事们(14]。短暂,格里斯试剂(1%磺胺和0.3% N - H (1-naphthyl)乙二胺盐酸盐在5%3PO)添加到整除的病人血清还原剂(HCl)钒和孵化为30分钟37°C。然后,光密度(OD)确定使用分光光度计在540海里。亚硝酸钠(纳米2),在血清稀释的健康志愿者,被用来生成一个标准曲线(14]。

2.5。血清学方法

外周血样本获得进行血清学测试。这些分析是基于搜索特定的反棘球绦虫免疫球蛋白的Ab类immunoenzymatic方法(ELISA-NovaTec)。另一个技术是艾达测试(Hydatidose Fumouze,诊断)基于间接血细胞凝集。致敏红细胞由绵羊红细胞涂上棘球绦虫granulosus抗原。血清抗体棘球绦虫granulosus是揭示了致敏红细胞的凝集:红褐色电影中可以观察到阳性样本。在没有特定的抗体(负面测试),预计这些红细胞在井底形成一个环。

免疫球蛋白和IgG4子类、c反应蛋白(CRP),分析了由浊度计(BNTM II系统immunonephelometry)与高水平的敏感性和特异性。总IgE抗体被IgE immunoenzymatic化验技术(Radim SpA、Pomezia、意大利)。

2.6。测量血清细胞因子与生物芯片阵列

细胞因子进行定量,基于生物芯片技术使用数组。它指的是一个“三明治”免疫测定化学发光检测系统。因此,它可以测量所有分析物同时在一个生物芯片。几个Th1、Th2和Treg细胞因子,趋化因子,生长因子被“证据”调查员评估半自动仪器面板的“细胞因子工具包”(英国Crumlin草毒死实验室有限公司)。

为化学发光分析仪提供了一个衡量通过相机CCD(电荷耦合器件),将光信号转换为数据通过专用软件。

2.7。统计分析

获得定量数据被表示为±SEM手段。方差分析(方差分析)和费舍尔的保护有显著差异(费舍尔PLSD)事后测试是用来评估显著的组间差异。的值 被认为是显著的。

3所示。结果与讨论

病人总数parasite-positive的样品到达我们实验室过去10年等于53。

在目前的研究中,有可用的血清样本和囊性液体(冻结在−20°C)从19获得一个或多个患者棘球绦虫囊肿,经诊断成像技术(超声、CT扫描和MRI)和/或血清学调查。根据WHO-IWGE分类(4),我们所有的病人表现出囊肿属于过渡阶段(CE3a / CE3b)。

19个病人的人口数据和实验室发现的省Catanzaro和一些邻近地区研究了2012 - 2016年期间如表所示1。有趣的是,被感染的女性和男性之间的比例是10:9。

表1
Demoscopic数据和实验室研究结果的19个病人省Catanzaro和一些邻近地区研究期间2012 - 2016。

从分子检测囊性液体样本病人,进行了以进一步确定病原体的特征并评价其基因型。PCR实时曲线,程序后Maurelli et al。13),获得我们的病人c.a囊性液体,如图1。所有积极的样品分析展出融化曲线重叠图所示1和属于基因型G2和G3。

(一)
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图1
(一)PCR实时曲线获得囊性液体的手术后的病人c.a Capuano et al。12在“材料和方法”;(b)融化曲线包虫囊肿的标准大肠granulosus基因型与Tm G1 76.55 (A),基因型与Tm G2和G3 77.03 (B),和包虫囊肿的病人c.a Tm 77.11 (C)从这个研究。底片是消极的控制。

关于评价细胞因子在包虫病的过程中,我们观察到显著增加白介素6 (il - 6) ( ;图2)和白介素10 (il - 10) ( ;图3),这可能意味着Th2和Treg反应的增加。MCP-1明显降低( ;图4)和显著增加血管内皮生长因子(VEGF)也发现( ;图5)。


图2
血清中il - 6含量的群感染患者(Echin il - 6)是显著增加( )相比,il - 6浓度组的评估棘球绦虫消极的患者(Echin底片il - 6)和对照组的集团(CON il - 6)。 和反对; 与Echin底片,在方差分析和费舍尔PLSD测试。

图3
组中血清il - 10水平受感染的病人(Echin il - 10)显著增加( )相比,il - 10浓度组的评估棘球绦虫消极的患者(Echin底片il - 10)和组对照组(CON il - 10)。 与反对,在方差分析和费舍尔PLSD测试。

图4
感染病人血清(Echin MCP-1)明显下降( )与记者参数群棘球绦虫消极的患者(Echin底片MCP-1)和组对照组(CON MCP-1)。 与反对,在方差分析和费舍尔PLSD测试。

图5
群感染患者血清VEGF水平(Echin VEGF)显著增加( )与记者参数群棘球绦虫消极的患者(Echin底片VEGF)和组对照组(CON VEGF)。值表示为±SEM。 和反对; 与Echin底片,在方差分析和费舍尔PLSD测试。

包虫病患者,手术前和/或药物治疗,评价的代谢物(没有3也没有2)的一氧化氮表现出显著增加和健康志愿者和价值观棘球绦虫阴性患者( ;图6(一))。一氧化氮显示这些代谢物的浓度显著下降parasite-infected患者手术后一周(时间t - 1) ( )与病人发现水平相比之前治疗(时间T-0)。然而,治疗1 - 2个月后(2),这样的一氧化氮代谢产物表现出光增加(图6 (b))。

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图6
(a)血清水平的氮有显著提高( )相比,在健康对照组和相应的血清浓度棘球绦虫消极的病人。值表示为±SEM。 和反对; 与Echin底片,在方差分析和费舍尔PLSD测试。(b)一氧化氮代谢产物的浓度大幅下降parasite-infected患者手术后一周(时间t - 1) ( )与病人发现水平相比任何治疗前(时间T-0);然而,治疗1 - 2个月后(2),这样的一氧化氮代谢产物表现出光增加。

一些患者的包虫病和讨论进一步下面,剂量免疫球蛋白g和免疫球蛋白总量的子类。至于总免疫球蛋白的水平,没有观察到不同组之间的包虫病患者parasite-negative患者和健康志愿者。相反,IgG4 worm-infected患者更高的价值相比健康志愿者和三倍左右棘球绦虫阴性患者( ;图7(一))。IgG4水平明显下降parasite-infected病人手术后一周(时间t - 1) ( )与病人发现水平相比任何治疗前(时间T-0);这样减少甚至观察1 - 2个月后治疗(2)(图7 (b))。

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图7
(a)的血清水平IgG4群感染患者(Echin IgG4)显著增加( )与相同的参数群Echin-negative患者(Echin底片IgG4)和组对照组(CON IgG4)。值表示为±SEM。 和反对; 与Echin底片,在方差分析和费舍尔PLSD测试。(b) IgG4水平明显下降parasite-infected病人手术后一周(时间t - 1) ( )与病人发现水平相比任何治疗前(时间T-0);这样减少观察甚至1 - 2个月后治疗(2)。 与Echin IgG4 T-0,方差分析后,费舍尔PLSD测试。

此外,总IgE水平显著( )高棘球绦虫来华的病人和棘球绦虫负,以及对照组。其他调查人员发现,总IgE水平明显不同棘球绦虫囊肿患者和健康对照组。在我们的研究中,我们做了一个对比棘球绦虫艾滋病患者和nonparasitic囊肿主题,以及健康对照组,只有第一组显示更高水平的总IgE(图8(一个))。然而,这样的高水平的总IgE被发现后显著降低手术或药物治疗(图8 (b))。

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图8
(a)血清群感染病人的IgE水平有显著提高( )相比,在健康对照组和相应的血清浓度棘球绦虫消极的病人。值表示为±SEM 和反对; 与Echin底片,在方差分析和费舍尔PLSD测试。(b)的浓度显著下降的IgE水平parasite-infected病人手术后一周(时间t - 1) ( )与病人发现水平相比之前治疗(时间T-0)。 与Echin IgE T-0,方差分析后,费舍尔PLSD测试。

彻底的分析科学文献显示缺乏关于感染的发病率和患病率的流行病学研究棘球绦虫在卡拉布里亚地区。本研究可能表明一个省的流行蔓延Catanzaro和邻近地区这样的寄生虫病。同时,看起来更大密度的包虫病病例发生在Soverato(靠近城市Catanzaro)和Marchesate(特别是在城镇西罗和克罗托内)。

parasite-positive病人的平均年龄是55.3,而男性对女性的比例是1:9。两性之间的关系是一个新发现。最近的出版物的主题由意大利作者表明,高度流行的地区(撒丁岛等)两性之间的关系就是人不断的支持。这一发现解释了是因为牧羊人在男性患者的高频率(15]。相反,在我们的研究中,男性和女性患者的数量非常接近,和大多数女性患者家庭主妇,这个观察可能会把注意力集中在不同的危险因素(例如,接触宠物狗;处理被污染的新鲜水果和其他家校双方的生产和工作设置)。

的物种棘球绦虫,只有大肠granulosus已被确认。此外,一些孤立的分子特征显示只有基因型G2和G3,属于分类组报道大肠granulosus美国严格的(3,16]。

然而,最近识别的众多的狐狸,也在城市Catanzaro省境内,不允许排除可能的不同的参与棘球绦虫物种如大肠multilocularis。这一物种已被确定在意大利北部地区,而似乎没有在意大利中部的一些地区17]。

我们的研究结果显示,26%的棘球绦虫来华的患者为阴性棘球绦虫艾达特殊抗体的测试,只基于凝集抗体(不管这种凝集抗体的类/子类)代表包虫病的血清学的筛检试验。据报道,30 - 40%的囊性包虫病病例antibody-negative [5]。

免疫球蛋白抗体是区分成四个子类:IgG1 IgG2 IgG3, IgG4。免疫球蛋白子类之间的差异反映在几个重要的生物功能,如抗原识别、补体的激活,债券的类型与细胞表面上的受体(5]。许多研究已经证明,血清中免疫球蛋白含量的变化子类,相比正常的价值观,是连接到不同的疾病:免疫球蛋白子类的浓度的变化观察寄生虫病包括包虫病患者(18]。它也被发现存在parasite-positive IgG4更高浓度的患者相比,控制。缺乏免疫球蛋白抗体的囊肿已经发表(5,18]。同时,增加子类IgG4包虫病的过程中已经在文献中报道(5,18]。然而,这个子类与免疫相关的免疫球蛋白g经常抑郁涉及T和B淋巴细胞和其他细胞类型的免疫防御。最近,使用一个人类体外模型,发现IgG4生产专门限于il - 10 BR1细胞(19]。这是诱人的猜测棘球绦虫特别刺激的释放与负相关的免疫球蛋白IgG4调制的免疫力。这肯定是一个寄生虫绕过宿主防御机制。

以前,我们小组研究寄生虫的免疫抑制与感染有关的临床过敏性患者和证明的改善过敏病理学在蠕虫感染,而蛔虫根除导致过敏症状(重新崛起20.]。

其他调查人员发现,总IgE水平明显不同棘球绦虫囊肿患者和健康对照组(21]。在我们的研究中,我们做了一个对比棘球绦虫艾滋病患者和nonparasitic囊肿主题,以及健康对照组,只有第一组显示更高的总IgE水平。然而,这样的高水平的总IgE发现手术或药物治疗后显著降低。因此,总IgE可作为诊断和预后标记物的管理棘球绦虫病人。

白细胞介素- 6 (il - 6)是与核心作用的多效细胞因子在免疫和炎症反应(22]。这样最近与Th1和Th17细胞因子免疫级联及其增加,以及干扰素γ和IL-17,期间表现大肠granulosus感染(23]。在大量的报告23- - - - - -26发现了),il - 6在包虫病的主要是增加以及Th1细胞因子和非特异性的促炎介质(如c反应蛋白)。另一方面,il - 6的增加也被报道的一个重要工具Th2宿主免疫防御的极化,从而保护寄生虫和相关慢性疾病的演变(8,23,27]。小说本研究的发现是增加缺乏Th1细胞因子il - 6的和非特异性的促炎介质(如c反应蛋白)。有趣的是,一个主要的抗原,AgB的大肠granulosus被发现可以降低il - 12,但刺激il - 6的在体外人体模型(28]。因此,我们孤立增加il - 6可能解释等选择性刺激Th2细胞因子相关的差别,对这些Th1细胞因子和其他非特异性的炎症介质(如c反应蛋白)。

il - 10的显著增加棘球绦虫艾滋病患者评估在我们的研究中,然而,非常有趣。细胞因子是普遍与抑制机制和消极的调节T细胞和B细胞级联。也观察到,il - 10能促进hydatide包虫病患者的生存的(5]。

感染棘球绦虫及其发病机理报道,可以代表一个优秀的模型加深与免疫抑制活性细胞和体液机制之间的关系(29日]。缺乏研究的B细胞的活性调节的包虫病是特殊的意义的。这个细胞株调节免疫反应,这些细胞通常与生产相关的免疫抑制细胞因子il - 105]。

关于我们观察血管内皮生长因子(VEGF)的增加,缺乏文献中的数据可能将感染棘球绦虫在人类血清VEGF的修改。然而,这个因素的增加也可以发挥重要作用的病理生理学各器官囊肿的生长。neoangiogenic趋势肯定会鼓励殖民和囊肿的生长在深器官。这样的VEGF的作用已经被证明对于其他寄生虫,如裂体吸虫属spp。30.]。

的显著减少MCP-1观察在我们的研究可以作为“标记”的抑郁主机趋化因子,特别是巨噬细胞lineage-driven体液因子。没有数据在文献中关于人类与血清MCP-1水平棘球绦虫感染。在BALB / c小鼠,实验感染棘球绦虫早期血清产生这些趋化因子的增加,后跟一个减少血清水平(31日]。

MCP-1应该减少相关的损伤作用的专业先天防御细胞的治疗棘球绦虫。

修改的硝酸盐和亚硝酸盐的含量,评价作为一氧化氮的代谢物,似乎表明这些参数浓度升高之前手术和医疗(T-0)的囊肿。同样的分析物的水平显著降低治疗后一周(t - 1) ( 实质性的方式与T-0)和再次爬上1 - 2个月后(2)的治疗。这种行为似乎与高水平的一氧化氮相关感染棘球绦虫;事实上,其根除与一氧化氮水平的下降。等其他调查人员发现一氧化氮时间均减少,支持可能没有参与反棘球绦虫活动(32]。最后,分析物的水平上升1 - 2个月后似乎表明,至少对一些病人来说,要么metacestode转移扩散到其他组织和器官,或再生的幼虫在同一个网站。

矛盾的是,一氧化氮,据报道parasiticidal分子,直接影响protoscolices和囊肿信封(33),应有利于抵抗寄生虫宿主。然而,一氧化氮被发现,一旦发布的巨噬细胞,有一个潜在的有害影响淋巴细胞的功能,导致蛋白质氧化,脂质过氧化反应和DNA基础(修改和链断裂34]。权衡应该通过这种寄生虫,为了抑制氮自由基,而不抑制其释放许多宿主免疫细胞(如巨噬细胞)。过去是守恒的抗氧化蛋白酶释放的棘球绦虫,据报道能够防止损害等寄生虫由于高活性自由基(29日]。

4所示。结论

本研究试图传播光明在卡拉布里亚地区一个公共卫生问题。据我们所知,研究棘球绦虫感染扩散在卡拉布里亚地区非常稀缺。目前的数据清楚地演示了一个省的流行蔓延Catanzaro和邻近地区这样的寄生虫病,以及小说的数量问题棘球绦虫来华的女性克服受感染的男性。

另一方面,可能缺乏抗体的血清样本棘球绦虫病人应该呼吁新实验室的识别标记等的诊断寄生虫疾病。因此,研究介质在目前的工作,特别是我们的小说发现增加的VEGF和降低血清MCP-1研究情况下,值得进一步评估除了已知增加il - 10。总的来说,TNF的缺失α和干扰素γ与il - 10的增加,可能会建议一个系统性公平寄生虫造成的免疫抑制和/或其产品。这样的subversion的免疫防御系统可能支持维护的慢性感染棘球绦虫矛盾的是在这些器官(如肝脾)相当丰富与先天防御细胞如巨噬细胞。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

乔凡尼马泰拉构思研究,起草了手稿,并参与其设计。Maria Teresa洛里亚导致收集和处理生物样本和列表的数据进行统计分析。Cinzia Peronace贡献起草和编辑的手稿。塔蒂阿娜Catanzariti Pio Settembre进行血清学检测。Aida Giancotti导致执行和验证血清学检测。安吉洛•兰和乔治·s·Barreca导致了分子生物学测试,并讨论了相应的数据。路易莎加拉茨进行了一些细胞和分子过程。Gessica先锋军了搞笑类和子类的评估。玛利亚玛兹泰利和塞Strazzulla导致病人评估和收集临床资料。卡洛托提了诊断和治疗执行。 Angela Quirino contributed in the drafting and editing of the manuscript. Maria Carla Liberto discussed molecular data and contributed to the drafting and editing of the manuscript. Alfredo Focà conceived the study and participated in its design and coordination. All authors read and approved the final manuscript.

确认

提供的金融支持研究完全是Catanzaro大学授予RICEFOC-01;收件人:教授阿尔弗雷多恰城对妇女实施)。