文摘
几项研究表明,姜黄素及相关化合物具有抗氧化和消炎作用包括调制的脂多糖(LPS)介导的信号在细胞巨噬细胞模型。我们这里研究了姜黄素的影响和两个无关的结构类似物GG6 GG9在人类血液主要巨噬细胞以及所涉及的信号通路。7天从外周血单核细胞巨噬细胞分化与LPS激活或选择性toll样受体受体激动剂24 h。测试化合物对细胞因子的影响生产和immunophenotypes CD80评估+/ CCR2+和CD206+/ CD163+子集进行ELISA和流式细胞术。信号通路被免疫印迹探测。姜黄素(2.5 -10μ米)未能抑制LPS-induced炎症反应。虽然GG6 LPS-induced我减少κB -α退化和显示interleukin-1减少的趋势β释放,GG9阻止了促炎CD80的增加+的差别,巨噬细胞子集对这些抗炎CD206+/ CD163+p38磷酸化子集,增加,增加cell-bound interleukin-1分泌βLPS刺激,至少部分通过信号通路不涉及toll样受体4和核因子-κb .因此,姜黄素类似物GG9减毒LPS-induced炎症反应在人类血液中巨噬细胞和因此可能代表一个有吸引力的为巨噬细胞药理针对化学模板。
1。介绍
巨噬细胞的一个关键特性是能够根据环境刺激“裁缝”他们的反应。炎性因子,如脂多糖(LPS)和干扰素-γ(IFN -γ)诱导炎性表型,促进TH1效应响应和抗菌和tumouricidal属性。有限合伙人/干扰素-γ激活细胞有效的效应分子生产商(活性氮和氧中间体)和促炎细胞因子,如白细胞介素- 6 (il - 6)、il - 1β,肿瘤坏死因子-α,同时诱导upregulation与抗原表达相关的分子,如主要组织相容性复合体II类和costimulatory分子CD40, CD80和CD86 [1]。巨噬细胞的表型被称为“经典”激活巨噬细胞或M1。相比之下,刺激巨噬细胞与细胞因子il - 4或IL-13等导致了“另类”激活状态或平方米,特点是低水平的炎症细胞因子il - 12和IL-23等,和高水平的抗炎细胞因子il - 10的清道夫,galactose-type,甘露糖受体(MR或CD206)。一般来说,il - 4 / IL-13-activated细胞参与极化Th2反应,寄生虫清除,抑制炎症反应,促进组织改造,血管生成,肿瘤进展和免疫调节2]。具体macrophage-targeted疗法正在进入临床调查。此外,治疗方法不像macrophage-oriented最初设计或特定影响巨噬细胞激活和极化(3]。因此,识别相关药理代理人影响人类巨噬细胞的功能活动。
多酚姜黄素,主要生物活性成分的根状茎姜黄l。亚洲热带植物属于姜家人(姜科),长期以来一直研究了它的各种治疗属性(4,5]。反式-的存在α,β不饱和羰基脚手架(称为hepta-1 4 6-trien-3-one结构图案),作为一个迈克尔受体系统,被认为是参与其作用机理(6]。这种化合物可以调节多个信号分子如转录因子、酶和二级信使,从而控制多种基因的表达,可能是有效的疾病状况与调节受损有关,这样的信号通路(7]。特别是,姜黄素可以减少LPS-induced激活和释放炎性细胞因子的小胶质细胞和巨噬细胞8- - - - - -13]。我们和其他人证明姜黄素及相关化合物防止核转录因子的激活-κB (NF -κB),一个转录因子,调节许多基因参与炎症反应的起始13,14]。这多酚也影响immunophenotype LPS-activated人类THP-1巨噬细胞,特别是M1标记的表达是通过NF -调制κB通路(10,15]。有趣的是,姜黄素不仅直接诱发小鼠RAW264.7巨噬细胞的极化M2表型也促进了M1-to-M2表型开关(16]。最近,高et al。17)表明,姜黄素诱导巨噬细胞M2极化增加il - 4的生产和/或IL-13转录6-dependent信号传感器和催化剂的方式。这些发现也被复制在活的有机体内在疾病实验模型17,18]。基于这些观察,姜黄素及其类似物代表有前途的铅化合物目标免疫细胞激活。
toll样受体(通常是一个家庭的跨膜蛋白在先天免疫系统中发挥关键作用。通常一般作为为存在(尽管TLR2-TLR6和TLR1-TLR2形成报告)和巨噬细胞等免疫细胞。十人通常已确定到目前为止,所有这一切人类巨噬细胞表达在细胞表面或在核内体19]。主要由TLR4-MD-2 LPS信号介导的激活和二聚20.]。先前的研究表明姜黄素的抑制作用及其结构相关bisdemethoxycurcumin (GG6),携带hepta-1, 4, 6-trien-3-one支架,而GG6-based吡唑模拟(GG9)是不活跃的13]。
这广泛的文献处理姜黄素的药理作用和类似物对免疫细胞功能,我们所知,没有扩展到人类的血液巨噬细胞。这可能是由于啮齿动物和人类之间的差异有关免疫反应以及许多巨噬细胞细胞模型中使用(21,22]。此外,生物利用度差,快速代谢,姜黄素的副作用中观察到的一些研究(23,24)提供了动力发展与改进的药效学和药代动力学性质[curcumin-based类似物25]。本研究旨在探讨姜黄素的影响和curcumin-based类似物GG6 GG9 [13在il - 1β人类monocyte-derived释放激活巨噬细胞以及所涉及的信号通路。GG9的影响巨噬细胞immunophenotypic标记表达和cell-bound il - 1β也通过流式细胞仪检测。
2。材料和方法
2.1。材料
RPMI 1640年从Lonza购买(瑞士巴塞尔),和抗生素溶液(100 U /毫升青霉素和100年μg / ml链霉素)是从表达载体Inc .(卡尔斯巴德,CA,美国)。单克隆反我κB -α,phospho-p38增殖蛋白激酶(MAPK), glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)抗体的细胞信号(丹弗斯、马、美国)。辣根peroxidase-conjugated二级抗体来自向量(英国彼得伯勒)。Anti-CCR2马伯,anti-CD163马伯,anti-IL-1β马伯,brefeldin、修复和烫缓冲解决方案从eBioscience / Affymetrix(美国圣克拉拉的CA);anti-CD80马伯和anti-CD206马伯BD Pharmigen生物科技公司(美国圣地亚哥,CA)。完整的™抑制剂鸡尾酒是罗氏诊断(德国曼海姆)。胎牛血清的边后卫,Ficoll-Paque密度(1.077±0.001),Percoll,地塞米松,姜黄素,cli - 095,脱脂奶粉以及其他分析年级化学药剂来自Sigma-Aldrich。超纯有限合伙人(LPS-EB),酵母聚糖(ZYMO) Pam3CSK4,保利(我:C)来自InvivoGen(美国圣地亚哥,CA)。il - 4、IL-13和集落刺激因子- 1 (CSF-1)来自ImmunoTools (Friesoythe,德国)。姜黄素类似物GG6和GG9合成其他地方描述(13]。
2.2。细胞培养
人体外周单核细胞(PBMCs)分离鉴定提供的巴菲外套单位帕多瓦大学医院输血。聚蔗糖分离后,PBMCs使用Percoll密度梯度分离获得纯粹的单核细胞。单核细胞和淋巴细胞的分离进行了高密度高渗的Percoll密度梯度:PBMC悬架,包含150 - 200×106细胞,在上面一层1:3.33毫升比率。离心后60015分钟,细胞无血清培养系统在接口收集和清洗RPMI 1640年统计,播种在24——或者48-well板的密度或60毫米菜表示5×104细胞/厘米2RPMI 1640 + 10%的边后卫在20 nM CSF-1 [26]。细胞培养在7天37°C和5%的公司2,媒介改变了每3天,添加新鲜。
2.3。协议的极化激活
巨噬细胞的分化,种子在60毫米菜洗和极化对M1表型通过孵化有限合伙人(100 ng / ml)或M2表型孵化与il - 4 (20 ng / ml) + IL-13 (5 ng / ml),分别为24 h RPMI + 10%的边后卫描述(27]。应该指出,商业来源有限合伙人经常被其他细菌污染组件,如脂蛋白,激活也TLR2的能力。相比之下,这里使用超纯LPS-EB只激活TLR4 (InvivoGen)。以前测试化合物浓度(7.5μ姜黄素,2.5和7.5μM GG9, 7.5μM GG6,或1μcli - 095) [13)添加了极化激活前30分钟。在选定的实验中,如果(M0)巨噬细胞挑战24 h和100海里地塞米松或7.5μM GG9。
2.4。Immunophenotyping
巨噬细胞的激活,被轻轻地刮收获文化板块磷酸盐(PBS)包含5毫米EDTA,收集在圆底管immunolabeling (BD生物科学)和resuspended 106100年/毫升μl PBS的边后卫阻止Fc受体为2%。这些文化首次评估染色细胞纯度PE-anti-CD14 (20μl / 106细胞)。巨噬细胞被染色30分钟在黑暗中与fluorochrome-tagged单克隆抗体表面CD80-FITC (20μl / 106细胞)和CCR2-APC (10μl / 105细胞)来识别M1表型和CD206-FITC (20μl / 106细胞)和CD163-PE (20μl / 106细胞)描述M2表型(27- - - - - -29日]。孵化后,样品被清洗,并于250年暂停μl PBS / EDTA和10000事件/样本为每个管记录使用FacsCanto二流式细胞分析仪(BD生物科学)。数据分析使用FacsDiva软件(BD生物科学)。Isotype-matched控制被用作参考。
2.5。细胞内细胞因子的生产
细胞内细胞因子的生产也是评估使用流式细胞仪。CSF-1分化后,巨噬细胞被刺激与有限合伙人(100 ng / ml)或其他TLR配体如酵母聚糖(10μPam3CSK4 (0.3 g / ml)μg / ml),聚(我:C) (50μg / ml) 24小时的RPMI + 10%的边后卫。Brefeldin (10μ过去4 h M)添加干扰细胞因子的分泌。的刺激,细胞被轻轻刮盘子文化收获1毫升PBS包含5毫米EDTA和2%的边后卫,固定为100μl通过添加2毫升4%多聚甲醛溶液和permeabilized烫缓冲溶液含有叠氮化钠皂苷0.1%和0.009%。细胞被离心机在300的两倍5分钟和100年孵化μl烫缓冲溶液在FITC-anti-IL-1的存在β(5μl / 106在黑暗中细胞)为20分钟。随后,细胞被清洗和resuspended在250年μ10000 - 50000 l PBS / EDTA和事件/每个管记录的样本。
2.6。免疫印迹
在60毫米菜极化激活后,细胞与PBS和收获150年洗一次μl裂解缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.4,150毫米氯化钠,NP-40 1%, 25毫米氟化钠,钠脱氧胆酸盐0.5%,10% SDS, EGTA 1毫米,1毫米原钒酸钠、焦磷酸钠10毫米,1毫米phenylmethylsulfonylfluoride鸡尾酒和完整的蛋白酶抑制剂(罗氏)。每个样本包含两个汇聚板块和储存在−20°C,直到进一步的分析。蛋白溶解产物在100°C为5分钟加热变性蛋白质,和40μg的每个样本(蛋白质含量是衡量使用洛瑞法)加载到10% SDS /聚丙烯酰胺凝胶和运行在120 V 1 h。蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物膜,非特异性结合位点被5%的牛奶1米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.4,5 M氯化钠和0.1%渐变20 1 h在室温下,洗,然后我主要孵化与特定的抗体κB -α、磷酸化p38 MAPK和GAPDH (1: 1000)。膜与适当的辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体(1:5000)和免疫反应性的乐队使用增强化学发光检测。带强度归一化GAPDH和测量使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)。
2.7。免疫荧光
巨噬细胞种植在盖玻片12-well盘子和1 h和7.5进行预处理μ姜黄素,GG6、GG9或1μcli - 095,然后用100 ng / ml超纯LPS-EB刺激额外的90分钟。细胞被固定为4%多聚甲醛(pH值7.4,在室温下15分钟),随后封锁了5%正常山羊血清在PBS / 0.1% Triton x - 100 1 h描述[30.]。细胞培养用鼠标anti-p65抗体(NF -κB p65, 1: 500;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)后跟一个Alexa萤石555 -共轭anti-mouse二级抗体(1:1000;英杰公司)。核沾染了4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPIσ),和盖玻片是安装在显微镜载玻片Fluoromount-G安装介质(热费希尔科学、意大利米兰)。荧光图像p65染色被捕共焦激光扫描显微镜(蔡司LSM 800;德国卡尔蔡司AG)从)与禅宗2.0成像和分析软件(卡尔蔡司AG)。
2.8。细胞因子释放
单核细胞被播种在24-well板密度106细胞/好,可以区分为7天如上所述。使用1细胞被启动μ采用无血清g / ml有限合伙人RPMI 24 h在姜黄素类似物的存在与否浓度选择基于初步实验。细胞上清液被收集并存储在−20°C到分析。细胞溶解产物通过添加40就做好了准备μl裂解每个解决方案。il - 1的含量β在培养基和细胞溶解产物是由商业化酶联免疫试剂盒根据制造商的指示(Antigenix美国,亨廷顿站,纽约,美国)。的il - 1βELISA试验设备不区分不活跃31-kDa前体(pro-IL-1β17)和生物活性kDa成熟形式(商用工具)一样。标准曲线是用来获取样本il - 1β浓度(pg / ml)。
2.9。统计分析
使用棱镜执行统计分析软件(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。数据表示为±SEM。t以及方差分析或随后Bonferroni事后测试是用于对比样本。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。吡唑姜黄素类似物(GG9)对巨噬细胞活化表型
然后我们进行流式细胞仪实验研究巨噬细胞激活。姜黄素和GG6解决方案的黄颜色干扰激光流式细胞分析仪检测,所以两种化合物被排除在这组分析。地塞米松(余生)作为参考抗炎剂是基于以前的工作(27]。GG9可能造成的影响,在immunophenotypes noncytotoxic浓度比较的cli - 095块信号介导的细胞内而不是细胞外TLR4的域31日]。细胞被使用用(100海里),cli - 095 (1μ米),或GG9 (7.5μM)为30分钟,随后孵化24 h和新鲜媒介获得休息巨噬细胞(M0)或有限合伙人或il - 4 / IL-13获得巨噬细胞激活M1和M2表型,分别。代表细胞表面如图CD80水平1(一)。治疗与有限合伙人而il - 4 / IL-13 24小时显著诱导细胞的分数表达M1 CD80标志(图1 (b))由GG9显著抑制、用和cli - 095。而CCR2的变化+细胞由有限合伙人不显著(数字1 (c)和1 (d)),用但不是GG9或cli - 095显著降低这个细胞族群与静息细胞。预处理的用显著预防upregulation M1 (CD80+/ CCR2+)细胞由有限合伙人(0.7±0.3%和3.0±1.0%, , ;数据2(一个)和2 (b)),而一个无意义的趋势的观察抑制GG9和cli - 095。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
我们接下来研究了M2标记CD163调制和CD206(图3(一个)有限合伙人或il - 4 / IL-13)后激活。正如所料,CD206的分数+/ CD163+增强细胞的il - 4 / IL-13与静息细胞(图3 (b))。相比之下,促炎与LPS激活急剧下降的比例M2巨噬细胞用治疗恢复的(5.9±2.0和1.1±0.4%, )。同样,GG9 CD206。差别显著预防LPS-induced对这些+/ CD163+细胞(3.4±1.0和1.1±0.4%, ;图3 (b)),cli - 095(3.4±0.8和1.1±0.4%, , )。同样的模式在细胞表达每一个平方米标记(数据未显示)。为了评估可能直接影响GG9 M2极化,如果巨噬细胞的实验是重复的。治疗用24 h CD206的比例明显增加+/ CD163+亚种群对未经处理的巨噬细胞(8.8±2.2和3.4±0.9%, , ),如之前我们小组发表的(27]。相比之下,GG9治疗并不影响CD206的百分比+/ CD163+细胞(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.2。姜黄素的影响,GG6 GG9 LPS-Induced信号
我们以前报道,姜黄素和GG6 GG9不同,抑制NF - LPS-induced激活κB在初级鼠小胶质细胞(13]。然而,如上所示,GG9是有效预防costimulatory CD80分子的增加,引起强烈的M1偏振膜标记,有限合伙人通过转录机制(15,32]。识别潜在的信号通路潜在GG9 immunophenotype发现,我们测量κB -αNF -所需的退化κ转录激活。在大鼠小胶质细胞相比,我κB-α退化引起的一个30分钟的挑战与有限合伙人被姜黄素(图不变4)。同样,预处理GG9并不影响这个途径,而GG6和更多的抑制剂TLR4信号转导cli - 095年显著增加κB -α水平相比,有限合伙人(图4(a))。我们也评估LPS-induced易位的NF -κB p65免疫荧光和证实GG6和cli - 095是唯一影响NF -化合物κB通路在细胞模型中用于这项研究(数据4(b-g))。
因为p38激酶反应压力,如细胞因子刺激和姜黄素抑制p38 MAPK磷酸化在原始264.7小鼠巨噬细胞(33),immunodetection phospho-p38相似条件下进行。而与姜黄素预处理和GG6,分享arylhepta-1, 4, 6-trien-3-one结构性主题,未能影响LPS-induced p38磷酸化,预处理GG9和cli - 095显著降低p-p38水平(图5)。这些数据表明吡唑的重要性函数有限合伙人的规定人类monocyte-derived巨噬细胞信号。
3.3。测试化合物对il - 1的影响β生产TLR配体引起的
M1的功能性读出anti-LPS影响表型标记由GG9(图所示1)是细胞因子的生产。与LPS刺激巨噬细胞导致增加促炎细胞因子的生产。这确实是对cell-bound il - 1β(数据6(一)和6 (b))LPS-stimulated细胞与之相比,如果水平检测细胞的流式细胞术。LPS-induced细胞il - 1的积累β显著降低了预处理与7.5μM GG9和1μM cli - 095 ( ;图6 (b))。
(一)
(b)
因为GG9显示il - 1的药理作用β生产在人类巨噬细胞与大鼠小胶质细胞(13),我们探索其潜在干扰额外通常可能涉及不同的信号通路。流式细胞术的cell-bound il - 1β试验重复使用TLR有限合伙人以外的配体。酵母聚糖、酵母TLR2和TLR2 / TLR6受体激动剂,显著增加了il - 1β+分组人口显著降低约40%与GG9预处理后(图7)。TLR3活化剂保利(我:C),双链RNA的合成类似物,是效果低于TLR2 / TLR1增加il - 1受体激动剂Pam3CSK4β+不变的分组人口与GG9预处理后在这两种情况下(图7)。可以想象,GG9可能干扰TLR2在人类巨噬细胞炎症反应。
由于姜黄素的功能作用和GG6不能使用流式细胞仪检测,我们测量il - 1β释放LPS-stimulated巨噬细胞(参见[13])。基底il - 1β释放CSF-1-differentiated巨噬细胞在缺乏inflammasome活化剂几乎被ELISA(数据未显示),符合最近的研究(34]。与LPS刺激24小时释放il - 1的显著增加β到介质(39.5±14.8 pg / ml, ;图8)。值得注意的是,人类巨噬细胞释放il - 1低大约10倍β比主要鼠小胶质细胞(9),捐助者之间有着明显的变化。预处理和GG9 cli - 095显著降低il - 1β发布不到10%的有限合伙人级别(图8),按照图中的数据6。相比之下,GG6走向衰减的趋势LPS-induced il - 1β释放没有达到统计学意义,姜黄素诱导没有明显效果。
我们详细分析了il - 1β通路的极化巨噬细胞通过测量mRNA水平NLRP3 inflammasome。显著减少LPS-induced细胞积累(图6)和释放(图8)il - 1β与GG9和CLI预处理后与增加的趋势NLRP3 mRNA水平(图S3)。支持的潜在参与NLRP3 inflammasome GG9行动,我们表明,该代理没有影响TNF -α细胞的积累,这是独立于inflammasome激活(图S4)。这些数据表明,GG6 GG9微分干扰和冗余的人类巨噬细胞炎症信号通路。
4所示。讨论
在这项研究中,我们调查的影响是否天然curcuminoids姜黄素和bisdemethoxy姜黄素(GG6),连同吡唑模拟得到GG6环合,在巨噬细胞immunophenotype报道和功能不同的细胞类型可以复制人类monocyte-derived巨噬细胞。但出乎意料的是,姜黄素无效的对所有研究端点,而GG6和GG9微分药理档案显示,只有部分符合这些观察到的主要鼠小胶质细胞(13]。
虽然我们无法测试姜黄素和GG6通过流式细胞术由于他们的解决方案的黄色,GG9阻止upregulation CD80表达引起LPS激活(15,32),从而衰减M1极化。在CD80 GG9的效果+/ CCR2+然而,子集,不显著(图2),如CCR2的分数+细胞LPS激活(图后持平1 (b))。与先前的研究相比与姜黄素(17),GG9没有影响M2如果细胞表型,但抗炎CD206下降抵消+/ CD163+LPS引起的子集(27,29日]。这些发现表明,GG9能够干扰转录机制upregulation costimulatory分子如CD80、但不是脱敏和内化途径主要管理水平表面G-protein-coupled受体CCR2(等35]。相比之下,地塞米松治疗减少了CD80+/ CCR2+,提高了CD206子集+/ CD163+LPS-treated和未经处理的巨噬细胞(数据子集3 (b)和3 (c))。从几个细胞模型的结果这是一致的27,36,37),这表明地塞米松GG9不同,导致直接影响M2巨噬细胞极化。
pathogen-mediated TLR激活机制、信号和下游炎症反应都进行了广泛的调查。10通常表现在人类作为单体或通过组装形成信号MyD88-dependent MyD88-independent通路,聚集在激活的转录因子。特别是,LPS-mediated激活TLR4与MD2刺激的磷酸化(激活)MAPKs p38和NF - c-Jun n端激酶和激活κB-dependent基因转录(38]。因此,专门通过抑制信号介导的细胞内而不是TLR4胞外域,cli - 095 LPS-induced我恢复κB -α退化和p38磷酸化(39]。我们观察到预处理GG9干扰p38-MAPK通路,而GG6大大阻止了我κB -αNF -所需退化κB激活。这符合diaryl-hepta-1微分结构与活性关系,4,6-trien-3-one GG6脚手架和吡唑模拟GG9中描述的主要鼠小胶质细胞(13),GG9不调节LPS-mediated TLR4-MD2信号。这里,我们展示了不同的两个类似物的药理档案扰乱或重定向LPS信号在人类巨噬细胞。与大鼠小胶质细胞(13)和其他细胞类型(10,40- - - - - -42]在更高浓度可能是使用,姜黄素LPS-induced信号和il - 1的影响β在人类monocyte-derived巨噬细胞释放。这可能是由于物种TLR表达模式的差异以及TLR4和MD2氨基酸相似性和结构特点43- - - - - -45),从而导致减少在人类和啮齿动物细胞,姜黄素的潜力。然而,缺乏行动的姜黄素相比,其bisdemethoxy-derivative GG6仍然无法解释。应该认为GG6,由于缺乏姜黄素的甲氧基功能独特,有更多的亲水特征与姜黄素相比,边芳基环上的羟基功能没有参与分子内氢键与邻甲氧基。因此,这种行为可能占GG6[的优良的化学稳定性46]。
LPS-induced抑制细胞因子的功能分析生产显示额外的药理的差异GG6 GG9。安倍et al。47)第一次表明,姜黄素能抑制炎性细胞因子生产人类外周血单核细胞。然而,我们无法显示任何这样的姜黄素对巨噬细胞的影响,和负面趋势GG6限制LPS-induced il - 1β释放没有达到统计学意义。人类巨噬细胞在缺乏inflammasome活化剂分泌il - 1量要少得多β比主要鼠小胶质细胞与LPS刺激后(9),从而使它更难以评估药理抑制剂的潜在影响。此外,我们无法确定任何潜在的il - 1的相关性βGG6数据(和姜黄素)对M1 immunophenotype的影响,因为如上所述,这些化合物是不适合流仪测定。然而,尽管在塑造immunophenotype极化激活协议至关重要,功能分析需要在调查药物靶向巨噬细胞。GG9是一样有效的TLR4信号抑制剂cli - 095在减少LPS-triggered il - 1β生产,即使GG9并不影响NF -κB通路激活TLR4(有限合伙人;图4)或TLR3(保利(我:C) (48])配体。鉴于il - 1β发生在细胞作为主要nonsecreted proform和裂解可发布的成熟形式(49)和p38 MAPK通路参与了il - 1β在人类巨噬细胞(分泌50),这种机制(图5)的差别也许可以解释观察到的对这些LPS-stimulated il - 1的合成和释放βGG9。因为il - 1的生产β是由一个两步机制(51),GG9也可能阻止il - 1β成熟,所述THP-1姜黄素的细胞(12]。支持的潜在参与NLRP3 inflammasome GG9行动,我们表明,该代理没有影响细胞积累TNF -α,这是独立于inflammasome激活(52]。
总的来说,这些结果表明微分结构GG6和GG9受体水平的交互作用。我们的解释是,diaryl-hepta-1 4 6-trien-3-one脚手架GG6 LPS-induced干扰信号转导主要通过TLR4 / MD2和下游激活复杂的NF -κB(图4;参见[13]),而GG9影响部分重叠,但不同,路径可能包括MyD88-independent TLR4 [53)和/或TLR2信号(图7)。事实上,GG9干扰TLR2 / TLR6信号耦合到p38 MAPK激活(54)和可能calcium-dependent calmodulin-dependent kinase-Pyk2-extracellular signal-regulated激酶信号通路激活酵母聚糖在人类血液中巨噬细胞(55]。TLR2发炎人体组织内巨噬细胞表达水平升高(56,我们的数据支持TLR2在炎症反应的相关性在活的有机体内。最后,一个有趣的可能性,尽管有限的证据支持,TLR4与TLR2 associates形成TLR2-TLR4形成(57),这可能很好地调整有限合伙人光谱信号,并可能扩大配体。
5。结论
总的来说,这些结果支持假设姜黄素衍生品影响人类monocyte-macrophage immunophenotypes扰乱LPS信号和功能。两个类似GG6 GG9,结构特点是相同的芳基环和一个不同的核心,显示一个微分通过抑制NF -药理κB或p38 MAPK通路分别,可能造成绑定到不同的TLR亚型。促进macrophage-protective表型已经成为治疗炎症性疾病的治疗目标,识别的因素,控制细胞的激活是目前一个活跃的研究领域。现在的研究结果表明,姜黄素类似物GG6和GG9代表有前途的铅化合物目标免疫细胞激活。
缩写
| APC: | Allophycocyanin |
| CSF: | 集落刺激因子 |
| 的边后卫: | 胎牛血清 |
| FITC: | 异硫氰酸荧光素 |
| IL: | 白介素 |
| 干扰素: | 干扰素 |
| 有限合伙人: | 脂多糖 |
| MAPK: | 增殖蛋白激酶 |
| 尼克-弗瑞: | 核转录因子 |
| 体育: | 藻红蛋白 |
| RPMI: | 罗斯威尔公园纪念研究所的媒介 |
| TLR: | toll样受体。 |
信息披露
没有参与的资金来源的收集、分析、解释数据;在报告的写作;在决定提交出版的文章。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
莫雷纳Zusso, Chiara Bolego Pietro Giusti和安德里亚Cignarella构思和设计实验。Trenti塞雷娜特德斯科劳拉Facci安娜莉莎,卡洛塔Boscaro进行了实验。Federica Belluti合成提供了GG6和GG9。瑟瑞娜。泰莫雷纳Zusso劳拉Facci,吉安保罗Fadini, Chiara Bolego分析数据。安德里亚Cignarella和斯蒂芬·d·圣伽步写的论文。所有作者阅读和批准最终的手稿。瑟瑞娜达利和莫雷纳Zusso同样对本文亦有贡献。
确认
这项工作是由“Progetto di Ateneo,”意大利degli研究di帕多瓦(CPDA144389/14莫雷纳Zusso),意大利,Chiara Bolego机构资金和安德里亚Cignarella。
补充材料
补充图1:人类血液单核细胞生长在RPMI + 10%的边后卫和分化成巨噬细胞在20 nM CSF-1 37°C和5%的7天有限公司2。的分化,巨噬细胞生存能力是衡量MTT测定姜黄素治疗后,GG6, GG9 (2.5 -10μ米)24 h。数据表示为意味着原始吸光度值(±SEM) 3独立实验一式三份。补充图2:姜黄素的影响,GG6 GG9, cli il - 1 - 095β积累在LPS-stimulated人类巨噬细胞。分化后,巨噬细胞被使用车辆,姜黄素,GG6 GG9, cli - 095为30分钟表示刺激1紧随其后μg / ml有限合伙人的24小时FBS-free RPMI brefeldin (10μ过去4 h M)扰乱细胞因子分泌途径。对il - 1细胞溶解产物收集和分析β通过ELISA释放。条形图表示的意思是(±SEM) 6个独立的实验。 对有限合伙人。补充图3:人类巨噬细胞NLRP3 mRNA水平。互补脱氧核糖核酸的休息,LPS-stimulated M1和测试agent-pretreated M1巨噬细胞被qPCR化验后90 - min LPS孵化。GAPDH担任加载控制。酒吧代表三个独立实验的平均(±SEM)。补充图4:GG9和cli - 095对cell-bound肿瘤坏死因子的影响α在LPS-stimulated巨噬细胞表达。分化后,巨噬细胞被使用GG9或cli - 095为30分钟,然后孵化有限合伙人在37°C 6 h RPMI + 10%的边后卫brefeldin (10μ过去4 h M)扰乱细胞因子分泌途径。流式细胞术分析之前,固定/ permeabilized细胞被沾染了anti-TNF -α抗体(eBioscience)。荧光情节来自代表实验(面板),和酒吧图表表示的意思是(±SEM) 5独立的实验(面板B)。 和休息; 对有限合伙人。GG6,在初步试验中,用姜黄素治疗或GG9浓度在-10年以前的工作(2.5测试μ米)(11,13)24小时没有妥协的可行性人类monocyte-derived巨噬细胞MTT试验测量(图S1)。LPS-induced细胞il - 1的积累β显著降低了预处理与7.5μM GG9和1μM cli - 095以ELISA(图S2)。这是与增加的趋势(图NLRP3 mRNA水平S3)。此外,对肿瘤坏死因子- GG9没有影响α细胞的积累,这是独立于inflammasome激活(图S4)。(补充材料)