文摘
人类腺病毒感染(副词)负责大部分的婴儿和儿童的社区获得性肺炎,导致每年重要的儿童发病率和死亡率。小分子核糖核酸(microrna)与病毒复制和宿主免疫反应有关。知道microrna的表达谱将有助于理解microrna的作用在调节腺病毒感染的宿主反应和可能提高adenovirus-infected肺炎的诊断。在我们的研究中,总RNA从全血中提取adenovirus-infected肺炎儿童和健康对照组被小RNA深测序分析。表达谱全血小分子核糖核酸的改变和adenovirus-infected孩子截然不同。前三调节microrna (hsa - mir - 127 - 3 - p, hsa - mir - 493 - 5 - p,和hsa - mir - 409 - 3 - p)被发现在adenovirus-infected儿童和提供了明确区分感染和健康的人。建立和验证了潜在的宿主靶基因研究中存在小分子核糖核酸在宿主基因的影响。大多数的目标基因参与了MAPK信号通路和先天免疫反应。这些高度调节小分子核糖核酸可能至关重要的角色在副词发病机理和潜在生物标志物adenovirus-infected肺炎。
1。介绍
人类腺病毒感染(副词)负责大部分在婴儿和儿童社区获得性肺炎1,2]。难以引起感染5 - 10%的上、下呼吸道感染儿童,导致肺炎和每年近130万人死亡的儿童3,4]。未经治疗的重症肺炎的死亡率或传播疾病引起的副词甚至超过50%5,6]。没有有效的抗病毒药物阿德直到现在。此外,阿德的传统诊断感染是有限的。因此,发现病毒和宿主之间的相互作用将帮助我们找到新的治疗和诊断之感染。
人类阿nonenveloped双链DNA病毒,属于Adenoviridae家族(7,8]。人类副词分为七组包括53个血清型基于免疫学和生物学特性。难以复制的有效地在人类细胞和触发器等先天免疫反应在宿主细胞炎症反应。同时,病毒感染已被证明有一个伟大的对细胞的影响小RNA表达和基因表达9- - - - - -11]。人感染宿主细胞通过绑定到不同的细胞受体如柯萨基病毒和腺病毒受体(CAR) (12]。在阿德DNA复制,宿主细胞蛋白质核转录因子等我和POU2F1使用副词(13,14]。反过来,主机将触发一个先天免疫反应对人感染。然而,阿德和主机交互的细节定义仍然不佳。
小分子rna是重要的监管机构,调整发展,增殖,分化,细胞凋亡的生物(15,16]。小rna包括微rna (microRNA),核,扶轮基金会,piRNA, rasiRNAs,调节基因的表达在一个广泛的过程,如病毒复制和宿主的免疫反应。microrna是最被充分研究过的小分子rna在最近的几十年。microrna是非常重要的监管机构,调节转录组变化(17]。microrna调节基因的表达在多种生理和病理过程,如在免疫反应和病毒复制18]。尽管microrna在睡觉类型检查3-infected喉上皮细胞和难以类型2-infected人类肺成纤维细胞(19,20.),没有研究小RNA分析全血Adv-infected肺炎的孩子。在我们的研究中,我们试图呈现不同的microrna的概要文件之间Adv-infected肺炎儿童和健康对照组,识别候选诊断生物标记与副词感染肺炎的儿童,并检查microrna在宿主防御反应Adv-infected孩子。
2。材料和方法
2.1。病人
整个血液样本用于研究获得广州市妇女儿童医疗中心。孩子被诊断为人类难以肺炎被纳入研究。人类之至的诊断肺炎被认为是某些时候与以下标准:(1)下呼吸道和/或全身性的症状,(2)肺渗透胸部x线摄影或计算机断层扫描(CT)扫描,和(3)人类难以IgM抗体阳性结果在人类血清和/或副词DNA PCR在咽喉拭子和/或支气管肺泡灌洗(BAL)流体。共有33个样本患者和健康志愿者的33个样本用于研究。所有患者的年龄(男性或女性)和健康志愿者(男性或女性)从一年到三年不等。伦理委员会批准的这项研究是在广州市妇女儿童医疗中心(编号2014121815),并从所有监护人书面知情同意了。
2.2。RNA提取和小RNA序列
病人和志愿者的血液样本中收集抗凝管。总RNA分离使用RiboPure™血液RNA隔离设备(美国Ambion)根据制造商的协议。提取的小分子rna治疗前与DNase深度测序。RNA浓度确定使用NanoDrop ND1000系统(热费希尔科学、南旧金山,CA),及其完整性验证了使用安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦科技)。如前所述(执行小RNA深测序21]。总共3样本病人和健康志愿者样本用于小RNA深测序研究。的临床特点,总结了3例健康志愿者和3表1。
2.3。细胞和病毒文化
人类原发性肺成纤维细胞(imr - 90)和人类293 t细胞生长在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (HyClone)补充10%胎牛血清(表达载体),链霉素,青霉素(表达载体)。病毒感染都是在无血清培养基进行1 h,紧随其后的是添加保存完整的媒介。
2.4。转染
microrna的抑制剂(GenePharma有限公司,中国)转染到imr - 90细胞与Lipofectamine RNAiMAX(英杰公司)100海里的最终浓度根据制造商的协议。
2.5。病毒增长分析
imr - 90细胞转染microrna的抑制剂被感染HAdV5(从病人隔离)在无血清培养基的莫伊10。感染后病毒滴度测定72 h斑块化验上执行293 t细胞(22,23]。
2.6。实时定量PCR(存在)的分析
执行中存在实验使用电力SYBR绿色PCR掌握混合。每一个反应是在10μ包含0.5 L卷系统μ0.5 L的cDNA、μ每个引物的L, 5μL电力SYBR绿色PCR反应混合液,3.5μL (ddH2o .的反应是孵化96孔板在95°C 10分钟,其次是39 95°C的周期15秒和62°C 1分钟。总RNA的microrna的定量,10 ng reverse-transcribed使用特定的茎环引物。U6作为内生控制。
2.7。数据分析
从miRBase microrna的集群和家庭信息(miRBase 20日http://www.mirbase.org/)是用来注释microrna的集群。microrna的靶基因预测基于两个软件:miRDB软件(http://mirdb.org/)和TargetScan软件(http://www.targetscan.org/)。
2.8。统计分析
数据分析使用GraphPad Prism 6.0软件(La Jolla、钙、美国)。双尾学生的以及用于确定两个实验组,每组之间的统计数据的意义。数据被认为是重要的 , , 。
3所示。结果
3.1。不同表情的小分子核糖核酸Adv-Infected儿童与健康的儿童
研究影响人感染细胞小RNA表达肺炎儿童,深度测序的小分子RNA进行了研究。因此,我们发现了一个明显的小RNA峰microrna(图21 - nt1(一))。当我们分析了不同表达的小分子rna, 118发现microrna表达的不同Adv-infected儿童与健康儿童在火山地块(图1 (b))。我们绘制了清洁读取从每一组已知的microrna的序列和识别出908 microrna Adv-infected儿童与健康对照组(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
此外,层次聚类分析差异表达microrna的图所示2。特别,77个差异表达microrna 6样品通过我们的叠化过滤器(log2褶皱 ),其中20个microrna表达高(读取1000供订购样本)和显示显著不同的表达式(表被选中作进一步分析2)。
3.2。验证差异表达的microrna
确认microrna的微分表达式副词患者与健康对照组,我们在研究中存在进行化验。结果表明,hsa - mir - 127 - 3 - p, hsa - mir - 379 - 5 - p, hsa - mir - 493 - 5 - p, hsa - mir - 409 - 3 - p, hsa - mir - 99 b - 5 - p, hsa - mir - 370 - 3 - p,和hsa - mir - 381 - 3 - p在整个调节血液样本5 Adv-infected儿童与健康对照组(图53(一个)),而hsa - mir - 101 - 3 - p, hsa - mir - 150 - 5 - p, hsa-miR-29a-3p, hsa - mir - 342 - 3 - p全血样本中表达下调5 Adv-infected儿童与健康对照组(图53(一个)),这相当与我们的测序数据。识别候选诊断microrna标志物,我们集中在调节microrna。更多的样本(15 Adv-infected 15与儿童健康对照组)收集验证调节microrna的表达(图3 (b))。从结果,我们发现hsa - mir - 127 - 3 - p, hsa - mir - 493 - 5 - p,和hsa - mir - 409 - 3 - p明显增加。之后,也消耗这些microrna microrna的抑制剂,病毒复制明显降低(图3 (c))。这些发现暗示我们选定的microrna可能反映了感染人,这样的microrna可能可以作为生物标志物候选人Adv-infected病人。
(一)
(b)
(c)
3.3。预测目标基因的差异表达microrna
研究microrna的生物学意义,然后预测microrna的计算目标基因。我们关注的目标验证microrna与不同的表达谱。浓缩的microrna的靶基因预测表明,目标基因主要参与细胞过程和分子功能(图4(一))。特别是,大多数的目标基因参与了MAPK信号通路和Ras信号通路(图4 (b))。的五大预测目标基因hsa - mir - 127 - 3 - p, hsa - mir - 493 - 5 - p,或hsa - mir - 409 - 3 - p表中列出3由两个microrna的microrna的目标分数最高的预测软件。
(一)
(b)
选择目标基因进行进一步的验证与存在,我们发现8基因的mRNA表达(PSMB5、ITGA6 MYCBP2, TCF7L2, UBE2V2, HIPK1, UBE2D2,和KANSL1)中表达下调Adv-infected患者与健康对照组(图5)。它们中的大多数都是转录因子或因素参与泛素的途径。mrna表达下调可能表明睡觉和Adv-induced肺炎感染的机制。
4所示。讨论
人类之儿童急性呼吸道感染的常见病原体。人类之感染的治疗是有限的,因为未来的随机治疗试验尚未完成。因此,它是非常重要的发现Adv-infected肺炎和搜索机制的生物标志物Adv-infected儿童肺炎。管理潜在的microrna是定义良好的,microrna的表达的不同的概要文件是不同的疾病,包括病毒感染的结果。在我们的研究中,我们发现Adv-infected儿童全血的microrna的概要文件是不同于健康的儿童。Adv-infected儿童的血液样本反映相关的病理学人感染,从而提供一个更好的理解疾病。
剖析的microrna的表达Adv-infected血液样本识别集群118 microrna显著改变。改变血液microrna的概要文件类似于细胞感染副词之前报道(19,20.),这表明microrna表达的不同确定在我们的研究可以作为候选诊断生物标记与副词感染肺炎的儿童。据报道,在这些不同的microrna表达,hsa-let-7e-5p参与复制的流感感染(24]。hsa - mir - 127 - 3 - p被报道通过针对影响eb病毒相关淋巴瘤PTEN-AKT-mTOR通路(25]。总之,这些microrna扮演重要角色在先天免疫反应或病毒复制,从而影响疾病的结果。
通过microrna的目标基因去分析,我们发现,大多数目标基因不同的microrna的表达参与了MAPK信号通路。MAPK信号通路被激活的toll样受体(26),对病毒感染先天免疫反应中扮演很重要的角色。同时,激活MAPK通路的激活将导致NF -κB信号通路,这将刺激炎性细胞因子和基质金属蛋白酶的生产27),最后导致肺炎。因此,改变microrna的表达谱的全血Adv-infected机制在一定程度上反映出的儿童Adv-infected肺炎。
与发展框架或疾病过程,microrna展览动态表达模式。在我们的研究中,我们为特征的microrna的表达谱Adv-infected孩子利用深度测序分析,发现不同的许多microrna表达Adv-infected儿童与健康儿童相比。那些最伟大的差异选择进行进一步的验证。特别是表达hsa - mir - 127 - 3 - p, hsa - mir - 493 - 5 - p,和hsa - mir - 409 - 3 - p从20 Adv-infected儿童明显高于20健康对照组,表明这些microrna可以作为很好的诊断生物标记Adv-infected肺炎。
进一步探索可能的分子机制的不同表示microrna Adv-infected孩子,我们预测可能的靶基因hsa - mir - 127 - 3 - p, hsa - mir - 493 - 5 - p,和hsa - mir - 409 - 3 - p,发现他们中的大多数转录因子或因子参与泛素的途径。特别是与存在验证靶基因预测后,8基因(PSMB5、ITGA6 MYCBP2, TCF7L2, UBE2V2, HIPK1, UBE2D2,和KANSL1)被发现显著下调样本Adv-infected孩子。特别是,MYCBP2是E3泛素蛋白连接酶(28,29日),监管的营地和mTOR信号通路。mTOR的信号通路中起关键作用效应T细胞功能,这将导致差别的对这些受损细胞细胞溶解和无能的病毒消灭。UBE2V2 ubiquitin-conjugating酶,参与单核细胞的分化,这可以产生像MIP-1促炎细胞因子β(30.,31日]。因此,表达下调UBE2V2将导致异常分化的单核细胞和促炎的产生,进而加剧肺炎。激活UBE2D2至关重要的小牛和rig - i病毒感染(32- - - - - -34]。UBE2D2将导致的差别,对这些基因的异常激活的小牛和rig - i信号和病毒清除。这些研究表明microrna的表达谱变化Adv-infected孩子导致不同的转录组的概要文件,它反映了难以复制的机制,形成Adv-infected肺炎。
5。结论
总之,我们确定了3个最明显不同的microrna表达Adv-infected全血的孩子,可作为生物标记物对Adv-infected肺炎。同时,基于目标基因预测和存在的分析,我们发现基因MYCBP2 UBE2V2, UBE2D2可能扮演了一个重要的角色在病毒复制和Adv-induced肺炎。然而,进一步的研究是必要的澄清他们的角色在这些过程中,将提供生理依据Adv-infected肺炎的治疗。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
冯黄和Junsong张同样这项工作。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(81701990,81701990,81601759),国家科技重大项目(2018 zx10101004003001),和广州科学研究一般项目(201707010183)。