文摘

Dexmedetomidine,α2-adrenoceptor受体激动剂,被广泛用作镇静剂和止痛剂的临床应用。然而,很少有人知道它产生镇痛的机制对三叉神经系统的影响。两种类型的电压门控钠通道,Nav1.7和Nav1.8,以及α2-adrenoceptors表达在初级感觉神经元的三叉神经节(TG)。用全细胞膜片箝记录中,我们调查了影响血浆浓度美托咪定对于电压门控钠通道电流(我Na)通过α2-adrenoceptors分离,小型TG神经元。Dexmedetomidine浓度抑制我Na在小型TG神经元。我Na育亨宾dexmedetomidine被抑制的竞争力α2-adrenoceptor拮抗剂。Dexmedetomidine-induced抑制我Na是由G protein-coupled受体(GPCRs),这种效应被细胞内灌注与G蛋白抑制剂GDPβ- s。我们的研究结果表明我Na在小型TG神经元,抑制介导的激活Gi / o protein-coupledα2-adrenoceptors,可能导致的镇痛效应dexmedetomidine三叉神经系统。因此,这些新发现强调潜在orofacial地区镇痛药物的新目标。

1。介绍

Dexmedetomidine是一个强有力的和高度的选择性受体激动剂α2-adrenoceptor与广泛的影响,包括镇静,anesthetic-sparing活动,镇痛,和辅助镇痛效应(1,2]。α2-Adrenoceptors广泛分布在整个周边和中枢神经系统包括初级传入纤维、脊髓背侧角,和脑干,他们激活产生各种各样的影响(3- - - - - -6]。三个α2-adrenoceptor亚型(α2,α2 b,α2 c)已经被克隆,都是耦合的抑制G蛋白质和发挥重要作用的控制疼痛(7,8]。系统管理dexmedetomidine增加机械和热疼痛的阈值并产生antinociceptive效果,在人类和动物,这表明α2-adrenoceptor可能参与镇痛效应在外围级别(9- - - - - -11]。尽管大量证据支持一个antinociceptive dexmedetomidine效应在背根神经节(DRG) orofacial地区的潜在机制仍知之甚少。(12- - - - - -14]。

三叉神经节(TG)诊断相关的同行在脊髓水平,与这两个地区有类似的神经元数量。TG神经元参与orofacial地区的痛感。TGs的神经元也已知痛觉受器和神经化学性质类似于DRG神经元(15]。电压门控钠通道(VGSCs)发挥重要作用在兴奋性细胞动作电位萌生和扩展,包括TG和按感觉神经元,因为他们负责初始膜的去极化。VGSCs在初级痛觉神经元的TG参与疼痛传导和传输过程orofacial地区(16- - - - - -18]。因此,控制疼痛的TG神经元的兴奋性调节VGSCs将提供一个有用的工具管理orofacial生理或病理性疼痛的区域。

最近的研究显示,dexmedetomidine抑制tetrodotoxin-resistant和tetrodotoxin-sensitive DRG神经元的钠离子通道(8,19,20.]。然而,目前尚不清楚是否dexmedetomidine可以抑制VGSCs在三叉神经系统的神经元的功能。在目前的研究中,我们调查是否外围dexmedetomidine-induced镇痛orofacial地区可能部分源于抑制通过绑定Gi / o protein-coupled VGSC激活α在小型2-adrenoceptors TG神经元。

2。材料和方法

2.1。动物

综述了所有外科手术和实验程序和批准的机构动物保健和使用委员会Gachon大学医学院。C57BL / 6小鼠(男,6 - 8周)从OrientBio购买(国军、韩国)。三十老鼠习惯至少1周之前传统的实验设施与12:12 h光暗周期八点(灯),随意获取食物和水。

2.2。制备三叉神经节(TG)神经元

TG C57BL / 6小鼠的神经元准备如前所述[18]。简而言之,TG保持在4°C在汉克的平衡盐溶液(哈佛商学院;Welgene、大邱、韩国)孵化2毫升hbs含有0.25%胰蛋白酶(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) 37°C 60分钟。细胞被洗净,磨碎flame-polished巴斯德吸管,放在玻璃盖玻片涂有0.5毫克/毫升poly-L-ornithine (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。这些细胞被维持在37°C公司5%2孵化器和被用于录音后8小时内被镀。

2.3。Whole-Tissue逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)

总RNA提取小鼠TGs使用alphaPrep总RNA迷你包(Alphα基因,国军,韩国)根据制造商的指示。RNA受到rt - pcr使用益生元(dT)逆转录酶底漆和上标三世逆转录酶(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),并保持在37°C逆转录反应了一个小时。随后,进行了PCR扩增引物见表1。PCR产品然后运行在一个ethidium bromide-stained 1.2%琼脂糖凝胶。

表1
DNA用于rt - pcr引物序列的列表。
2.4。全细胞膜片箝记录

全细胞电压和current-clamp录音进行在24 - 28°C测量电流和动作电位,分别使用一个Axopatch 200 b放大器(轴突仪器,结合城市、钙、美国)。补丁吸量管救出硼硅酸盐毛细血管(追逐科学玻璃有限公司,罗克伍德、钙、美国)。当充满了吸管的解决方案,4 - 5 MΩ吸量管的阻力。录音室(卷300μL)连续过冷(2 - 3毫升/分钟)。串联电阻补偿(> 80%),并泄露减法。在2千赫采样数据进行低通滤波10 kHz。pClamp8(轴突仪器)软件被用于实验和分析。电压钳实验的吸管解决方案包含(毫米)135年中海,30 CsOH 2 Mg-ATP 5 EGTA,和10玫瑰,调整与CsOH pH值7.4,与295 - 300 mOsm的渗透性。在某些情况下,鸟苷5 - - - - - - (β含硫的]二磷酸trilithium盐(GDPβ- s, 2.5毫米)是包含在细胞内解决块G protein-coupled受体(GPCRs)。电压钳实验的细胞外的解决方案包含(140毫米)氯化钠,氯化钾,1 MgCl210玫瑰10葡萄糖,2 EGTA,调整与氢氧化钠pH值7.4,与300 - 310 mOsm的渗透性。电压钳实验进行控股−60 mV的潜力。current-clamp实验的吸管解决方案包含145 K-gluconate(毫米),2 MgCl21 CaCl210 EGTA 5玫瑰5 K2ATP,调整与KOH pH值7.3 - -7.4,300 mOsm的渗透性。current-clamp实验的细胞外的解决方案包含(140毫米)氯化钠,氯化钾,2 CaCl21 MgCl2,10玫瑰,和10葡萄糖,调整与氢氧化钠pH值7.4,与300 - 310 mOsm的渗透性。集成电路50值的计算是通过规范在不同药物浓度峰值电流振幅值获得控制的解决方案。此外,数据被安装到希尔方程(12]。

2.5。药物

所有的化学品都购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。Dexmedetomidine、盐酸育亨宾和GDPβs是溶解在蒸馏水做股票的解决方案。药物稀释他们的最终浓度在细胞外的解决方案,然后通过洗澡灌注系统由重力。

2.6。统计分析

所有的数据都表示为平均值±标准平均误差(SEM)。单向方差分析(方差分析)或未配对的学生t以及用于确定使用起源6.0统计差异(Microcal软件公司,北安普顿,妈,美国)。差异被认为是重要的 。

3所示。结果

3.1。电压门控钠通道基因表达和α2-Adrenoceptor三叉神经节

两种类型的VGSCs, Nav1.7和Nav1.8,是已知的导致疼痛传导痛觉神经元(21,22]。因此,我们调查是否TG神经元表达了Nav1.7,Nav1.8,α利用rt - pcr 2-adrenoceptor mrna。大小的PCR产物分离小鼠TG的电泳显示的649年,544年和538年英国石油公司扩增子,作为Na的预期v1.7,Nav1.8,α2-adrenoceptor亚型,分别(图1)。


图1
Na的表达v1.7,Nav1.8,α在TG 2-adrenoceptor神经元。
3.2。Dexmedetomidine抑制电压门控钠通道电流(我Na在小型TG)和动作电位(ap)神经元

VGSCs主要表达在小型疼痛的感觉神经元和发挥着重要的作用在调节APs (21,22]。因为钠v1.7和Nav1.8负责最初的去极化阶段参与代APs (23),我们检查dexmedetomidine是否能调节我Na在小型TG和APs神经元。为了验证这一点,我们记录下来我Na在这些小型TG和APs神经元(10到25μ米直径)使用全细胞电压current-clamp电生理,分别。我Na由dexmedetomidine抑制浓度(IC的依赖50= 33μM;数据2(一个)和2 (b))。Dexmedetomidine, 100的浓度μM,显著抑制我Na(72±3%, )(数据2(一个)和2 (b))。Dexmedetomidine也抑制了APs的一代电流注入浓度的方式(数字3(一个)和3 (b))。正如所料,dexmedetomidine明显抑制美联社频率电流注入(后数据3 (c)和3 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
,影响血浆浓度美托咪定对于电压门控钠通道电流(我 Na在小型TG)神经元。(一)Dexmedetomidine抑制我 Na浓度的方式。跟踪显示我 Na100年,dexmedetomidine的影响(30日μ米),惨败。(b)的抑制百分比我 Na由dexmedetomidine (5μ米, ;30μ米, ;100年μ米, )。结果意味着±SEM。 ;t以及与控制; 每组-20个神经元。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图3
,影响血浆浓度美托咪定对于动作电位(ap)的小型TG神经元。(一)Dexmedetomidine (100μ米)抑制APs后电流注入(5 ms, 150 pA)在小型TG神经元。之前单一的动作电位的痕迹(控制)和治疗后dexmedetomidine (5 - 100μ米)。(b)由dexmedetomidine美联社振幅的抑制百分比(5 - 100μ米)。 ;t以及与控制; 每组20神经元,分别。n。:没有意义。(c) Dexmedetomidine抑制美联社频率电流注入后(1 s, 150 pA)在小型TG神经元。动作电位的痕迹(控制)和在治疗dexmedetomidine (100μ米)。(d) Dexmedetomidine (100μ米)显著抑制90% AP频率的电流注入(150 pA) ;t以及与控制; 每组20神经元,分别
3.3。Dexmedetomidine抑制我Na通过α在小型2-Adrenoceptors TG神经元

下一步,我们调查是否我Na抑制由dexmedetomidine依赖Gi / o protein-coupled受体(GPCR)信号通路调节α2-adrenoceptor激活。当的α2-adrenoceptor抑制剂,育亨宾(0.5μ米,2分钟)或G蛋白抑制剂,GDPβ- s(2.5毫米,8分钟),抑制作用血浆浓度美托咪定对于使用我Na被废除(图4(一)- - - - - -4 (c))。这表明GPCR信号通路的激活α2-adrenoceptors整体参与dexmedetomidine-induced抑制我Na(图4 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图4
,影响血浆浓度美托咪定对于我 Na通过Gi / o protein-coupledα在小型2-adrenoceptors TG神经元。(一)治疗育亨宾(0.5μ米,2分钟),抑制抑制影响血浆浓度美托咪定对于我 Na在小型TG神经元( )。(b)细胞内灌注与GDPβ- s(2.5毫米,8分钟)块的抑制我 Nadexmedetomidine ( )。(c)抑制育亨宾和GDP的总结β- s对dexmedetomidine-mediated抑制的影响我 Na。结果意味着±SEM。n。:没有意义。(d)抑制工作假说我 Na通过胃肠道dexmedetomidine / o protein-coupledα在小型2-adrenoceptors TG神经元。感觉TG神经元不仅表达神经元VGSCs和Gi / o protein-coupledα2-adrenoceptors。刺激的α2-adrenoceptor VGSCs dexmedetomidine抑制活性的抑制GPCR通路在分离小型TG神经元。

4所示。讨论

在这项研究中,我们表明,神经元VGSCs Nav1.7和Nav1.8,这是主要的痛觉元素疼痛感觉,和αdexmedetomidine 2-adrenoceptor,这是一个选择性受体,在mRNA水平表达感官TG神经元。我们还表明,dexmedetomidine抑制我Na和APs,浓度的方式,通过激活α2-adrenoceptors小型TG表达神经元。我们的结果表明,这种抑制发生在一个由Gi / o protein-coupled激活细胞内信号传导机制α2-adrenoceptors,通过抑制作用我Na在初级感觉神经元在三叉神经系统中,dexmedetomidine可以有效地抑制orofacial疼痛。这些新发现强调潜在的小说orofacial地区镇痛药物目标。

Dexmedetomidine,一个强有力的和高度的选择性受体激动剂α2-adrenoceptor,已广泛用于镇静和镇痛效果(24]。α2-Adrenoceptors dexmedetomidine激活,通常在脑干核,发现神经元表面的薄层的脊髓,和周围神经终端3- - - - - -5]。此外,据报道,α2-adrenoceptor表达了超过60%的神经元的TG和DRG神经元的80%以上5,6]。最近的研究证明antinociceptive dexmedetomidine机制在躯体感觉系统中,特别是在脊髓和周围神经系统(8,19,20.,25]。几项研究专门针对离子通道(VGSCs hyperpolarization-activated循环nucleotide-gated通道)的背根神经节主要伤害感受有关。这些研究表明,dexmedetomidine的作用机制是抑制这些通道的相关8,19,20.,26]。这表明dexmedetomidine块躯体疼痛系统层面的周围神经系统。此外,dexmedetomidine已表现出另一个VGSC, NaV1.5,在心肌细胞(27]。然而,缺乏研究的antinociceptive影响dexmedetomidine orofacial地区涉及三叉神经系统。

伤害感受三叉神经系统中的可能不同于其他常见,可以发现机制。虽然有解剖和功能相似性脊髓和三叉神经躯体感觉系统、躯体感觉输入的节段性分布相对较少的组织在三叉神经感觉系统。此外,之间的距离在三叉神经节及其目标系统比其他地区更短的躯体感觉系统(28,29日]。有几种不同的功能类型的TG神经元在三叉神经感觉系统,这是反映在这个地区细胞体的异质性。TG神经元可以有很大区别,在胞体大小和离子通道的表达和其他蛋白质(18,30.]。疼痛的TG神经元无髓鞘的c fibers,小表达VGSCs [16]。VGSCs,比如Nav1.7和Nav1.8,是主要的离子通道参与APs的生成和传播21- - - - - -23]。APs的生成和传播所需的痛感在三叉神经系统(17,18]。通过测试是否dexmedetomidine抑制VGSCs三叉神经系统内,我们研究了其潜在的新医疗orofacial疼痛。

我们首先确认是否Nav1.7和Nav1.8,TG的主要神经VGSCs神经元,以及αdexmedetomidine 2-adrenoceptor,受体,可以通过rt - pcr检测。我们的研究结果表明,Nav1.7,Nav1.8,α2-adrenoceptor都用TG(图表示1)。这是体细胞系统与先前的研究一致表明,抑制机制血浆浓度美托咪定对于我Na通过激活α2-adrenoceptors三叉神经系统。

有两个小型TG神经元钠电流的一般类:一个是被TTX (TTX-sensitive或TTX-s我Na),另一种是对TTX (TTX-resistant或TTX-r我Na)[17]。在小型TG神经元,TTX-s我Na和TTX-r我Na生成的激活钠吗v1.7和Nav1.8,分别。Nav1.7和Nav1.8表达在三叉神经系统,通过同步激活,他们生成APs对疼痛感(至关重要17,23]。用全细胞膜片箝记录实验中,我们证实dexmedetomidine抑制我Na在小型神经元TG浓度的方式(数字2(一个)和2 (b))。具体地说,100年的浓度μM dexmedetomidine显著下降我Na振幅在小型TG神经元(数字2(一个)和2 (b))。这个观察证实TTX-s和TTX-r我Na由dexmedetomidine镇压。,因此,抑制作用血浆浓度美托咪定对于TTX-s和TTX-r我Na可能导致其镇痛活性。Dexmedetomidine也阻止了APs在小型TG电流注入后神经元的生成浓度的方式,再通过我Na抑制(图3(一个)和3 (b))。正如所料,dexmedetomidine后明显降低了美联社频率电流注入(数字3 (c)和3 (d))。

我们的研究结果表明,通过激活α2-adrenoceptors小型TG表达神经元,dexmedetomidine可以通过细胞内抑制orofacial疼痛机制,抑制神经元VGSCs和APs在三叉神经感觉系统。dexmedetomidine-stimulated的机制α2-adrenoceptors抑制我Na三叉神经系统还没有被很好的描述。自α2-adrenoceptors激活细胞内信号通过特定GPCR通路(7育亨宾的),我们测试效果α2-adrenoceptor抑制剂,GDPβ- s, G蛋白抑制剂dexmedetomidine-induced抑制我Na在小型TG神经元。育亨宾和国内生产总值β- s完全封锁了我Na抑制dexmedetomidine(数字4(一)- - - - - -4 (c))。我们的研究结果表明,抑制影响血浆浓度美托咪定对于我Na在这个神经元人口很可能由特定的Gi / o-coupled受体的激活(图4 (d))。因此,dexmedetomidine不仅作为一个内生的活化剂α2-adrenoceptors但也可能作为一个内生的选择性抑制剂VGSCs三叉神经系统。

总之,dexmedetomidine镇静剂代理与选择性antinociceptive效果。当前的研究演示了抑制我Na在初级感觉神经元TG和dexmedetomidine表明激活Gi / o-coupledα2-adrenoceptors可能是机制的镇痛活性化合物。抑制外围我Na表明dexmedetomidine的镇痛效应可能是独立于它的镇静效果,这是对中枢神经三叉神经系统的一部分。这种独立的机制表明dexmedetomidine可以潜在的局部止痛剂治疗我Na介导的三叉神经疼痛系统,包括orofacial过敏症。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Sang-Taek Im和梦想易建联乔同样这项工作。

确认

这项工作是支持的Gachon吉尔大学医学中心(朋友:2015 - 16),由韩国国家研究基金会(2015 2017 m3c7a1025600 r1c1a1a01054262 &)。