文摘
低氧诱导因子(HIF) 1α是一个代谢调节剂,在免疫反应中起着重要的作用。先前的研究已经表明,HIF1α参与M1巨噬细胞的极化。澄清HIF1机制α全身的M1巨噬细胞的极化,myeloid-specific HIF1α超表达(Lysm HIF1αlsl)小鼠采用骨骨髓来源和腹膜巨噬细胞被孤立。rt - pcr结果表明HIF1α超表达巨噬细胞有hyperinflammatory upregulation状态特征的M1标记。细胞生物能学分析显示低细胞耗氧率Lysm HIF1αlsl老鼠。代谢组学研究表明,HIF1α过度导致增加糖酵解和磷酸戊糖途径的中间体。进一步的结果显示巨噬细胞M1极化,引起HIF1α超表达是通过上调基因的mRNA表达与糖酵解代谢有关。我们的研究结果表明HIF1α促进巨噬细胞糖酵解代谢,诱导小鼠M1极化。
1。介绍
巨噬细胞是先天免疫的重要组成部分,发挥着重要作用在各种炎症性疾病,包括肝炎、血管疾病、炎症性肠病、类风湿性关节炎,气道炎症1- - - - - -5]。激活巨噬细胞通常分为两个分化表型,经典激活M1和M2或者激活。巨噬细胞激活干扰素γtoll样受体受体激动剂或极化M1表型(6),促炎的巨噬细胞和发挥核心作用在感染宿主的防御和炎性疾病7,8]。巨噬细胞激活Th2细胞因子il - 4, IL-13 M2表型分化,与炎症相关的救济和组织重构(9,10]。巨噬细胞激活可以通过干扰细胞能量代谢改变(11,12]。最近的研究表明,M1巨噬细胞糖酵解的需求,而M2巨噬细胞需要脂肪酸氧化(13,14]。然而,代谢组学分析和巨噬细胞极化的代谢机制仍未定义。
低氧诱导因子1 (HIF1)已成为一个中央监管机构炎症介导的髓细胞(15,16]。HIF1是一个α和β异质二聚体(15,17]。而HIF1β由表达细胞观察不管啊2紧张(18),HIF1α蛋白质增加指数以响应减少O2浓度(19]。HIF1显示一个重要的角色在细胞和骨髓细胞的功能包括调节细胞ATP浓度聚合、运动性、侵袭性,和细菌杀死20.- - - - - -22]。重要的是,据报道,HIF1参与调节巨噬细胞极化(20.]。巨噬细胞的葡萄糖代谢决定极化(23,24),是否参与HIF1葡萄糖代谢α全身巨噬细胞极化过程仍不清楚。
2。材料和方法
2.1。化学药品和试剂
从Gibco RPMI 1640媒介购买。胎牛血清(的边后卫)、青霉素和链霉素是从HyClone购买的。从PeproTech gm - csf购买。醋酸铵,有限合伙人,寡霉素、羰基氰化物p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)、鱼藤酮、抗霉素A买来σ。巯乙酸酯洗液™媒介购买从BD生物科学,我们。[5-13C]谷氨酰胺是来自剑桥同位素实验室。高效液相色谱级氢氧化铵、乙腈和甲醇买来费舍尔科学。去离子水是由Milli-Q系统。
2.2。动物
Lsl-HIF1 dPA老鼠获得如前所述[25]。对于myeloid-specific HIF1α超表达,Lsl-HIF1 dPA老鼠交叉与老鼠窝藏Cre重组酶溶菌酶M (Lysm)启动子的控制下,只存在于骨髓细胞谱系,获取Lysm HIF1αlsl老鼠。野生型(WT)和Lysm HIF1αlsl老鼠同窝出生仔畜C57BL / 6 J背景,与C57BL / 6 J小鼠回交后在十代。所有动物协议的动物保健和使用委员会批准北京大学。
2.3。腹膜巨噬细胞
WT和Lysm HIF1αlsl老鼠(6 - 8周岁)腹腔注射4%巯乙酸(2毫升)的解决方案。三天后,腹膜细胞被注入腹腔收获与PBS包含10%的边后卫。原发性腹膜巨噬细胞培养与rpmi - 1640中补充10%的边后卫。中了2 - 4 h后。Thioglycollate-elicited腹膜巨噬细胞附着在盘子和继续培养6到24小时。
2.4。骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)
骨髓细胞收集从WT Lysm HIF1αlsl老鼠(4 - 6周)。贴壁巨噬细胞培养3天rpmi - 1640年补充10%的边后卫和gm - csf (10 ng / mL)。然后,改变了媒介和附加的巨噬细胞后得到另一个3天。获得M1极化,巨噬细胞继续培养2天rpmi - 1640年补充10%的边后卫和有限合伙人(10 ng / mL)。
2.5。定量rt - pcr
总RNA分离腹膜巨噬细胞或BMDMs使用试剂盒试剂。互补脱氧核糖核酸是获得使用M-MLV逆转录酶包根据制造商的指示。rt - PCR扩增了使用一个Mx3000多元定量PCR系统和SYBR绿色试剂。基因表达水平18 s rRNA规范化的内部控制。
2.6。细胞外通量分析
XF24细胞外流量分析仪用于测量小鼠腹腔巨噬细胞的呼吸条件。细胞被镀在5×104细胞/在24-well XF微型板块和培养6 h。rpmi - 1640中取代XF基地中补充丙酮酸葡萄糖25毫米和2毫米。1 h后的孵化有限公司2无孵化器在37°C,耗氧速率(OCR)和细胞外(ECAR)酸化率测量根据制造商的指示。基底条件下线粒体进行了压力测试或治疗代谢试剂,包括1毫米寡霉素,FCCP 1毫米,1毫米鱼藤酮和1毫米抗霉素a ECAR被波计算软件。
2.7。代谢组学分析
分析与液体chromatography-tandem代谢物进行质谱分析。代谢物的提取、培养细胞与生理盐水洗两次,细胞溶解在80%含水甲醇(v/v),平衡在−20分钟80°C。[5-13C]添加谷氨酰胺作为内部标准。细胞振荡和离心机离心10分钟14000人的速度10分钟在4°C。细胞代谢物提取收集上层清液,干,储存在注射前−80°C。
对液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)分析,样本重组在水中和分析使用QTRAP 5500质/ MS系统(AB SCIEX)加上一个ACQUITY UHPLC系统(水公司)。一个Xbridge酰胺列(100×4.6毫米身份证。3.5 Lm;水公司)是用于化合物分离在30°C。流动相是5毫米醋酸铵在水中5%乙腈,B和流动相乙腈。线性梯度使用如下:0分钟,90% B;1.5分钟,85% B;5.5分钟,35% B;10分钟,35% B;10.5分钟,35% B;14.5分钟,35% B; 15 min, 85% B; and 20 min, 85% B. The flow rate was 0.5 ml/min. MultiQuant v3.0 software (AB SCIEX) was used to process all raw liquid chromatography-mass spectrometry data and integrate chromatographic peaks. Integrated peak areas corresponding to metabolite concentrations were further analyzed using the MetaboAnalyst website (http://www.metaboanalyst.ca)。代谢物表达丰度相对于内部标准。
2.8。统计分析
所有数据提出了均值±SEM。比较的数据集进行使用未配对的学生的t测试来比较两组。统计分析使用GraphPad棱镜(GraphPad软件)。一个价值 和 所有的实验被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。HIF1αM1诱导巨噬细胞的极化
在这项研究中,我们使用Lysm HIF1αlsl老鼠和老鼠WT作证是否HIF1α在之前报道[巨噬细胞影响巨噬细胞极化20.]。的mRNA水平Hif1α骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)和腹膜巨噬细胞被rt - pcr证实,显示大约三倍的Hif1α表达与WT老鼠(图1(一))。然后,我们检查了M1和M2的相对mRNA水平标记在腹膜巨噬细胞和BMDMs。M1标记的mRNA表达,包括白细胞介素6,Il1b,伊诺,Tnfα,Cd11c在腹膜巨噬细胞显著更高的隔绝Lysm HIF1αlsl老鼠,而M2标记的表达式,__arg1,Cd206,Chi313低,显示没有什么不同,甚至与WT老鼠相比6 h(图1 (b))和24小时(图1 (c))。在BMDMs, M1标记高度表达Lysm HIF1αlsl老鼠,M2标记在同一水平相比明显减少(图1 (d))。这些结果表明,巨噬细胞HIF1α超表达诱发M1巨噬细胞的极化。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。HIF1α降低线粒体氧化和促进巨噬细胞的糖酵解代谢
最近的研究表明,激活巨噬细胞极化,其代谢项目(23,24]。因此,线粒体氧化中检测出腹膜巨噬细胞分离WT老鼠和Lysm HIF1αlsl老鼠。HIF1α中巨噬细胞显示显著降低线粒体耗氧速率(OCR)(图2(一个)),但细胞外高酸化率(ECAR)(图2 (b)),建议促进糖酵解代谢。与线粒体氧化抑制剂的治疗,包括羰基氰化物p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)寡霉素,抗霉素A,和鱼藤酮,线粒体氧化的比例在HIF1糖酵解代谢降低α超表达巨噬细胞(图2 (c))。这些数据表明,线粒体氧化降低,增加糖酵解代谢由HIF1诱导α在巨噬细胞。
(一)
(b)
(c)
3.3。代谢组学分析表明,HIF1α全身糖酵解代谢和磷酸戊糖途径和减少线粒体氧化
细胞外通量分析结果显示巨噬细胞之间的不同的代谢模式隔绝Lysm HIF1αlsl老鼠和WT老鼠。进一步探索代谢分析的详细变化,从腹膜巨噬细胞代谢物提取分离Lysm HIF1αlsl老鼠和WT老鼠和使用质/ MS分析。产生的热图层次聚类和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)的代谢产物显示不同的代谢在巨噬细胞分离Lysm HIF1αlsl老鼠和老鼠WT(数字3(一个),3 (b),3 (c))。VIP分数从PLS-DA模型表明,糖酵解中间产物中提取得到相对高贵宾分数(图3 (d))。富集分析和路径分析显示明显差异在糖酵解,柠檬酸循环和磷酸戊糖途径(数字3 (e)和3 (f))。直方图分析展出,代谢物水平增加糖酵解,包括乳酸、GADP, G-3-P, 3 pg, 2, 3-DPG, FBP, G-6-P, F-6-P, PEP和次封盖(图3 (g)),线粒体氧化减少,包括延胡索酸酯、琥珀酸,柠檬酸,异柠檬酸(图3 (h))Lysm HIF1αlsl老鼠。此外,磷酸戊糖途径,糖酵解途径的分流,也激活了d-erythrose-4-phosphate的增加,xylulose-5-phosphate, sedoheptulose-7-phosphate, ribose-5-phosphate, NADPH水平(图3(我))。假设激活磷酸戊糖途径提供生物合成的底物来支持增长和激活巨噬细胞。因此,代谢组学分析显示一个增强糖酵解代谢及磷酸戊糖途径但HIF1减少线粒体氧化α中巨噬细胞。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
3.4。HIF1α修改后的巨噬细胞通过糖酵解基因表达调节糖酵解代谢
在HIF1葡萄糖代谢机制的差异α中巨噬细胞是研究通过分析基因的表达。一些糖酵解基因的mRNA表达,包括的基因,Pgk1,Glut1,Gck,Pkm2在腹膜巨噬细胞高孤立于Lysm HIF1α比WT lsl老鼠老鼠在6 h和24 h(数字4(一)和4 (b))。类似的结果中观察到BMDMs隔绝WT老鼠和Lysm HIF1αlsl老鼠激活M1的治疗有限合伙人(10 ng / mL) 48 h(图4 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
肝脏是一个网站特别富含先天免疫细胞(26)和身体的最大的代谢器官,负责各种代谢过程调节各种功能(27,28]。先天免疫细胞修改和破坏关键进程与代谢疾病。与此同时,代谢压力启动炎症反应的前馈循环(29日]。鉴于HIF1α是一个代谢调节剂扮演重要的角色在炎症30.,31日),我们调查是否由HIF1细胞代谢的调控α控制巨噬细胞极化和炎症。
我们的研究首次使用HIF1α超表达小鼠HIF1验证以前的报告α促进了M1的积累巨噬细胞(32- - - - - -34]。巨噬细胞的基因表达分析显示增加标记的M1的巨噬细胞和减少或不变表达M2巨噬细胞标记(图1巨噬细胞极化),支持HIF1触发器M1表型。
最近的研究表明,细胞代谢起着重要的作用在巨噬细胞极化(23,35]。经典激活巨噬细胞秘密促炎介质,伴随着从线粒体氧化对糖酵解代谢(36]。对比,或者激活的巨噬细胞分泌抗炎细胞因子,声明一个脂肪酸氧化的需求增加37]。我们与这些研究结果一致,表明HIF1α中巨噬细胞减少细胞OCR和增加ECAR(图2)。OCR / ECAR比例也显著下降,这反映出糖酵解代谢的偏好而HIF1与线粒体氧化α中巨噬细胞。
巨噬细胞有能力协调它们的代谢程序调整免疫和生物能量学的功能属性。在我们的研究中,代谢组学分析分析了灿烂的腹膜巨噬细胞代谢物disparation隔绝WT老鼠和Lysm HIF1α老鼠lsl(图3)。相对的代谢物浓度进一步证明HIF1诱导糖酵解代谢和磷酸戊糖途径的激活和抑制巨噬细胞中线粒体氧化Lysm HIF1α老鼠lsl(图3)。磷酸戊糖途径利用葡萄糖为核苷酸生物合成,生成NADPH支持减少谷胱甘肽的生产,因此限制了氧化应激在M1巨噬细胞(38,39]。水平的提高磷酸戊糖途径的代谢中间体满足HIF1基质需要α促使巨噬细胞生长和增殖。这些数据与之前的研究相一致23,24,37),进一步支持借给认为糖酵解代谢炎症巨噬细胞的激活是至关重要的。
LPS-treated BMDMs据报道倾向于一个HIF1接触α端依赖转录程序,负责提高糖酵解(40]。代谢机制HIF1α缺乏小鼠报道伴随着废除了糖酵解,减少肝脏葡萄糖输出和高糖质新生(41]。相反,在我们的研究中,HIF1α过度的巨噬细胞是伴随着高mRNA水平的基因,Pgk1,Glut1,Gck,Pkm2(图4),它负责激活糖酵解。糖酵解可能保证竞争加剧生物能量学为M1巨噬细胞极化状态和密集的能量也提供前体的生产和分泌促炎细胞因子(39,42]。这一过程表明HIF1的角色α在潜在的代谢调节和巨噬细胞生理学之间的协调。
5。结论
总之,我们证明了HIF1α激活提升糖酵解代谢并进一步诱发M1巨噬细胞的极化。
的利益冲突
作者声明没有利益冲突。
作者的贡献
Ting王、刘贡献同样这项工作。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(81470554和81470554号Changtao江和91439206和31230035西安王)和中国国家重点研发项目(2016 yfc0903100)。