文摘

胶质激活和随后释放神经毒性促炎因子被认为扮演重要的角色在一些神经系统疾病的发病机制包括帕金森病(PD)。抑制神经胶质激活和炎症过程可能代表缓解神经衰弱的治疗目标。一叶秋碱,重大自然生物碱产品从植物的根Securinega suffruticosa,据报道有强大的生物活性和用于治疗神经肌萎缩性脊髓侧索硬化症等疾病,小儿麻痹症,多发性硬化症。在这项研究中,我们探讨了潜在的一叶秋碱引发的神经保护机制,特别是其在神经胶质细胞的抗炎作用。我们的研究结果表明,一叶秋碱显著和剂量依赖性抑制一氧化氮产量小胶质细胞和星形文化。此外,一叶秋碱抑制炎性介质的活化NF -κB,以及增殖蛋白激酶在脂多糖(LPS)刺激BV2细胞。此外,一叶秋碱也抑制干扰素-γ——(干扰素γ-)诱导一氧化氮水平和伊诺mRNA的表达。此外,条件媒体(CM)从一叶秋碱BV2预处理细胞显著减少中脑多巴胺能神经毒性与CM LPS刺激小胶质细胞。这些发现表明,一叶秋碱可能是一个潜在的候选人和神经炎症相关神经退行性疾病的治疗。

1。介绍

中枢神经系统(CNS)的炎症在几个神经退行性疾病是一个关键因素。神经胶质细胞,包括小胶质细胞和星形胶质细胞,是神经炎症的主要介质。激活的小胶质细胞触发炎症反应,然后维护和通常由星形胶质细胞放大。反过来,这使神经元炎症介质可引起神经细胞死亡(1]。中枢神经系统神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD),亨廷顿氏病(HD),肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS),和老年性视网膜黄斑性病变(ARMD)都与慢性神经炎症和激活的小胶质细胞和星形胶质细胞(2]。这种慢性炎症可能导致神经毒性分子的积累包括促炎细胞因子、蛋白酶、和活性氧(ROS),参与神经退行性过程,最终会导致神经细胞死亡(3- - - - - -5]。假设,抑制microglial-mediated感应的神经炎症过程可能是神经保护,因此抑制化合物瞄准这一过程可能会有治疗价值。

药用植物及其活性成分目前广泛的生物医学研究的主题。这些植物的药物已经被传统验证使用在过去的几个世纪里,但特定的生物活性成分没有被确认或不完全的特征。传统草药的神经营养和神经保护属性已经被证明是防止神经退化和神经炎症疾病(6]。这表明,这些传统草药具有神经保护利益通过独特的和多个机制,包括抗炎(7- - - - - -10]。天然化合物专门针对阻塞小胶质激活,因此阻断中枢神经系统炎症的启动可能被证明是一种有效的治疗,防止神经退行性和神经炎症疾病。

一叶秋碱,重大自然生物碱产品从植物的根Securinega suffruticosa,据报道,强大的生物活性和临床使用在几个国家11]。一叶秋碱已被发现的一个对手γ氨基丁酸(GABA)受体,因此目前用于治疗神经疾病如ALS,小儿麻痹症,多发性硬化(12- - - - - -14]。此外,一叶秋碱已被证明是一个巨噬细胞受体激动剂,增强细菌间隙通过一种机制有别于toll样受体(通常)[15]。一叶秋碱似乎刺激p38 MAPK活动通过对抗GABA受体的单核细胞(16]。一叶秋碱也被发现刺激p53-null结肠癌细胞凋亡(1,17]。然而,胶质激活潜在的一叶秋碱抗炎作用和机制尚未进行过彻底的探索。

在目前的研究中,确定一叶秋碱抑制胶质炎症激活和可以作为中介的存在,我们测试了一叶秋碱的影响在脂多糖(LPS)诱导活化的小胶质细胞和星形胶质细胞。结果表明,一叶秋碱抑制炎性介质的活化NF -κB,以及上游MAPK活化剂包括兵。此外,一叶秋碱也沉默伊诺表达,没有生产,这两种NF -激活κb .重要的是,我们证明LPS-induced抑制小胶质激活与一叶秋碱主要中脑多巴胺能神经元的神经保护中代表一个PD的体外模型。

2。实验程序

2.1。细胞培养

本研究中使用的细胞培养试剂购自Mediatech, Inc .(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。BV2小胶质细胞培养在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)含10%胎牛血清(penicillin-streptomycin混合物的边后卫)和1% (10000 u /毫升)(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)。生264.7巨噬细胞细胞系(写明ATCC,创伤性脑损伤- 71)种植和维护在DMEM补充10%热灭活的边后卫和1% Penicillin-streptomycin混合物(10000 u /毫升)在37°C, 5%的公司₂。

主要鼠标星形胶质细胞和小胶质细胞被孤立如前所述18]。我们使用产后第二天崽生成主要神经胶质的文化。短暂,皮质组织C57 / BL6小鼠解剖和组织与木瓜蛋白酶消化30分钟在poly-L-lysine 37°C和镀涂层T75烧瓶在DMEM补充10%的边后卫血压得到较好的控制。星形胶质细胞文化隔离,经过1周的文化,水瓶都摇动了去除小胶质细胞随后胰蛋白酶化和涂镀到poly-L-lysine板块或有房间的幻灯片1×10⁵细胞/。细胞最多只用于三个段落;超过95%的细胞染色积极为星形胶质细胞标记GFAP在这些文化。

皮质的初级小胶质文化准备C57 / BL6老鼠如上所述。短暂、混合胶质细胞在DMEM培养3 - 4周补充10%的边后卫。星形胶质细胞的单层被孵化的30分钟0.25%胰蛋白酶/ 2.12毫米EDTA (Mediatech, Inc .,马纳萨斯,弗吉尼亚州)稀释1:与DMEM 4。剩下的孤立小胶质细胞被镀成96 -孔板的密度5×10⁴细胞/好,6-well板块5×10⁵细胞/。小胶质细胞的纯度文化评估使用小胶质CD11b标志或Iba1;为这些小胶质细胞染色积极标记的95%;1 - 3%对GFAP染色积极标记。小胶质细胞培养2天前药物治疗。

主要中脑的文化是从我们的实验室(孤立如前所述19]。短暂,腹侧中脑解剖C57 / BL6小鼠胚胎第14天。组织分离机械,然后消化与木瓜蛋白酶酶解按生产指令(卫氏生化,莱克伍德,新泽西)。在体外4 d后,媒体曝光条件的神经元文化被激活的小胶质细胞。

2.2。细胞生存能力分析

细胞生存能力是由热量MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)从我们的实验室化验如前所述20.]。BV2小胶质细胞被镀成96孔文化板块1×10的密度⁴细胞在100 /毫升μL培养基/。细胞被允许接受24小时之前添加不同浓度的一叶秋碱24 h(西格玛奥德里奇,美国)。经过24小时的治疗,肝癌和解决方案(5毫克/毫升)被添加到每个好,板在37°C孵化2 - 4 h。媒介是吸气和由此产生的甲瓒晶体于200年解散μL(二甲亚砜之前使用分光光度计测量吸光度在570海里。

2.3。亚硝酸盐(NO2的测量⁻)水平

NO2的水平⁻,没有一个稳定的下游产品,激活的胶质细胞分泌的培养基测定使用格里斯试剂测定方法如前所述[21]。小神经胶质细胞、星形胶质细胞和巨噬细胞文化受到炎症诱导的代理是否存在不同浓度的一叶秋碱24 h。治疗后,没有在媒体文化水平来衡量混合与相同体积的格里斯试剂和OD测量在540 nm标(分子器件、CA)。结果的数据代表四个独立实验进行一式三份(平均数±标准差)。

2.4。NFκB-Luciferase活动分析

BV2细胞稳定表达一种NFκB-luciferase构造被镀成96孔细胞培养板的密度10000细胞/。NF的κ记者的质粒包含三个副本B绑定κB-binding序列融合的萤火虫荧光素酶基因从Clontech购买(美国加利福尼亚州山景城)。细胞被preexposed一叶秋碱与LPS cotreatment 24小时治疗紧随其后。荧光素酶活性测定使用Dual-Luciferase®记者分析系统设备按照制造商的指示(Promega)。

2.5。免疫印迹分析

收集各种治疗后,BV2细胞和星形胶质细胞的培养皿胰蛋白酶化和细胞溶解在寒冷的裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂(如前所述)(21]。整个细胞溶解产物用和蛋白质浓度测定用布拉德福德分析工具包(Bio-Rad大力神,CA)。25到50μ克总蛋白质受到10% sds - page和蛋白质被转移到一家聚乙二烯二氟化物膜。Immunodetection是由标准程序使用以下稀释的抗体:伊诺(兔多克隆抗体,1:1000),phospho-NFkB (p65)(兔多克隆抗体,1:1000),PARP(兔多克隆抗体,1:1000),磷的或总形式的ERK1/2 p38 MAPK,物,和pSTAT1(兔多克隆抗体,1:1000年,细胞信号技术,美国),和beta-actin(鼠单克隆抗体1:10000年,西格玛奥德里奇,美国)。二次抗体是辣根过氧化物酶共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白或anti-mouse免疫球蛋白(细胞信号技术,美国)。细胞膜是使用一个增强化学发光(ECL)检测系统(皮尔斯,美国)。带强度测定使用Image-Pro + 6.0软件(Bio-Rad)。

2.6。定量聚合酶链反应(qPCR)分析

BV2主要细胞和星形胶质细胞培养是挑战与有限合伙人(BV2 500 ng / mL;主要的星形胶质细胞,1μ克/毫升+干扰素-γ40 U /毫升)一叶秋碱(10的存在与否μ米)6 h。细胞总RNA分离试剂盒法和互补脱氧核糖核酸合成使用Promega GoScript™逆转录系统(美国麦迪逊,WI)。使用SYBR绿色PCR定量PCR进行主混合试剂和gene-specific引物。数据分析通过比较阈值周期(Ct)的方法。信使rna表达水平改变后治疗后计算GAPDH正常化。正常化后获得的比率表示为褶皱变化与相应的控制(20.]。

2.7。神经毒性的BV2条件主要媒体在中脑的文化

主要中脑的文化孤立的如上所述。在体外4天之后,多巴胺神经元受到的媒体(CM)从BV2小胶质细胞处理有限合伙人±一叶秋碱。CM是如下:准备在6-well BV2细胞培养板与LPS刺激(500 ng / mL)的存在和缺乏一叶秋碱(10μ米)24 h。CM收集所有的团体和离心机在2000 g 10分钟删除任何细胞碎片。CM从控制、一叶秋碱和有限合伙人和有限合伙人+ securinine-treated细胞稀释(1:4)在神经元培养基添加到中脑的文化。72 h曝光后,细胞被固定在4%多聚甲醛和应用anti-TH抗体和Alexa萤石488二级抗体。总数TH-positive神经元分别计入3 - 5井为每个条件。实验重复三个独立的解剖分离出的文化。

2.8。统计分析

除非另有说明,所有的实验进行了一式三份,至少重复三次。数据提出了均值±SEM和统计对比组由单向方差分析学生的紧随其后以及。多重比较的数据从体外实验中被双向方差分析其次是Bonferroni事后评估测试。统计学意义是对所有分析。

3所示。结果

3.1。一叶秋碱不引起细胞毒性小胶质细胞BV2浓度15μ米

一叶秋碱是否显示细胞毒性效应在胶质细胞类型,我们对待BV2细胞,一个不灭的鼠小胶质细胞,随着浓度的化合物24 h,紧随其后的是使用MTT试验评估细胞的生存能力。没有观察到明显的细胞毒性15μ20 M,而15%毒性观察μM(图1)。这毒性可能是由于细胞凋亡的诱导在30之前报道μ在癌症细胞系(17]。基于这些数据,我们选择使用10μM一叶秋碱为所有后续的分析。另外,有限合伙人的浓度(500 ng / mL)用于诱导没有生产也并不影响细胞的生存能力(数据未显示)。

3.2。一叶秋碱抑制LPS-Induced BV2细胞和炎症没有生产主要鼠小胶质细胞

检查潜在的抗炎活性的上下文中一叶秋碱小胶质激活,我们最初研究一叶秋碱的影响在BV2炎症介质的产生和鼠标主要小胶质细胞,都与有限合伙人的挑战。的炎症反应,迅速激活的胶质细胞诱导的表达诱导一氧化氮合酶(间接宾语),所需的一种关键酶生成一氧化氮(NO)、活性氮物种(RNS)导致蛋白质和线粒体损伤导致细胞凋亡22]。在BV2细胞,明显LPS诱导没有生产检测亚硝酸盐的积累24 h后的培养基。然而,在一叶秋碱的存在剂量依赖性抑制没有生产几乎控制在最高水平的药物浓度。一叶秋碱本身没有影响生产(图2(一个))。同样,我们观察到显著抑制LPS-induced没有生产一叶秋碱在主要小神经胶质细胞培养(图2 (b))。

3.3。一叶秋碱抑制LPS-Induced NO-Synthesizing酶的表达,进气阀打开,促炎细胞因子

检查是否没有生产的减少一叶秋碱是由于减少mRNA和蛋白表达的伊诺和一叶秋碱对多种促炎细胞因子的表达的影响,进行了实时聚合酶链反应和免疫印迹分析在LPS-stimulated BV2和初级小胶质细胞。主要和BV2细胞preincubated 1 h和一叶秋碱(10μ米),然后用LPS刺激6 h (500 ng / mL)。如数据所示3(A1)和3(A2),一叶秋碱显著降低TNF -等炎性分子的表达α和il - 1βBV2和初级小胶质细胞,而复合就没有引起任何显著的基因表达的变化。此外,通过qPCR和免疫印迹(数据所示3(B1)和3(B2)),一叶秋碱剂量依赖性抑制LPS-induced伊诺mRNA和蛋白水平的表达主要BV2和小胶质细胞。

3.4。一叶秋碱变弱LPS-Induced NFκB激活

众所周知,有限合伙人和其他炎性刺激诱发伊诺表达神经胶质细胞通过激活转录因子NFκb .因此,我们检查了一叶秋碱的抗炎效应是否由于封锁NF -κB BV2细胞内激活。NF -κ我通常是被磷酸化激活的κB蛋白,针对他们通过ubiquitin-proteasome快速降解途径和释放NF -κB进入细胞核,调节基因表达。免疫印迹分析证明LPS-induced磷酸化p65亚基的显著抑制与一叶秋碱预处理(图4(一))。此外,LPS-induced NFκB-dependent转录活性也显著减少了一叶秋碱治疗(10μ米)。这些数据表明,一叶秋碱可以防止NFκB-mediated诱导炎症通路。

3.5。一叶秋碱降低LPS-Induced MAPK磷酸化

针对MAPK信号通路抑制剂已经知道展览抗炎活动(23]。确定抗炎活性一叶秋碱是由于MAPKs活动的调制,BV2细胞用一叶秋碱预处理(10μ米)1 h,然后用LPS刺激额外的1 h潜伏期。基于初步时间课程研究(数据未显示),1 h治疗有限合伙人MAPK磷酸化的决心是最优的。免疫印迹分析进行了使用phosphoantibodies或总抗体三MAPKs p38 MAPK、物和ERK1/2。免疫印迹分析表明,一叶秋碱明显压抑p38 MAPK的磷酸化,物,和ERK1/2分别,但并不影响ERK1/2的表达水平,物,p38 MAPK LPS-stimulated BV2小胶质细胞(图5)。

3.6。一叶秋碱降低干扰素-γ全身没有生产,伊诺mRNA表达,STAT1α激活

多个转录因子参与调节进气阀打开催化剂活性。除了有限合伙人,干扰素-γ是一个行之有效的刺激,促进炎症分子的表达(例如,伊诺)通过STAT1吗α,但独立的NF -κB (23]。因此,对干扰素一叶秋碱——的影响γ激活也被调查。如图6(一),一叶秋碱抑制IFN -γ全身没有生产以最大的抑制浓度的方式取得了10点μm .一叶秋碱也显著降低干扰素-γ全身伊诺mRNA表达水平(图6 (b))和STAT1的磷酸化α(图6 (c))。

3.7。一叶秋碱通过抑制小胶质激活保护神经元

先前的研究从我们自己的实验室和其他证明活化的小胶质细胞诱导神经细胞死亡和放大神经变性的发展(20.,24]。由于我们的数据表明,一叶秋碱能抑制小胶质激活,我们调查是否这个翻译noncell自主神经保护效应。条件媒体(CM)从LPS-treated BV2细胞一叶秋碱预处理的存在与否是添加到主中脑的文化和细胞生存能力监控在后者通过酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学和TH-positive神经元计数(数字7(一)和7 (b))。从这些研究结果表明,从LPS-stimulated厘米小胶质细胞(LPS-CM)显示显著的毒性TH-positive神经元,大概由于有毒因素活化的小胶质细胞分泌的。除了细胞丧失,神经炎的过程也缩短生存TH-positive神经元(图7 (b))。一叶秋碱,在正常情况下,不影响TH-positive生存能力。然而,与一叶秋碱预处理的小胶质细胞提供了大量神经保护与毒性与CM孤立于活化的小胶质细胞(有限合伙人/ Scu-CM和LPS-CM),这表明一叶秋碱可能发挥神经保护作用,至少在一定程度上,通过减少生产和分泌炎症介质的小胶质细胞(图7 (b))。

3.8。一叶秋碱对原始264.7的炎症激活巨噬细胞细胞和原代星形胶质细胞培养

最后,为了探索一叶秋碱是否也可能诱发消炎的效果在其他细胞类型小胶质细胞之外,我们没有评估生产生264.7巨噬细胞细胞和原代星形胶质细胞培养的存在和没有预处理的化合物。一叶秋碱被发现存在剂量依赖的相关性降低没有生产LPS-stimulated RAW264.7细胞巨噬细胞(图8(一个)),还在初级鼠标星形胶质细胞文化(图8 (b))。星形胶质细胞与LPS刺激时加干扰素-γ更高层次的不生产了,同样被一叶秋碱(图8 (c))。这些结果表明,小分子一叶秋碱也有抗炎作用在周围巨噬细胞和星形胶质细胞。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们检测了抗炎作用的小分子天然产物一叶秋碱在巨噬细胞和神经胶质人口和划定潜在的信号转导途径参与这些过程。我们的研究表明,一叶秋碱强烈抑制小胶质细胞的激活炎症,星形胶质细胞和巨噬细胞。一叶秋碱明显和剂量依赖性降低没有生产LPS-stimulated BV2主要小胶质细胞和小胶质细胞和星形胶质细胞文化。NF -κB和MAPK通路至少部分参与一叶秋碱的抗炎机制。此外,一叶秋碱也抑制干扰素-γ全身没有生产和STAT1α激活。最后,条件媒体一叶秋碱预处理BV2小胶质细胞单独LPS-treated组相比显著降低多巴胺能神经毒性。这些结果表明,一叶秋碱可能有治疗潜力各种glial-mediated神经炎症疾病。

小胶质细胞的激活,免疫macrophage-like细胞在大脑中,居民是有益的在急性感染或有毒侮辱通过消除“生病”不再是功能的神经元。然而,在持续进步的脑损伤的存在,他们可以成为长期激活,导致持续的异常炎症反应(25]。神经胶质细胞的激活和增加生产促炎的产品来源于被卷入一些神经退行性疾病的病理生理学,如广告、PD,高清26]。最近,已经受到了人们足够的重视治疗策略旨在抑制神经毒性小胶质激活。尽管非甾体类抗炎药物(非甾体抗炎药)在各种疾病模型演示神经保护,这些药物有严重的副作用后长期使用,导致搜索更好的选择(27]。最近的研究表明,天然产品及其组件是很好的替代候选人用于治疗由于其名声安全,便宜,而且容易获得(28]。

活化的小胶质细胞分泌促炎介质包括细胞因子il - 6和TNF -等α、活性氧和活性nitrative物种等。一氧化氮(NO)是一种独特的生物信使介导几个生理功能。然而,过度的条件下生产,没有似乎毒害神经的暗示可能发挥重要作用在神经退行性疾病的病理生理学(29日]。在当前的研究中,我们已经表明,生产没有LPS-activated小胶质细胞(BV2和主小胶质细胞)明显剂量依赖性地抑制由一叶秋碱mRNA和蛋白水平。

我们下一个检查一叶秋碱的影响LPS-induced激活各种MAPKs以及NF -κB-mediated通路。证实MAPKs和NF -κB转录因子调控中发挥重要作用的促炎细胞因子的表达和酶包括伊诺,TNF -α,il - 1β、il - 6和cox - 2 (30.]。因此,对于一种化合物表现出抗炎作用这应该需要一个能力减弱这些通路的激活。NF -的信号机制κB激活已经完善,包括一连串的细胞质蛋白质导致最终的易位p65 NF -亚基κB到细胞核导致促炎的下游基因的转录31日,32]。

在这项研究中,我们显示,正如所料,磷酸化的所有三个MAPKs BV2 LPS处理后小胶质细胞磷酸化的NF -κNF - B p65和增加κB催化剂活性。一叶秋碱剂量依赖性抑制LPS-induced NF -κB磷酸化活化以及LPS-induced p38,物,这些细胞ERK的磷酸化。

先前的研究已经证明,伊诺的表达是监管协调的行动等转录因子NF -κB、AP-1 STAT1 [33]。有趣的是,我们的研究结果表明,除了衰减NF -κ激活,一叶秋碱也抑制干扰素-γ全身没有生产,伊诺mRNA表达,STAT1α激活(图6)。这些结果表明,一叶秋碱调节炎性基因表达在NF -κ依赖和独立的方式。

最近的研究强调了周围巨噬细胞浸润的作用在创伤性脑损伤(TBI)后反应性胶质增生和还在脊髓损伤的情况下34]。此外,当血脑屏障损害在神经系统疾病如多发性硬化症和阿尔茨海默病和帕金森疾病,外周免疫细胞包括单核细胞,中性粒细胞,T细胞和B细胞可以输入大脑,他们执行不同的细胞介导的影响(35]。我们研究巨噬细胞和星形胶质细胞进一步证明一叶秋碱不仅抑制小胶质激活也可以抑制周围巨噬细胞和星形胶质细胞表明一叶秋碱的广泛的抗炎作用。

最近的一项研究报道,一叶秋碱可以减少胶质贝塔淀粉样蛋白引起的炎症反应,改善认知障碍和神经退化β美联社(25 - 35)治疗大鼠36]虽然研究表明一叶秋碱在这个模型中,神经的确切机制参与这个过程没有探索。在目前的研究中,培养媒体从有限合伙人/ securinine-treated小胶质细胞提供了几乎完整的多巴胺能神经保护与厘米从LPS-stimulated小胶质细胞。采取总体而言,我们的研究结果表明,一叶秋碱提供神经保护效应通过减少促炎介质生产异常。尽管厘米实验利用LPS-stimulated BV2小胶质细胞与主要中脑的文化可能不完全模仿体内的情况,这可能,至少在一定程度上反映了病理条件下活化的小胶质细胞可以影响邻近的神经元的生存生活的大脑。然而,进一步的研究需要验证机制的神经保护财产一叶秋碱在动物模型的inflammation-mediated神经退行性疾病包括帕金森病。

5。结论

总之,我们的结果表明,一叶秋碱的神经保护特性可能是由于抑制胶质激活和随后的一代的促炎因子。从力学上看,这似乎涉及抑制p38地图kinase-NF -κB通路导致减少促炎基因的表达和释放对应的基因产物。

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突。

确认

这项工作是由美国国立卫生研究院的资助支持警察甲AG025901朱莉·k·安德森和R01AG029631-08戈登·j·Lithgow。作者感谢萨勃拉曼尼亚Rajagopalan援助与主文化的实验。