文摘

培养主要人类角质细胞经常用于研究免疫和炎症反应;然而,实验数据的解释可能被捐赠者捐赠变化复杂,文化中存在时间相对较短,段落之间的差异。标准化在体外角质细胞的研究中,我们调查了使用HaCaT细胞,长寿,自然能够区分人类永生的角化细胞线在体外,因为一个合适的模型炎症和修复的释放介质对TNF的回应α或il - 1β。不同处理条件下(血清的存在与否)和分化刺激(增加细胞密度作为时间的函数在文化和海拔的细胞外钙)被认为是。ELISA和多路测量技术用于监测细胞因子和趋化因子的产生。综上所述,结果强调Ca^{2 +}在中浓度、细胞密度和血清的影响在不同层次上由HaCaT细胞促炎介质的释放。此外,HaCaT细胞保持在低钙^{2 +}媒介和80%汇合的类似于正常角化细胞的细胞因子的生产表明HaCaT细胞可能是一个有用的模型研究抗炎干预/治疗皮肤疾病。

1。介绍

皮肤是一个不断自我更新的器官,动态管理outside-inside-outside人体的关系,积极参与宿主防御(1]。角化细胞(;)代表95%的表皮细胞。最主要的是,他们玩表皮的结构和屏障功能,但他们的角色在启动及延续的皮肤炎症和免疫反应,和创伤修复,也认识到2]。

在稳态条件下,;从增殖有核基底细胞分化和成熟的高度分化,nucleus-free corneocytes。每个阶段分化的特点是结构蛋白的表达,如角蛋白(K)和脂质3,4]。例如,K5的表达和K14仅限于基底层,而K1和K10出现在更多的差异化suprabasal细胞(4),involucrin loricrin, keratolinin至上棘细胞层(1]。终端分化是由各种细胞因子和生长因子,它通常是与外围信封的形成有关,富含蛋白质和脂质(3,4]。钙(Ca^{2 +})梯度表皮,增加从基底颗粒层,代表了最重要的一个触发KC分化的4]。

休息;产生表皮生长因子受体(EGFR)配体和血管内皮生长因子(VEGF),但当激活细菌产品或通过紫外线的直接损害或化学物质,细胞因子和趋化因子的表达变化(5,6]。在牛皮癣等皮肤疾病,(7)或特应性皮炎(8),细胞因子/趋化因子网络更加复杂和自分泌/旁分泌循环描述(2]。

培养人类;经常用于对慢性炎症皮肤病(KC功能的研究9,10]。主;培养在体外在低钙^{2 +}浓度保持基底表型,他们区分的Ca^{2 +}> 0.1毫米(11,12]。然而,使用常规监测发炎皮肤呈现的炎症反应的主要缺点。首先,新鲜的人类;需要补充生长因子生存和增殖在体外;其次,一旦诱导分化,他们迅速死亡,不允许长期调查的微分信号13]。此外,donor-to-donor变化特点和增长在体外反应,不同的电镀效率,短暂的一生在文化、增殖和分化特征的变化和越来越多的段落,使实验数据的解释。

为了减少这些问题,自发永生的人类KC细胞系HaCaT从成人皮肤已被建议作为一个模型研究KC功能。HaCaT nontumorigenic单克隆细胞株,适应长期增长没有feed层或补充生长因子(13,14];展品正常形态发生和表达了所有主要的表面标记和功能活动孤立的KC [14];在刺激,HaCaT细胞分化和表达分化的特定标记,如K14、K10、involucrin。他们也可以形成分层表皮结构(15),但他们可以恢复,分化和基底之间来回,对Ca的变化状态^{2 +}在中浓度(16];他们保留能力重建一个结构良好的移植后表皮在活的有机体内(17]。

本研究的目的是调查和优化使用HaCaT细胞作为一个可靠的最佳条件在体外模型来评估,在分化的不同阶段,选择的促炎介质的生产,其中主要涉及皮肤炎症和血管生成。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

HaCaT细胞自发永生的人类角化细胞线(15),请提供的细胞系服务GmbH(德国,德国)和培养公司5%₂在37°C在常规杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (Euroclone S.P.A.包含1.8毫米Ca、米兰、意大利)^{2 +},或用DMEM (Gibco,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)在低浓度的CA^{2 +}(0.07毫米)。媒体都是补充heat-inactivated 10%胎牛血清,谷氨酰胺(2毫米),青霉素(100 U⁄毫升)(Euroclone)和链霉素(100毫克⁄毫升)(Euroclone)。对所有实验,细胞被播种密度为5.7×10³细胞⁄厘米²在高或低钙与DMEM培养^{2 +}浓度为6到14天。样本标记如下:A6,较低的细胞培养6天^{2 +}浓度(0.07毫米)和测试时汇合的80%;较低的单元,细胞培养14天^{2 +}overconfluent时浓度(0.07毫米)和测试;C6细胞培养6天高的Ca^{2 +}浓度(1.8毫米)和测试时汇合的80%;和吸收,细胞培养14天高^{2 +}当overconfluent浓度(1.8毫米)和测试。每2天中被改变。流程图和实验协议的细节图1。

2.2。孤立的人类皮肤活检的角质细胞

主;被隔绝nonlesional牛皮癣患者皮肤活检获得成人没有得到局部或系统性治疗至少6个月,或样本集合的时候。从基底膜分离表皮层,0.4毫米穿孔活检是对待dispase(美国马里兰州盖瑟斯堡Gibco BRL,,)。在4°C 18 h后,表皮表是机械分离和分离TrypLE(美国Gibco BRL,马里兰州)为20分钟37°C。获得的主要细胞被镀6-well组织培养板(配角),预镀涂层矩阵(I型胶原蛋白,Gibco BRL),培养使用特定keratinocyte-serum-free媒体在低钙^{2 +}浓度(< 0.07毫米),补充与人类角化细胞生长因子(Gibco BRL)。单层何时达到60% - -70%的融合,细胞被胰蛋白酶化分割。所有的实验中,角化细胞文化之间的第三和第四章节。知情同意是获得所有捐助者提供组织样本,和伦理的道德委员会批准了La Sapienza大学、意大利罗马。

2.3。细胞增殖实验

HaCaT细胞的增殖是确定在指定的时间间隔使用MTT比色测定[描述18]。这个测试是基于能力的琥珀酸脱氢酶活细胞减少黄盐MTT(3 -(溴化4 5-dimethylthiazol-2-yl-2 5-diphenyltetrazolium)) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),一个是深不溶性甲瓒沉淀。实验在96 -孔板包含最终成交量为100μl(中/。细胞在最初被播种密度为1.0×10⁴细胞/厘米²后,1、6、9和14天,孵化中被删除,取而代之的是100年μl新鲜培养基。然后,10μ肝癌和l的股票的解决方案(5毫克/毫升PBS)添加和盘子被孵化37°C 4 h。最后,100年μl 10%的十二烷基硫酸钠(SDS) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),在0.01 M盐酸,被添加到每个好,甲瓒形成的数量为540 nm使用基准标仪(美国Bio-Rad,里士满,CA)。每个时间点16井分析了三个独立的实验。

2.4。细胞刺激

HaCaT细胞的刺激,1.0×10的数量⁴细胞/在500μl被播种在24-well板和培养低或高^{2 +}介质,介质变化每两天。6、14天之后,中被删除,取而代之的是250年μL中等或无血清培养基,用TNF补充α(10 ng / ml)或il - 1β(10 ng / ml) (PeproTech EC,伦敦,英国)。

不同长度的时间后(6、24或48小时)37°C,两口井的上层清液为每个不同的治疗和时间都集中在一个管和冷冻−20°C随后分析细胞因子,趋化因子,生长因子。细胞层然后用PBS洗两次,Ca^{2 +}magnesium-free中等,干,储存在−20°C DNA分析的内容。

角化细胞的刺激皮肤活检,8 - 10×10⁴细胞/厘米²3毫升被播种在6-well板和培养低Ca^{2 +}介质,介质变化每两天。当细胞达到60% - -70%融合,中被删除,取而代之的是3毫升的无血清培养基,用TNF补充α(10 ng / ml)。经过48小时的潜伏期在37°C,上层的收集,冻结在−80°C,随后分析细胞因子,趋化因子,生长因子所描述的多路复用系统的部分。

2.5。释放的炎症介质

2.5.1。ELISA

释放CXCL8 / IL8和VEGF HaCaT细胞是人类ELISA量化通过使用两个不同的高灵敏度设置(美国新泽西Peprotech,落基山)下面描述的方法。短暂,康宁96 - EIA / RIA盘子从Sigma-Aldrich(意大利米兰)被涂上一层提供的抗体,一夜之间在4°C。矩阵metalloproteinase-9 (MMP-9) HaCaT细胞分泌物是由一组不同的ELISA评估(RayBio®人类MMP-9酶联免疫试剂盒,诺GA)使用预镀96孔板,提供的工具包。在所有的三个案例,300年μl的样本被复制到井在室温下2小时。结果检测到光谱(信号读取450海里,0.1年代,VictorTM X3)使用生物素化的和streptavidin-HRP共轭抗体,评价3、5、3、59-tetramethylbenzidine(三甲)底物反应。分析物的量化是通过使用一个优化的标准曲线提供的ELISA集。数据表示为pg / 10⁶细胞。结果均值±SD至少有三个独立的细胞培养实验一式两份。

2.5.2。Bioplex多路传输系统

浮在表面的获得主要从HaCaT细胞和角化细胞,刺激与TNFα48小时内(10 ng / ml),分析了存在的趋化因子,细胞因子和生长因子。关于趋化因子,我们化验科学家趋化因子配体(处于受控/ GRO CXCL10 / IP10 CXCL12 / SDF-1和CX3CL1 / fractalkine)和CC趋化因子配体(CCL2 / MCP1 CCL3 / MIP1a,亚兰/ MIP1b CCL5 /咆哮,CCL7 / MCP3 CCL11 / eotaxin和CCL22 / MDC)。在细胞因子,我们TGF化验α,肿瘤坏死因子β干扰素-α2,干扰素,γ、g - csf、gm - csf、il - 10、IL-12p70 IL-15, IL-33。所有因素量化同时Bio-Plex Pro人类细胞因子检测根据制造商的指示(Bio-Plex Bio-Rad实验室、钙、美国)。分析物的水平是决定使用Bio-Plex数组读者(美国Luminex、奥斯汀、TX)和Bio-Plex管理器软件。每个分析物的相对浓度是通过建立标准曲线,和结果表示为pg / 10⁶细胞。

2.6。DNA分析内容

DNA分析内容进行使用商业套装荧光的“FluoReporter蓝色荧光DNA定量工具”(分子探针,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)在96 -孔板后,制造商的指示。板治疗HaCaT细胞解冻,200μL H的蒸馏₂O是添加到每个。三个冻融循环后,100年μ然后将l转移到一个96孔板和用于分析。同时,校准曲线的标准使用增加浓度(0 - 1000 ng / 100μl)从小牛胸腺DNA的稀释在TE缓冲(10毫米三基地,1毫米EDTA在蒸馏H₂O整个溶液pH值= 7.4)。100的数量μL赫斯特的染料被添加到每个包含样品或标准,之前稀释1:400年在缓冲区(10毫米三,2 M氯化钠,1毫米EDTA最后pH值为7.4,叠氮化钠和2毫米)。发射的荧光测量与标TECAN F500 (TECAN、Maennedorf、瑞士)使用激发和发射波长346 nm和460 nm,分别。DNA含量计算的插值校准曲线上的样品的吸光度。DNA内容表示为μg DNA / 10⁶细胞计数,在每个使用伯克室和台盼蓝。

2.7。蛋白质的提取和分析的内容

总蛋白提取,HaCaT细胞培养14天6或通过适当的媒介。每个时间点的分化,细胞被洗冷PBS和细胞溶解里帕裂解缓冲(0.5%脱氧胆酸盐、1%诺乃清洁剂p 40, 0.1% SDS, 100μg /毫升phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF), 1毫米Na₂签证官₄和8.5μg⁄毫升抑肽酶,在PBS),震动了20分钟在4°C。样本收集的刮刀,孵化60分钟在4°C,和离心机12.000 rpm 15分钟在4°C,上层的收集和冻结在−20°C到使用。可溶性蛋白提取的量化描述的方法显示Lowry et al。19]。

2.8。免疫印迹分析

免疫印迹分析,40μl总蛋白质的7.5% SDS - page凝胶分离和转移到polyvinylidenedifluoride转移薄膜(PVDF)(美国Bio-Rad,里士满,CA) 16 h 150 mA,使用传输缓冲区(25毫米TrisHCl, 190毫米甘氨酸,甲醇,20%和0.05% SDS)。膜被孵化在阻断缓冲区(PBS包含0.1%的渐变和5%干脱脂牛奶)在室温下2 h和30分钟。然后,一夜之间,膜被涂抹在4°C与各种基本抗体稀释,具体来说,兔多克隆免疫球蛋白anti-involucrin (1: 2500;Genetex欧文分校、钙、美国),鼠标多克隆免疫球蛋白anti-cytokeratin 14 (1: 1500;圣克鲁斯生物技术有限公司、圣克鲁斯、钙、美国),兔单克隆免疫球蛋白anti-cytokeratin 10 (1: 10000;Genetex欧文分校,美国)。鼠单克隆抗β肌动蛋白抗体(1:6000;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)用于凝胶装入正常化。墨迹洗了6次了pbs - 0.1%渐变和孵化1 h与辣根在室温下peroxidase-linked二级抗体。Involucrin K10被发现和一头驴anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 10000;圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国)。对于K14和肌动蛋白,一只山羊anti-mouse免疫球蛋白g (1: 10000;圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,使用美国CA)。屁股都是由ECL免疫印迹检测LiteAblot®+配套试剂(Euroclone S.P.A.后,米兰,意大利),制造商的协议。免疫反应性的蛋白质用放射自显影法在Hyperfilm发射极耦合逻辑(英国通用电气医疗集团生命科学)。带信号的相对强度量化的数字扫描测密度术,和β肌动蛋白是蛋白质含量用于标准化结果。

2.9。免疫荧光

HaCaT和初级角质细胞,培养8-well幻灯片上房间,洗了PBS,固定,在冰冷的甲醇permeabilized 5分钟。首先,细胞被孵化PBS中含0.1%牛血清白蛋白(BSA) 10分钟,然后是孵化主要抗体K10(兔单克隆免疫球蛋白anti-cytokeratin 10;1:200;美国Genetex欧文CA) 60分钟包含1% BSA在PBS。二次抗体的细胞随后被孵化Alexa萤石®488 -标记山羊anti-rabbit免疫球蛋白和Alexa萤石488 -标记山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 1000年,表达载体,生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国)30分钟,分别。细胞的核沾染了4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),专门识别DNA。幻灯片观察用尼康Eclipse TE200倒置显微镜与浸客观60 x放大和尼康数码相机拍照(尼康、日本)。

2.10。统计分析

数据表示为均值±SD至少三个实验在重复执行。未配对进行分析的数据单向方差分析(方差分析)Bonferroni事后考验紧随其后。统计分析是使用GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥、钙、美国)。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。细胞外钙的影响^{2 +}和细胞密度HaCaT细胞的增殖和分化

建立和验证HaCaT细胞作为一个在体外模型来研究人类角质细胞的炎症反应,两个已知的KC刺激分化,细胞密度和细胞外钙^{2 +}浓度,使用。HaCaT细胞被镀在同一密度低(0.07毫米)和高(1.8毫米)^{2 +}中,细胞增殖是评估通过MTT实验和细胞计数在一天一天6和14。

在低钙^{2 +}媒介,稳步增加代谢活动观察和细胞数量随着时间的推移,在高的Ca^{2 +}中,细胞生长慢。比较低到高^{2 +}肝癌和媒介,约减少27.5%和70.3%的活性和细胞计数下降40%和60%在天6 - 14日(图2(一个)和表1)。然而,没有明显的细胞形态的变化在不同的条件下观察。相衬图片显示HaCaT细胞增长持平,分散后6天在低(A6)或高(C6) Ca^{2 +}在80%时融合媒介;14天在低(单元)和高(C14) Ca^{2 +}较高的浓度,他们变得更加立方体形细胞间包装和分层(图S1)。报道在表1,没有观察到显著变化的DNA和蛋白质含量在HaCaT细胞生长在介质不同的Ca^{2 +}浓度在6日或14天。

三个经典的表达KC分化标记(K14、K10 involucrin)变化而在细胞密度和细胞外钙^{2 +}通过免疫印迹分析评估水平。生理、K14的表达仅限于表皮基底层,而K10和involucrin表示更多的分化表型。

如图2 (b),K14的表达在HaCaT细胞比overconfluent细胞融合(6天)80%(14天)。同时,K10和involucrin从6到14天,增加确认的角色分化的细胞密度。比较每天6到14日低Ca的成倍增加^{2 +}比K10 involucrin媒介更明显(10.4倍和5.7倍,分别地),而在高Ca^{2 +}介质,分别增长4.7倍和3.2倍。

关于Ca的效果^{2 +}在第六天,HaCaT细胞表现出类似水平的K14、K10、或involucrin A6和C6文化条件,表明Ca^{2 +}浓度没有显著影响其表达在80%细胞融合(图2 (b))。出乎意料地,在第14天,K10和involucrin略低的水平在overconfluent HaCaT细胞生长在高与低钙^{2 +}介质(图2 (b))。这个结果可能是由于其较低的密度(表1)。

收购HaCat cell-differentiated表型证实了免疫荧光实验(图2 (c))。分化标记的表达在HaCaT K10显著增加细胞相比,14天6细胞几乎100%是正面的。此外,再一次,没有看到K10水平差异HaCaT细胞间生长在低或高^{2 +}媒介在支流或overconfluent细胞的80%。控制样品没有初级抗体是阴性,确认特异性(数据未显示)。

K10表达的模式也是评估主要人类角质细胞生长在低钙^{2 +}和无血清培养基。有趣的是,如图2 (c)、K10表达人类主要角质细胞平行HaCaT细胞在低增长为6天^{2 +}介质(A6)。

3.2。从HaCaT细胞炎症介质的释放

HaCaT细胞生长在不同文化条件下上述被用来评估生产一系列的生物活性分子,被发布在皮肤炎症或修复,在基础条件和炎性刺激。

在第一组实验中,我们集中在三个主要介质:CXCL8 / IL8, VEGF, MMP-9,炎性细胞的关键招聘,血管生成,分别和矩阵重构。肿瘤坏死因子α和il - 1β被用作刺激。血清的影响在中也被证实。

镀的上层清液得到HaCaT细胞在同一密度低或高^{2 +}媒介和治疗,经过6到14天的文化,与10 ng / ml TNFα或il - 1β6、24 h,表示,在没有(图2(一个)血清(图)或存在2 (b))。上层清液被恢复到测量CXCL8 / IL8, VEGF, MMP-9 ELISA测试。结果报道在图3和图S2。

与基底的水平相比,与肿瘤坏死因子的刺激α在缺乏血清诱导显著增加CXCL8 / IL8 MMP-9,但不是VEGF,在低和高Ca^{2 +}媒介在天6(图3(一个))。相反,血清中肿瘤坏死因子的存在α治疗6天没有引起明显的影响CXCL8 / IL8释放降低TNFα全身MMP-9释放和增加基底和刺激VEGF水平(图3 (b))。浓度成倍增加,肿瘤坏死因子α血清刺激,是独立的。

总的来说,似乎HaCaT细胞释放化学介质的能力明显下降,14天,6天相比,这是独立的Ca^{2 +}浓度和血清的存在(图3)。值得注意的是,MMP-9释放数量在6天14没有高于血清的存在,无论是在基础条件和刺激。

当细胞被观察到了类似档案与il - 1刺激β(10 ng / ml)(图S2)。更高水平的CXCL8 / IL8、VEGF和MMP-9被认为在6天,14天相比,独立于血清或Ca^{2 +}浓度。在血清的存在,如果比无血清细胞产生更高水平的介质,,除了IL8, VEGF的增加或MMP-9引发了il - 1β不显著。

扩展这些观察,不同的趋化因子和细胞因子研究了磁珠悬浮阵列使用Bio-Plex职业技术。无血清培养系统的实验来减少前面的段落中描述的干扰。如数据所示4(一)和4 (b),与TNF HaCaT细胞的刺激α(10 ng / ml) 48 h导致分泌的upregulation几乎所有18介质测试在不同的文化条件下,尽管它们之间的不同程度的刺激。特别是,高6天的文化在Ca^{2 +}浓度似乎代表了最佳组合的最优生产大多数介质,除了亚兰/ MIP1b,正无穷α2、正γ和g - csf。值得注意的是,CCL7 / MCP3似乎是唯一的细胞因子TNF强烈调节α独立的文化和Ca的日子^{2 +}浓度,而CCL22 overconfluency / MDC是唯一的细胞因子,而不是Ca^{2 +}水平,导致其生产。相反,Ca^{2 +}浓度,但天文化,似乎特别与肿瘤坏死因子相关α全身的gm - csf的释放。没有可测量的值CXCL12 / SDF-1 CX3CL1 / fractalkine或IL-33得到样本(数据未显示)。

3.3。炎症介质的释放主要人类角质细胞

炎症介质的释放也主要以nonlesional表皮;从银屑病患者。这些细胞生长在低钙^{2 +}测试中,当在60 - 70%融合,显示K10表达式与A6 HaCaT细胞(图2 (c))。关于生产的细胞因子/趋化因子,分泌正常;基础水平的分子与肿瘤坏死因子分析和治疗α诱导几乎所有人的进一步增加(数据5(一个)和5 (b))。所有的科学家趋化因子家族成员似乎高度调节,达到一个值的CXCL8 / IL8超过20000 pg / 10⁶细胞(图5(一个))。在CC趋化因子中,只有CCL2显示大约五倍增加控制之上。值得注意的是,高浓度的生长因子,转化生长因子α和gm - csf中检测出的媒介主要与肿瘤坏死因子;刺激α(图5 (b))。

4所示。讨论

角质化细胞活跃玩家在皮肤的表皮修复和免疫防御的分泌生长因子,细胞因子和趋化因子。促进和规范在体外研究;,我们调查了使用HaCaT细胞作为一个合适的模型跟随皮肤炎症和修复的释放介质对TNF的回应α或il - 1β,在不同的培养条件和分化水平。

HaCaT细胞是长寿的,自然不灭的人类KC,展览基底细胞属性和显示响应两种行之有效的大幅变动在体外prodifferentiating代理:细胞密度的增加,在文化作为时间的函数,细胞外钙^{2 +}浓度。

从低到高细胞外钙^{2 +}浓度被认为是不仅KC分化的主要监管机构,但也的扩散在体外和在活的有机体内。Ca^{2 +}梯度内表皮促进基底细胞层的顺序分化KC角质层。此外,钙^{2 +}调节细胞桥粒的形成,附着连接和紧密连接。后者维护信息粘连和扮演重要的角色在细胞内信号调节Ca^{2 +}水平和细胞周期阻滞,分化过程的关键(12]。

记住这一点,我们首先测试HaCaT细胞的分化潜能的细胞密度和增加细胞外钙^{2 +}浓度,通过评估三个标记的表达的区别,即K14、对限制表达的基底层,K10、involucrin表明一个更分化表型。我们的数据(图1和表1)确认和扩展先前的观察,细胞密度的增加和细胞外钙^{2 +}浓度有利于HaCaT分化(14- - - - - -17]。HaCaT细胞保留在基底状态(高水平的K14)保持在低钙^{2 +}条件和汇合的不到80% (A6),当他们开始分化后表达高水平的K10和involucrin长期文化(阿),那时,尽管保持低的Ca^{2 +}媒介,它们overconfluent。不同于之前的观察,我们发现HaCaT细胞保持基底表型也当高Ca的细胞培养^{2 +}条件,但不到80%的融合。这个观察表明,尽管细胞外钙^{2 +}> 0.1毫米似乎HaCaT分化的主要监管机构,细胞密度也相应的作用,它在以前可能被低估了在体外研究。

此外,在我们的研究中,K10和involucrin表达的免疫印迹分析表明,当HaCaT细胞保持高的Ca^{2 +}条件下,overconfluence促进K10和involucrin水平略有下降,疲软的增长K14。尽管这种观点可能是一个低密度的结果C14阿,这些数据与Ca的变化一致^{2 +}K1和confluence-dependent表达,更多的分化细胞的生物标志物20.),但没有报告转谷氨酰胺酶的生物标志物的变化17]。完全,这强调分化标记表达式的仔细监控的重要性在长期的文化HaCaT细胞和培养条件的标准化。

Ca的效果^{2 +}开关的扩散HaCaT细胞研究甚少。我们的可行性分析和细胞计数细胞外钙的亮点^{2 +}浓度强烈影响HaCaT细胞的增殖能力。第二天的文化,没有HaCaT细胞的增殖率的差异生长在低或高^{2 +}中出现,而不同的增长率明显低^{2 +}媒介从6天,在第14天成为更高。这些研究结果的方差显示出进步,时间增加高HaCaT扩散的Ca^{2 +}介质(14]。一个可能的解释可能是更高的细胞外钙^{2 +}本研究中使用的浓度(1.8毫米)相比,1.2毫米(14]。事实上,它已经证明,只有细胞内钙的增加^{2 +}浓度超过1.5毫米导致降低增长率(21]。

在本研究的第二部分,HaCaT细胞,培养在低或高^{2 +}介质在不同长度的时间内,被用来调查CXCL8 / IL8的释放,VEGF, MMP-9回应两个炎性刺激、TNFα,il - 1β。这些细胞因子选择的主要发病机理中的作用皮肤炎症,因为他们都调节基因以前是专门在银屑病(10,22- - - - - -24]。我们的结果表明,释放CXCL8 / IL8, VEGF, MMP-9高HaCaT细胞基底状态(A6-C6)相比,更多的分化细胞(A14-C14)。Ca^{2 +}浓度稍微增强这些介质的分泌,尤其是il - 1β被用作促炎的刺激;这种效应可以部分解释为Ca的激活^{2 +}响应启动子的激活蛋白(美联社)1 (25]。

血清的存在降低了TNFα全身释放MMP-9和增强VEGF的分泌,在基底和刺激的水平。之前报道,来自胎牛血清生长因子可能会影响各种参数参与KC增殖,分化和伤口愈合过程(26- - - - - -28]。基于这些结果,我们强烈建议不应使用血清促炎介质时,VEGF,或MMP-9化验。这也应该扩展到化验使用正常的人类KC。

数篇论文表明TNFα在KC调节不同的基因参与炎症和血管生成,如il - 1、ICAM-1, VEGF (29日,30.),TGF -β趋化因子(CCL20 CCL27、CCL5 CCL2, CXCL10,和CXCL11),和CXCL8家族的成员,包括处于受控,CXCL2, CXCL3 [10,22,23]。因此,使用多路复用技术,我们评估的影响^{2 +}浓度和细胞密度在不同细胞因子的分泌,趋化因子,生长因子在HaCaT细胞系。所有的分析参数被肿瘤坏死因子调节在很大程度上α天6天相比14;似乎只有CCL22 / MDC优先释放更多的差异化HaCaT细胞。亚兰,正α2、正γ,g - csf有更高的版本低的Ca^{2 +}条件,而相反的,在高的Ca^{2 +}浓度、同等或更高的分泌CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CCL11, CCL22,处于受控,CXCL10 TGFα肿瘤坏死因子-β、il - 10和IL-15是观察。总而言之,长期的文化和Ca^{2 +}在中浓度影响的能力HaCaT细胞释放趋化因子和生长因子。

最后,为了验证HaCaT细胞作为一个可靠的模型来分析人类;炎症/维修响应,我们测量炎症介质的释放在初级nonlesional表皮;从银屑病患者。这些细胞在低Ca化验^{2 +}中、在没有血清。

科学家的趋化因子家族的水平,引起肿瘤坏死因子α对人类;(CXCL8,处于受控和CXCL10)公布的值相关的相对较好HaCaT细胞在低钙^{2 +},考虑到折叠感应。类似的结果(TGF生长因子释放α,g - csf, gm - csf和VEGF)。不那么密切相关的CC趋化因子家族其中一些(亚兰,CCL5 CCL7, CCL11)在A6和C6 HaCaT细胞高度释放,但在正常的人类很低;;CCL2高在C6 HaCaT正常;而CCL3是相似的。我们的研究结果还表明,HaCaT细胞尤其是在第14天的文化产生更多CCL22 /比正常的人类;争取民主变革运动,从而确认先前公布的数据(31日,32]。这已经不是第一次微分释放趋化因子是主要描述人类;或HaCaT细胞与外源性刺激刺激。数据在文献中报道,CXCL10和IL8发布类似程度的细胞类型,尽管CXCL9和CCL20是更有效地产生的主要人类;(33]。

总之,本研究是第一个报道,几个变量,所有在一起,包括Ca的影响^{2 +}浓度、细胞密度、分化状态,和血清的存在,被认为可能影响因素;释放促炎介质。我们的研究结果支持使用HaCaT细胞系,精心优化下在体外条件,作为一个可靠的模型,对正常的;,筛选新的抗炎化合物对皮肤疾病。事实上,HaCaT细胞系已成功用于研究这些病态皮肤角化细胞的参与,如传染性疾病或肿瘤,或在体外人类皮肤致癌模型(34]。由调制Ca^{2 +}浓度培养基和维持80%的融合,HaCaT细胞产生细胞因子的条件中/低水平(A6条件)或在中/高水平(C6条件)一如预期在高度激活;从皮肤损伤。这在体外系统的优点是可再生的、可靠的和明确微创和可变性比从皮肤活检KC。然而,其中一个缺点是无法复制的复杂性皮肤和细胞异质性在基底或炎症条件。2 d-3d文化系统提出了模仿分化过程(35]。它不能被排除在外,在相对较短的时间我们可能可用的三维培养系统中几个细胞谱系KC,免疫细胞和成纤维细胞将cocultured确保更好的繁殖皮肤微环境。

缩写

创新领导力:	主题趋化因子配体
CXCL:	C-X-C主题趋化因子配体
CX3CL:	C-X3-C主题趋化因子配体
g - csf:	粒细胞集落刺激因子
gm - csf:	集落刺激因子
干扰素:	干扰素
IL:	白介素
凯西:	角蛋白
余:	角化细胞
MMP-9:	矩阵metalloproteinase-9
TGFα:	转化生长因子α
肿瘤坏死因子α:	肿瘤坏死因子α
肿瘤坏死因子β:	肿瘤坏死因子β
VEGF:	血管内皮生长因子。

信息披露

尤兰达Corbett目前的地址是Dipartimento di Bioscienze意大利degli某在米兰,通过Giovanni Celoria 26日20133米兰,意大利。

的利益冲突

作者状态无利益冲突。

确认

作者感谢佩特拉Boukamp博士和教授Norbert Fusenig从是Stiftung des offentlichen雷希特(德国癌症研究中心),Im Neuenheimer菲尔德280年,d - 69120海德堡,德国,提供HaCaT细胞系。的金融支持Ministero戴尔'Istruzione,戴尔'Universita e德拉Ricerca(普林斯顿,格兰特2010 c2lkkjskinflam)多娜泰拉·Taramelli,安吉拉Gismondi,斯特凡诺Calvieri承认。多娜泰拉·Taramelli承认CM1307成本的支持行动。基金会支持的工作部分Cariplo MDA (HyWoNNa项目资助)。

补充材料

补充1。表1:细胞复苏和蛋白质含量HaCaT细胞生长在低(A)或(C) Ca^{2 +}媒介6 (A6, C6)或14(阿,C14)天。

补充2。图S1: HaCaT细胞形态学的变化在细胞分化。

补充3。图S2:体外释放CXCL8 / IL8, VEGF, MMP-9 HaCat细胞il - 1的刺激β在细胞分化。