通过HMGB-1 Saquinavir改善肝脏温暖Ischemia-Reperfusion-Induced肺损伤和P38 / JNK-Mediated TLR-4-Dependent信号通路

文摘

肝脏缺血再灌注(I / R)诱导地方和遥远的组织损伤,导致发病率和死亡率在一个广泛的病态。尤其在不受控制的无菌性炎症条件下,导致远程器官的损伤,如肺损伤,甚至失败。Saquinavir (SQV)是一种HIV蛋白酶抑制剂,具有抗炎性质。在这项研究中,我们调查是否SQV抑制toll样受体4 - (TLR4)依赖的信号通路的高机动组框1 (HMGB1)和P38 /物,赋予保护小鼠肝脏I / R-induced肺损伤。调查我们的假设,C57BL / 6小鼠和TLR4基因敲除小鼠(TLR4^−−/)被用来执行这项研究。SQV政府明显减毒远程长达6小时缺血和再灌注后肺组织损伤的肝脏。对我们的期望,SQV减毒I / R-induced肺部水肿、研究进展和病理损伤。SQV的有利影响与降低水平的循环和肺组织炎症相关细胞因子,il - 6、il - 1等β肿瘤坏死因子-α,进气阀打开。SQV的保护作用也与肺组织HMGB1的表达减少,地,和p-P38 /物,但不是p-ERK在野生型小鼠肝脏I / R。总的来说,这项研究证明了一个新的角色SQV,促进负监管HMGB1 -和P38 / JNK-mediated TLR-4-dependent信号通路,赋予保护肝脏I / R-induced肺损伤。

1。介绍

肝脏I / R引起系统的无菌炎症,不仅损害当地机关本身,也导致了不受控制的系统性炎症,导致远程器官损伤和发病率(1- - - - - -3]。几项研究已经报道,肺部很容易容易损坏在肝脏I / R (4,5]。

toll样受体(通常)是最彻底的研究前哨模式识别受体(PRRs) (6- - - - - -8]。最近,我们(9)和其他(10- - - - - -12已经确定,TLR4扮演着不可或缺的角色在肝脏I / R损伤。高机动组box1 (HMGB1)是最初发现作为核蛋白质释放到胞质甚至细胞外空间以应对具体情况(13,14]。值得注意的是,HMGB1已经被确认为一种内源性TLR4配体(15,16)和证据表明,HMGB1-TLR4激活可以导致急性免疫病理失调状态,如I / R (10),出血性休克17),和创伤(18]。此外,TLR4还参与不仅HMGB1的识别还在上映15]。增殖蛋白激酶(MAPKs)显著信号组件,将细胞外刺激转化为细胞反应(19,20.]。此外,研究已经证明,HMGB1调节炎症反应通过MAPK信号通路(14,19]。

SQV第一代艾滋病毒蛋白酶抑制剂,具有抗炎特性。Gero等人,Pribis et al。21,22)最近发现SQV medium-throughput筛查试验。结果显示,SQV增强小鼠盲肠的结扎后的生存和穿刺(CLP)和减少温暖在肝脏I / R损伤。此外,这项研究证明SQV抑制HMGB1-driven炎症通过针对TLR4 / MyD88[之间的相互作用22]。

因此,我们探索SQV能否保护引起的肺部炎症和损伤肝脏I / R通过TLR4 / HMGB1信号通路。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性野生型小鼠(C57BL / 6;8 - 12周大)买了从上海实验动物有限公司(线性、上海、中国)。TLR4基因敲除(TLR4^−−/)老鼠请提供的蒂莫西·r·Billiar博士(美国匹兹堡大学)。所有的老鼠在12 h日夜周期在特定无菌气氛在上海同济大学。动物协议是同济大学的伦理委员会批准,和实验按照美国国立卫生研究院的实验动物的使用指南。

2.2。肝脏I / R损伤模型的制备

温暖的模型部分肝I / R是如前所述[准备9]。简而言之,在一个适当的水平的麻醉(100毫克/公斤氯胺酮和10毫克/公斤甲苯噻嗪)已经达到,中线进行剖腹手术,防止损伤的剪辑是用来中断门户的动脉和静脉血液供应左外侧和中间的叶肝脏。虚假的没有血管阻塞控制老鼠经历了同样的过程。老鼠遭受与部分肝缺血1小时。然后,老鼠牺牲后6小时或者12小时再灌注,和肺组织和血液样本用于分析。SQV(0.5毫克/公斤)或无毒DMSO了1 h前预处理缺血再灌注的时候。,物抑制剂(10毫克/公斤SP600125;Calbiochem)和P38抑制剂(10毫克/公斤SB203580;SQV Calbiochem)管理。

2.3。组织学检查

正确的优越叶肺的每个模型被用于组织学苏木精伊红染色())。评价程度的肺损伤,肺实质的组织学变化定量分级规模从0到2(通过肺泡和毛细血管水肿,血管内和支气管旁大量炎症细胞,肺泡壁的厚度,和出血)(23]。

2.4。伊文思蓝的Alveolar-Capillary渗透率白蛋白(EBA)

Alveolar-capillary渗透率与EBA估计根据我们之前描述(23,24]。EBA通过静脉注射jugularis答辩前1 h牺牲所有的模型,然后,肺组织被保留做进一步的研究。

2.5。湿/干比(W / D)

肺部水肿是衡量组织W / D比率。解剖后,对肺样本体重,然后放在干燥箱在67°C至恒重。

2.6。细胞因子的测定

血清和BALF的TNF -水平α,il - 6、il - 10和巨噬细胞炎性蛋白- 2 (MIP)测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA、研发系统、美国)。

2.7。RNA提取、逆转录PCR和实时定量PCR

RNA提取使用试剂盒试剂从肺组织(Sigma-Aldrich)根据标准协议23]。所有的引物合成Sangon生物技术(上海,中国)。引物序列表1。

2.8。免疫印迹分析

HMGB1蛋白免疫印迹,TLR4 p-P38 / P38和p-JNK /物在肺组织作为执行标准协议(9]。膜被封锁5%脱脂奶,孵化用鼠标主要抗体HMGB1(美国Abcam), TLR4(美国Abcam) p-JNK /物(美国CST)和P38(美国AR)和p-P38 (SAB、美国),和我κBα和导出κBα(美国CST)一夜之间,然后用二次孵化抗体(美国Licor生物科学)。

2.9。TUNEL分析

这是执行检查肺使用原位细胞凋亡细胞死亡POD工具包(美国罗氏公司)根据标准协议(25]。

2.10。免疫组织化学(包含IHC)

包含IHC了巨噬细胞和中性粒细胞入渗使用CD11b和Ly6G抗体(Servicebio,中国)26]。

2.11。统计分析

结果意味着±标准平均误差(SEM)至少三个重复实验。统计分析了使用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。使用学生的分析t以及或单向方差分析。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。肝脏I / R介导局部肝和远程肺损伤

是否再灌注时间可能影响损伤程度,我们执行)染色肺和肝脏组织的I / R和虚假的团体有/没有1 h(肝脏缺血再灌注后6 h或12小时时。结果表明,炎症细胞和结构性破坏很容易观察到在肝脏和肺组织(图1(一))。此外,肝细胞损伤的程度是衡量血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)水平。结果表明,水平显著增加I / R组相比,虚假的组(图1 (b))。然而,没有明显的再灌注6小时和12小时之间的区别。因此,6 h是随着再灌注时间用于以下实验。

3.2。SQV可以改善温暖引起的肺损伤肝脏I / R

)染色法被用来评估肺组织的一般形态。与假组相比,肺损伤评分显示更高水平的I / R组,但明显降低水平I / R + SQV组和I / R组(图2(一个))。另一方面,EBA和W / D比率显示显著改善肺渗透率和水肿的SQV(图2 (b))。此外,细胞数量和总蛋白质含量的I / R组明显高于那些虚假的组,和所有这些因素在I / R + SQV组显著减少与I / R组(图2 (c))。最后,细胞凋亡(Tunel⁺)进行分析,显示SQV治疗后肺组织中凋亡率降低I / R老鼠(红色箭头,图2 (d))。总的来说,这些结果表明,SQV具有积极作用衰减引起的肺损伤肝脏I / R温暖。

3.3。SQV调节肝脏I / R后巨噬细胞在肺部

巨噬细胞(CD11b⁺)和中性粒细胞(Ly6G⁺)分泌各种细胞因子起着至关重要的作用。包含IHC表明巨噬细胞主要是由SQV干预治疗肝脏I / R老鼠(红色箭头标记,图3(一个))。此外,MIP-2水平在支气管肺泡灌洗液(BALF)中表达下调I / R小鼠SQV治疗(图3 (b))。此外,NF-kB通路中起着重要作用促进细胞因子的释放;改变内源性NF-kB我可以测量κBα退化,退化开始当NF-kB被激活(27]。免疫印迹分析(图3 (c))我的一个重要upregulation展出κBα在小鼠肺I / R SQV对待。

3.4。SQV抑制促炎细胞因子和移植抗炎细胞因子的释放后的血清和BALF温暖肝脏I / R

为了测试SQV是否会影响细胞因子的生产,ELISA。BALF促炎细胞因子,肿瘤坏死因子-α,il - 6增加I / R组与虚假的集团相比,但是他们的水平显著降低I / R + SQV组。此外,il - 10,作为抗炎因子,增加BALF中I / R组相比,虚假的组。否则,il - 10水平更高的I / R + SQV组相比I / R组(图4(一))。也观察到类似的结果血清(图4 (b))。

3.5。SQV影响细胞因子在基因转录水平肝脏I / R后肺组织

qPCR进行进一步调查SQV的影响生产的各种因素。为了满足我们的期望,促炎的因素,如肿瘤坏死因子-α、il - 6、il - 1β,进气阀打开,都显著增加I / R组相比,虚假的组,但明显降低在观察这些基因的转录与I / R + SQV组(图5(一个))。当然,il - 10的表达后血清和BALF的蛋白质水平的结果(图5 (b))。

3.6。SQV变弱HMGB1和TLR4表达水平和影响MAPK信号蛋白的磷酸化肝脏I / R后肺组织

免疫印迹和qPCR进行调查SQV的潜在机制。结果显示炎症减少肝脏I / R后SQV治疗。TLR4(图6(一)),HMGB1(图6 (b))蛋白质含量明显增加I / R组相比,虚假的组和视觉I / R + SQV组降低了免疫印迹。类似的结果经qPCR(图6 (c))。MAPK信号蛋白的磷酸化也测量(图6 (d))。有趣的是,磷酸化物和P38明显减少I / R + SQV组I / R组相比,但显示没有改变ERK的磷酸化。总的来说,这些结果暗示SQV可以调解TLR4 / HMGB1-JNK和P38 MAPK信号通路来改善肝脏I / R后肺损伤。

3.7。HMGB1和P-JNK / P38明显减弱TLR4-Targeted小鼠的肺组织

先前的研究表明TLR4系统可能发挥关键作用HMGB1-mediated肝脏I / R损伤,和TLR4-targeted老鼠不受政府影响rHMGB1或中和抗体HMGB1在肝脏I / R与TLR4-intact小鼠相比10]。因此,我们使用TLR4^−−/老鼠探讨TLR4是否会改变HMGB1的释放和减少物的磷酸化/ P38 MAPKs肝脏I / R后肺组织。免疫印迹分析进行肺TLR4的溶解产物^−−/老鼠被肝脏I / R(图7)。1 h后温暖的缺血和再灌注6小时,HMGB1蛋白表达TLR4没有upregulation示威^−−/小鼠与野生型小鼠相比(图7 (c))。同时,P38(图7(一))和物磷酸化(图7 (b)在TLR4)^−−/小鼠肝脏I / R比TLR4-intact减少老鼠。

3.8。P38和物抑制剂可以减弱引起的肺损伤肝脏I / R

最后,我们调查是否P38 /物MAPKs是HMGB1-denpendent / TLR4信号通路的下游分子。野生型小鼠肝脏I / R使用SB203580或SP600125作为实验组。肺)染色进行(数据8(一个)和8 (b))。结果表明,两种抑制剂显著改善在I / R + SQV组相比,I / R组。此外,我们发现肺W / D比率,总细胞数,在BALF和蛋白质浓度符合我们的预期。结果表明,两种抑制剂可以减轻肺损伤引起的肝脏I / R(数字8 (c)和8 (d))。重要的是,HMGB1蛋白水平并没有明显减少了SB203580(图8 (e))和SP600125(图8 (f))治疗组肝脏I / R。这些结果表明,P38 /物MAPKs位于下游的TLR4 / HMGB1。

4所示。讨论

肝脏I / R分为热缺血和冷缺血;然而,这两类疾病病因中共享一个共同的机制,主要包括局部损伤和连续系统的炎症级联(28,29日)远程器官损伤(30.),尤其是对肺。这noninfective肺部炎症激活各种特定或非特异性信号通路。这反过来加剧炎症反应失控,导致全身炎症反应综合征(SIRS),急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI / ARDS),甚至死亡(31日,32]。

HMGB1作为后期中介与其他细胞因子的释放33,34),如TNF和il - 1,在应对致命性脓毒症以及坏死后,但不是凋亡或死亡。然而,Tsung等人已经展出,HMGB1被调节早期培养肝细胞在缺氧和温暖的体内肝脏I / R (10]。TLR4参与了I / R-induced在几个器官除了肝脏炎症(35]。我们最近锅发现TLR4结合Wnt-induced分泌蛋白1 (WISP1)参与肝脏I / R损伤(9]。然而,TLR4结合HMGB1参与I / R损伤,这是一个传统的信号通路,其参与肝脏I / R-induced肺部炎症和损伤仍不清楚。

我们的研究的目的是为了测试是否第一代艾滋病毒蛋白酶抑制剂、SQV,可以抑制TLR4 / HMGB1信号保护引起的肺部炎症和损伤肝脏I / R。这次调查的主要和小说发现包括以下:(a) SQV改善肺结构损伤、水肿、和温暖渗透引起的肝脏I / R;(b) SQV减毒促炎因子的表达,如il - 6、TNF -α,il - 1β,进气阀打开,而调节抗炎因子的表达,il - 10;(c) SQV减少循环和肺BALF profactor水平,il - 6和TNF -α,和增强antifactor il - 10水平;(d) MIP-2和我κBα水平受SQV肝脏I / R后的肺;此外,中性粒细胞显示微妙的变化,但巨噬细胞以及凋亡细胞SQV治疗后肺组织明显减少;(e) TLR4、HMGB1和磷酸化P38 /物MAPKs被SQV明显抑制肺组织在肝脏I / R。与此同时,随着可以释放HMGB1肝IR、凋亡细胞和坏死细胞之后,循环HMGB1含量检测并显著增加肝脏I / R后,但逆转SQV治疗(图补充1)。这些结果提供的证据表明,SQV可以对抗肝脏I / R损伤。

进一步研究TLR4的机制/ HMGB1-P38 /物MAPK pathway-mediated肺损伤肝脏I / R,我们使用TLR4^−−/小鼠作为车辆遵守HMGB1的变化和磷酸化P38 /物在肺组织肝脏I / R。我们的结果(图7)表明,HMGB1和磷酸化MAPK明显减少。此外,P38和物抑制剂在肝脏I / R管理野生型小鼠(图8)证明MAPKs中HMGB1的下游炎症信号通路,影响肺损伤的程度在肝脏I / R老鼠。尽管如此,它仍然是未知是否upregulation释放HMGB1的肝脏通过血液循环或生产本身或两个在一起。尽管SQV可以发挥抗炎作用的TLR4 / HMGB1 MAPK信号通路,它们之间的深入的关系需要进一步探索。高级糖化受体的终端产品(狂怒)[20.,36也被称为HMGB1的受体,它在肺损伤中扮演更重要的角色在肝脏I / R。相比之下,P38和物磷酸化ERK的磷酸化显示区别在肝脏I / R /没有SQV治疗。因此,它被认为是一个有趣的问题,需要进一步调查。

5。结论

最重要的是,我们的研究表明,SQV可以减弱引起的肺损伤肝脏温暖通过HMGB1 - I / R和p38 / JNK-mediated TLR-4-dependent信号通路。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突,可能会被认为影响报告的结果和讨论。

作者的贡献

庄羽,姚明同样通了这项工作。

确认

作者的感激财政支持中国的国家自然科学基金(81270735,81270735)。作者还要感谢教授蒂莫西·r·Billiar SQV提供了对他的帮助。

补充材料

图1:补充循环HMGB1水平在所有的群体被ELISA检测。SQV可以有效减少肝脏I / R后HMGB1水平。GraphPad值均值±SEM。 与虚假的集团; 而肝脏I / R组温暖。(补充材料)

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