哮喘和囊性纤维化患儿口咽微生物群的比较

摘要

真正的微生物群存在于肺中，由口咽微生物群定植而产生。在患有哮喘或囊性纤维化(CF)的患者的下气道中，口咽微生物群的变化可能是生态失调的来源。为了验证这一假设，我们比较了健康儿童( ）从哮喘的儿童（ ）和cf（ ）使用16S rRNA扩增子测序为6至12年。我们的结果显示了健康对照和哮喘儿童之间的高水平相似性，并揭示了所代表的核心微生物组的存在普氏菌，链球菌，奈瑟氏菌属，韦永氏球菌属,嗜血杆菌．而在CF中，53个OTUs的全球多样性、细菌负荷和丰度显著降低，而代表条件致病菌的6个OTUs的丰度显著降低，如假单胞菌，葡萄球菌,链球菌与健康对照组和哮喘患者相比增加了我们的数据揭示了健康儿童喉咙中的一个核心微生物群，该微生物群在哮喘和CF中持续存在，表明共同的宿主调节有利于共生菌的生长。此外，我们提供的证据表明，在CF患儿中存在与宿主防御受损相一致的已知病原体，从而导致生物多样性和生物量的减少。

1.介绍

自出现以来，原核生物在从极端微生物到真核宿主的所有生态位上都占有一席之地。其中一个长期被认为是无菌的小生境是人类的下呼吸道和肺[1］．值得注意的是，甚至在一个世纪以前，人们就已经认识到，肺部不断暴露在吸入空气和上呼吸道中的微生物中[2］．下呼吸道无菌性的结论是基于标准微生物学的阴性结果，但该结果有利于致病菌的生长，而不是设计来捕捉所有细菌种类(特别是厌氧菌)[1］．

Airway微生物学仍处于破译的开始，然而随着研究和下一代测序的进步，现在已经确定了健康受试者的下呼吸道由细菌由由核心成员，伯氏菌所占主导地位的口咽微生物群和植物phy1a [1］．这些发现是一个理论的基石的收购航空公司的微生物基于岛上模型:较低的航空公司(“群岛”)微生物群是上呼吸道的殖民的结果(“大陆”)由区域增长的消除从主机和条件(3.，4］．在一个健康的个体中，定植和消除之间的平衡导致一种中性平衡，即来自上呼吸道最丰富的微生物是在下呼吸道最常见的细菌[5］．

随着高通量测序技术的进步，肺部微生物学的观点从以病原体为中心的观点转变为对整个微生物群更为全面的观点[6，7］．肺研究的一个最有前途的领域是了解肺微生物群和呼吸上皮表面之间的相互作用，特别是在炎症性气道疾病。在几种与慢性气道炎症相关的肺部疾病中发现了微生物组的变化，包括COPD、哮喘和CF [8- - - - - -13.］．在CF，到6年的年龄，大多数儿童都经历过细菌感染H.流感，S.金黄色葡萄球菌， 要么铜绿假单胞菌［14.- - - - - -16.］．在CF的较年轻的儿童中，较低的气道微生物群与在健康受试者中观察到的人非常相似，并且是上航向上的亚流量的微生物群[8，17.］．在哮喘中，目前正在辩论细菌和病毒感染如何导致气道炎症的增加。此外，已经表明环境微生物暴露阻止疾病发作[9，10.，18.］．然而，也有证据表明，与健康受试者相比，哮喘患者的微生物菌群表现出生态失调的迹象，特别是变形菌群的增加莫拉克斯氏菌属sp.，拟杆菌门减少，特别是普氏菌spp。9，10.］．

对于儿童来说，很难从下呼吸道采集样本，因为他们不咳痰，而且通过支气管肺泡灌洗法采集下呼吸道样本具有相对的侵入性，这使得伦理上不允许这样做，除非在极端情况下。因此，在儿童研究中使用口咽样本作为肺微生物群的代理样本。在健康受试者和患有CF的幼儿中，该采样程序反映了下气道的微生物群;根据岛屿模型，咽喉微生物群甚至是微生物定植的来源[3.，5，8，17.］．因此，我们的研究假设是解读哮喘儿童和CF儿童的咽喉微生物群是否与健康儿童不同，以及两者之间是否存在差异。为了验证这一假设，我们比较了健康学龄儿童(6-12岁)与年龄匹配的哮喘和CF儿童的咽喉微生物群。

2.材料和方法

2.1。主题

本研究与来自健康学龄儿童和患有哮喘和CF的年龄匹配儿童的咽棉样品进行（表1）.有CF的儿童被审查并在海德堡的CF中心取样，由海德堡大学的伦理委员会批准，并从患者，父母或法定监护人获得知情人士同意。CF的诊断基于已建立的诊断标准[19.］．健康的对照和哮喘的儿童是横断面的加布里埃拉研究的一部分。Gabriela学习由参与大学的伦理委员会和区域数据保护当局批准。哮喘被定义为（i）父母报告的喘息于在过去的两个不同时间点，（ii）当一个积极的答案对这个问题的积极答案“你的孩子曾经使用过哮喘喷雾吗？”给予或（iii）当医生至少诊断哮喘至少一次或喘息的支气管炎，不止一次。由于没有所有这些指示来定义健康对照（即，没有医生的诊断，没有使用吸入器喷雾，并且在研究的两个时间点没有喘息）。

2.2。样品收集与储存

CF患者的气道标本在CF中心常规来访时通过口咽ESwab (BD ESwab Collection Kit, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)获得。样品在前24小时用PMA™染料(Biotium Inc.， Hayward, USA)处理，以去除死细菌中的DNA，如前所述[8，保存至−20°C提取DNA。进行了补充分析，以评估PMA处理对CF队列子集(有和没有PMA)的影响，没有观察到生物量和β和α多样性的显著差异(Suppl。数据1和2）.采用无菌干棉签(MASTASWAB MD 559, MAST diagnostics GmbH, Germany)采集哮喘儿童和对照儿童的咽拭子。取样后，拭子立即放回收集管中，并在−20°C下保存24小时。所有DNA提取均使用QIAamp Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)进行。蛋白酶溶液(7.2 mAU)和200 mAUμL的缓冲AL加入样品，然后进行15秒的涡旋。样品在56°C孵育10分钟，然后按照制造商的方案纯化。加入100洗脱DNAμL的缓冲剂AE在柱上，在室温下孵育1分钟，并以6000×g离心1分钟。通过在没有临床样品的情况下进行萃取来进行阴性对照。

２.３.微生物分析

利用V4区(515F和806R [20.])。为排除污染，采用大量对照(以模拟群落(HM-782D, BEI Resources, Manassas, USA)进行阳性对照，并对PCR和提取方法进行阴性对照)[8］．PCR和提取的阴性对照没有产生任何可量化的扩增子。将PCR产物连接到测序适配器上，并在Illumina miseq系统上测序配对末端（250个循环）。加工原始序列以消除低质量的读和嵌合体。序列被限制以获得每种样品的相同数量的读数，然后作为操作分类单位（OTU）聚集（使用差异的3％的阈值）。通过使用Mothur与Silva数据库的序列进行比较，在分类学水平上分类Otus [21.］．获得5,312,076个非嵌合高质量reads，并将每个样本下采样至7163个reads，以规范每个样本的采样工作(Good的覆盖率为99.1%(95.2-99.8))。通过对已知物种的模拟群落进行测序，我们可以计算出PCR和测序方法的总体错误率。错误率为1.56 × 10⁻⁵．此外，当我们期待20时，我们发现19个Otus的丰富度高于1％。那些Otus的分类学分配显示了20个预期物种的匹配身份。只有两个葡萄球菌物种间16S rRNA V4序列相同，聚在同一OTU内S.金黄色葡萄球菌和S. Epidermidis.．基于Morisita-Horn指数的不同模拟群落间的平均距离为0.032。

定量PCR（QPCR）用于评价16S拷贝的数量作为生物质的代理测量。使用UNIBAC引物进行QPCR（前进：5-tgg agc atg TGG TTT aat TCG a-3 ；反向：5-TGC GGG ACT TAA CCC AAC A-3)，如前所述[8］．

２.４.统计分析

具有所有OTU的OTU表（通过对每个样本的读数7163读数标准化）用于计算α多样性（非参数Shannon指数），丰富度（Chao1 Richness估计）和均匀度（基于香农指数的均匀度）的描述性指标。用成对的Wilcoxon Sum Rank测试测试α分集和临床参数的变化。通过主要坐标分析（PCOA）和基于Morisita-Horn相似性指数的主坐标分析（PCOA）和Persalova评估β的多样性变异[22.］．R²说明了解释变量对微生物群之间距离的强度的报道。采用线性回归分析连续变量与肺功能的相关性(R²表示相关强度)或分类变量的两两威氏秩和检验。

我们还使用一个基于负二项分布(DESeq)的模型进行了分析[23.]以检测各组(哮喘vs CF、哮喘vs健康、CF vs健康)之间丰富的otu差异。使用Bonferroni-Hochberg方法对多次试验进行了调整。所有统计分析均使用Mothur 1.37.4和R 3.3.0进行(主要包24.]来处理微生物组数据，Vegan [25.]和DESeq2 [23.]分析)。母亲、R的脚本和序列数据存储在figshare中(https://figshare.com/s/1e69261612f3dfcacf42）.

3.结果

3．1.肺功能下降和抗生素使用增加是CF队列的特点

CF患儿肺功能下降，FEV1z-1.78±1.37（哮喘为-0.43±0.79）值<0.001）和-0.44±1.08用于控制（值< 0.001))，为FVCz-得分为- 1.42±1.32(哮喘为0.12±0.93)(值<0.001）和-0.17±0.79用于控制（值< 0.001))，抗生素使用频率较高(CF与对照:优势比= 47.81 (值<0.001）和CF与哮喘：赔率比= 21.81（值<0.001）））（表1）.

３．２．口咽部微生物群的比较显示健康儿童与哮喘或CF儿童之间只有轻微的变化

采用Morisita-Horn相似性指数和PERMANOVA分析对整个微生物群落结构进行比较。虽然三组之间有显著差异(CF vs . control: （值< 0.01)，CF与哮喘: （值<0.01），对照与哮喘： （找到值<0.01））发现，低值R²（表明疾病地位对微生物结构之间的差异的影响，PCOA上的三个队列的主要重叠（图1(一))主张只对微生物组的结构进行微小的改变。每个队列中最常见的otu共有84个，证实了这种相似性(图)1 (b)）.仅有2个丰富的OTUs仅存在于CF患者;那些属于这个属假单胞菌和phyllobacterium.．属的一种OTU莫拉克斯氏菌属从CF组中缺席，以及属于属的一个eggregatibacter没有来自哮喘群体。三个队列之间的差异主要是由于调制最多优势属的丰度和较少的属于较少的属性而不是特定属的灭绝（图1 (c)）.与对照和哮喘相比，CF队列显示出四个优势属的趋势越来越大：普氏菌，奈瑟氏菌属，韦永氏球菌属,链球菌，而患有哮喘的儿童往往有更高的嗜血杆菌CF和对照组的丰度。

PCoA在两个轴上的分布依赖于喉内微生物群的以下主要成分的差异:OTUs属于以下属普氏菌，韦永氏球菌属，链球菌，格林酱，嗜血杆菌,fusobacterium.(图1 (d)）.与CF患者相比，哮喘患者的PCoA轴1值显著更高(值< 0.01)和健康人群(值< 0.05)，表明otu丰度较高(主要为格林酱和嗜血杆菌）用PCOA的这种轴和属于的OTU的较低丰度来关联普氏菌和韦永氏球菌属与轴1负相关。取样前4周内的性别和抗生素使用情况也显著影响整个人群(独立于队列)的微生物菌群结构，但影响较小R²(性别: （价值<0.01）和抗生素使用： （值< 0.01))。

单独分析队列时，CF队列仅受性别影响( （值= 0.02))，无抗生素使用效果。对于对照组和哮喘队列，没有观察到性别和抗生素使用的影响，但抗生素使用的低流行率不允许强有力的统计评价。

３．３．CF患儿的口咽微生物群Alpha多样性和生物量下降

哮喘儿童和正常儿童的喉部微生物群在alpha多样性上没有差异(值= 0.56)。然而，与哮喘儿童和对照组儿童相比，CF儿童的咽喉微生物群显示出全球alpha多样性的明显下降(值<0.001）（图2(一个)）.多样性的变化是由于存在的物种总数的差异(图)2 (b)），以及由于物种的丰富分布（图2 (c)）.CF患儿的菌群多样性较低，甚至有一种或少数菌群过度生长。这一观察结果与丰度的增加有关普氏菌和链球菌在CF组中。

在哮喘和对照儿童之间观察到细菌数量的差异。然而，患有CF的孩子患有喉咙较少的细菌（图2 (d)）.减少α-多样性也见于肺功能低下的儿童，即使只看到一个趋势(FEV1z得分: （值= 0.06)和FVCz得分: （value = 0.08))，可能反映了CF的影响。

取样前4周内抗生素的使用没有影响CF队列中的α多样性(值= 1）。此外，非生成的CF样品也显示出比来自哮喘患者的样本显着降低的α多样性（值< 0.001)或对照样品(值<0.001）表明即使没有抗生素治疗疾病状态的影响。然而，与对照和哮喘样品相比，未处理的CF样品没有显示出细菌载荷的显着降低的抗生素使用的生物量略有影响，但是处理的CF样品在生物质上显着降低。在处理和非缓解的CF样品之间没有观察到生物质的显着差异（Lock。数字3.）.

3．4．CF患儿、哮喘患儿与健康对照组口咽部微生物组组成的差异

在CF儿童和健康对照组之间，53个OTUs是有差异的(图)3.）.CF组除6个otu组成的小组外，其余均降低链球菌，Catonella，肠杆菌科，葡萄球菌,假单胞菌．有趣的是,葡萄球菌和假单胞菌是众所周知的CF病原体，OTUs属于假单胞菌与模拟群落中的人相同，表明物种是物种铜绿假单胞菌．对于CF和哮喘儿童的儿童比较，观察到相同的模式，除了属于两个OTU的CF中的20个差异丰富的OTU中的一般减少链球菌属。尽管热爱图中的丰度变化，但对于在CF中比对照中似乎更加丰富的其他OTU没有显着差异。这种缺乏统计学意义可能是由于较少的样本数量和CF队列中那些OTU的较高的接骨状变异性。

4.讨论

本研究的目的是分析与哮喘和CF等炎症气道疾病相关的喉部微生物症的差异是否与健康儿童相比。我们的结果表明，CF，哮喘和健康的儿童的微生物群显示出高水平的相似性与主要的强烈的核心微生物群普氏菌，链球菌，奈瑟氏菌属，韦永氏球菌属,嗜血杆菌．流行的喉咙里的细菌微生物群在健康证明之前,CF,和哮喘的孩子表示亲密的关系,但我们的研究是第一个比较三组相同的DNA提取方法,使用底漆,测序方法从而控制了潜在的技术偏差(8，9，17.］．没有那些偏见，我们能够证明CF组与哮喘和对照儿童相比，喉部中的多样性和总细菌载荷的降低表现出。多样性的减少是由于占优势属的丰富，特别是普氏菌和链球菌．优势度的增加影响了细菌群落的均匀性和整体丰富度，正如之前在CF和COPD中观察到的那样[8，13.］．生物量的减少也表明CF患者喉部的微生物群落较少。CF组喉咙内典型病原体也明显增多假单胞菌，葡萄球菌，以及非典型病原体phyllobacterium.［26.- - - - - -28.］．可以假设与哮喘和健康的儿童相比，CF儿童中的低生物量促进了额外的病原体中喉咙中的定植，因为它通过所代表的保护性共谋降低竞争压力和殖民化阻力普氏菌，奈瑟氏菌属，链球菌,韦永氏球菌属．CF患者在被典型病原体定植后，下气道中后一特异性属逐渐减少，这一事实支持了这一理论铜绿假单胞菌［8，29.］．在这里发现的核心喉部细菌和健康受试者的共生和保护作用仍未阐明;特别是，厌氧在较低航空公司中的特定作用仍存在争议[30.］．但是，证明了这一点普氏菌和其他Anaerobes表现出抗微生物活性和特定的菌株普氏菌有改变的脂多糖的免疫刺激活动较少[31.，32.］．我们的数据不能排除CFTR突变正在修饰肺部特异性CF病原体的核心和区域生长的假设，并且这些修改是在肺中建立病原体的驱动力。

健康儿童的喉部微生物群与哮喘儿童的喉部微生物群之间的强烈相似性已经在一个更大的队列中得到证实，而哮喘儿童与对照组儿童之间没有发现差异[9］．我们的数据与本研究的子样本和使用不同的分析(DESeq)证实了这些发现，表明哮喘在喉咙没有影响。然而，这些结果与其他小群体研究的结果相矛盾[33.，34.]，其中大幅增加嗜血杆菌和减少普氏菌见于哮喘儿童。经过更仔细的检查，我们的数据显示了类似的趋势，但总体而言，在被检查的年龄组中没有观察到严重或显著的生态失调。在我们的背景下，统计检验没有显示显著性。当应用于小型队列时，基于负二项分布(DESeq)的模型分析对假阳性的敏感性低于Metastat或广义线性模型分析。如Depner等人所示．，我们没有观察到哮喘儿童和对照组儿童的总细菌负荷的差异[9］．

三个群体之间的强重叠和共享核心微生物组是宿主对上气道微生物群调控的重要性。由于哮喘和CF的患者来自不同的环境和疾病状态并显示出高度相似的微生物群，这表明阳性选择以保护微生物群的结构。似乎对喉咙中微生物群的严重免疫调节允许只允许共生或至少非致病细菌的生长[35.］．然而，这种调节似乎在CF患者中略微不平衡，导致多样性和与含有典型CF病原体的机会增加的细菌的多样性和总量进行相关性（葡萄球菌或假单胞菌）.由于我们没有在哮喘中观察到变化，CF中观察到的失衡可能是由于与气道中CFTR功能障碍相关的宿主防御机制受损、肺部区域生长状况的变化和/或CF特异性抗生素方案[36.- - - - - -38.］．

我们的研究集中在口咽拭子上。然而，根据最近对健康、哮喘和CF儿童的研究结果，以及目前获取和建立气道微生物群的理论，咽喉微生物群将对下气道产生直接影响，从而影响定植概率[4，8，10.，17.］．因此，我们的研究结果可能表明，在三个队列之间发现的核心微生物群可能是共生体的来源，这些共生体将定植在下呼吸道。这些共生菌的定植是由宿主在迁移和消灭之间的复杂平衡中调节的[4］．在这种情况下，较低的保护性共生菌迁移可能会增加CF在肺中致病定植的机会[39.］．这与CF患者下气道多样性减少与进一步感染和更严重炎症反应的更高几率有关[16.，40］．然而，由于我们的研究没有分析下气道的样本，我们只能推测在三个队列中发现的核心微生物群以及CF特有的细微差异也发生在下气道。

我们研究的局限性是，尽管使用了常见的DNA提取方法，所使用的底漆选择和测序技术，但仍存在对CF队列和另外两个队列的方法仍有一些差异。一种方法论差异是使用不同拭子和PMA治疗，可能影响多样性和生物量。但是，我们通过比较10个样本，没有PMA，在我们的研究队列中，PMA没有显着影响生物量和多样性（Lock。数字1和2）.最后，两组队列采样方法使用了不同类型的拭子，这可能影响微生物群落的采样;因此，仍然需要考虑这种偏见。然而，微生物消毒剂研究中最重要的技术偏见是DNA提取方法，引物选择和测序技术，因此，在本研究中使用相同的引物和DNA提取和测序技术，我们废除了大部分主要偏见[41.- - - - - -43.］．此外，与CF和对照组相比，哮喘队列的样本量较小;因此，必须仔细解释这组人和其他两组人之间的差异。

综上所述，本研究首次采用可比方法对健康学龄儿童和哮喘、CF患儿的咽喉微生物菌群进行分析。我们的结果显示，三个患者组表现出高度的相似性，表明核心微生物群和宿主调节有利于共生菌的生长。然而，CF组显示与已知CF病原体存在相关的微生物菌群多样性和生物量下降，这与气道中CFTR功能障碍相关的宿主防御受损相一致。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突

作者的贡献

Alexander H. Dalpke，Erika Von Mutius和Marcus Mall同等地贡献为高级作者。

致谢

在进行这个项目的过程中，Antje Legatzki博士去世了。

补充材料

补充图1:PMA处理的DNA没有影响分析队列中CF微生物组的多样性和生物量。样本子集( 从CF队列中，分析了多样性和全球生物量的变化，无需PMA处理。没有观察到显着差异。补充图2：DNA的PMA处理不会影响分析的队列中CF微生物组的结构。样本子集( ）从CF队列中分析了微生物结构的变化，无需PMA处理。观察到微生物组结构没有显着差异。配对样本具有相同的颜色。线条表示假设多变量的95％置信区间t-分布(全线)或多元正态分布(虚线)。补充图3:取样前抗生素治疗对分析队列中微生物群落多样性和生物量的影响。根据取样前4周内抗生素使用情况将样本分为“治疗组”和“未治疗组”。采用两两Wilcoxon检验计算统计学意义。值< 0.001。（补充材料）

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