文摘

急性缺血再灌注损伤(IRI)的四肢会导致本地和系统性炎症变化可以影响肢体功能,可以危及生命。这项研究调查了t细胞的管理是否隔离剂,FTY720,后肢骨骼肌tourniquet-induced IRI在老鼠模型中会减弱系统性炎症和多器官损伤。Sprague-Dawley老鼠受到1小时通过橡皮筋的应用止血带缺血。动物被随机分配接受静脉丸车辆控制或FTY720条施后15分钟。大鼠( /时间点)安乐死在6日,24日和72年hr post-IRI。外周血以及肺、肝、肾、缺血性肌肉组织和团体之间进行了分析和比较。FTY720治疗显著降低外周血T细胞的数量( )导致系统性炎症反应和降低血清肌酐水平下降,温和但显著的影响在减少injury-associated目标基因的转录在多个器官。这些发现表明,早期干预和FTY720可能受益的治疗肢体的IRI。进一步的临床研究是必要的”来形容的短期和长期有利影响FTY720 tourniquet-induced IRI。

1。介绍

急性缺血再灌注损伤(IRI),骨骼肌损伤,和相关的辅助器官损伤后会出现肢体延长tourniquet-induced缺血后血管再生。此外,长期肢体止血带应用和随后的恢复血流可能导致inflammation-induced受伤的先天免疫细胞的招募,尤其是中性粒细胞和巨噬细胞,促炎细胞因子和趋化因子的分泌缺乏微生物(“无菌炎症”)在缺血性和受伤的组织(1,2]。溢出和放大炎症反应系统往往会导致一个复杂的细胞因子级联或风暴,使炎症反应在偏远的器官,临床可表现为多个器官功能障碍(例如,急性肾损伤和急性肺损伤甚至死亡(3- - - - - -5]。

损伤的机制和过程潜在的IRI是复杂的,涉及多个因素和许多细胞类型,并且可以随组织和器官的影响,以及组织缺血的时间。严重缺血组织的规则,再灌注引起的释放氧自由基和细胞因子刺激天生的免疫反应和随后的白细胞招募,内皮功能障碍和组织损伤3]。IRI的一个定义特征是招聘,贩卖,积累的先天免疫系统的细胞(中性粒细胞和单核细胞)发挥重要的早期作用在中介组织损伤和细胞组织再灌注期间破坏反应(6]。新兴的证据表明,发布有关分子模式(潮湿)分子或alarmins这些网站提示快速交易和招聘服务协调的T细胞局部炎症反应,支持细胞独立致病作用活化T细胞的IRI (2,7- - - - - -10]。因此,治疗方法旨在衰减IRI-induced t细胞招聘和t细胞介导的炎症反应可能降低风险的多个病理结果跟踪边缘IRI。

Tissue-infiltrating淋巴细胞,包括T细胞,以前被认为是不重要的IRI的发病机理。然而,多个模型使用T cell-deficient IRI的动物一直证明了T细胞的缺失降低IRI的严重程度,而野生型T细胞的转移到T cell-deficient动物增加IRI的严重性(回顾Linfert et al。) [11]。使用小鼠模型的肾IRI, CD4 / CD8^−−/小鼠减少肾损伤和改善肾功能(10]。有趣的是,CD4^−−/老鼠同样的保护,但CD8^−−/老鼠不(12]。此外,CD4细胞的转移⁺从干扰素- T细胞γ缺乏的老鼠没有恢复正常(更严重)CD4也没有损伤模式⁺从CD28-deficient小鼠T细胞。有趣的是,一个模型肠道IRI的支持作用的T细胞在网站招募中性粒细胞中MPO活性显著降低的伤害严重联合拥有[老鼠13]。总的来说,这些发现支持CD4的至关重要的作用⁺T细胞以及干扰素-γIRI的发病机制。

FTY720是合成模拟sphingosine-1-phosphate (S1P)和功能作为superagonist S1P受体,促进内化中断正常淋巴细胞的受体血液和淋巴组织之间的交易,导致瞬态/封存次级淋巴组织内淋巴细胞的积累。FTY720促进保留治疗外周淋巴结T细胞的增加整合蛋白的表达在高内皮血管,从而阻止他们贩运当地网站炎症(14]。FTY720通过模型证明了抗炎效应的感染(15),脓毒症(16),和肺IRI (17]。降低血清中细胞因子的生产也能降低血管通透性FTY720治疗后(16,17]。尽管多个动物实验证明FTY720提高生存能力和/或减少IRI的后遗症,FTY720对系统性炎症的影响以及是否改善或减轻组织损伤后肢体IRI尚不清楚(18- - - - - -20.]。鉴于炎症的重要角色在调停IRI的发病机理,我们的假设是,FTY720将减轻炎症反应的严重程度和器官损伤。因此,我们试图探讨管理是否FTY720 tourniquet-induced后肢体骨骼肌IRI在老鼠模型中会抑制全身炎症和/或减弱末梢器官损伤。

2。方法

2.1。动物

年轻的成年男性Sprague-Dawley无菌鼠(鼠形;300 - 350克)从泰康利购买农场(日耳曼敦,纽约)。所有的动物都被安置在塑料笼子里,保存在一个单独12小时光/暗周期无限制地食品(标准的)和淡水随意。他们适应了前至少一个星期的实验。研究协议(13-OUMD-01S)审查和批准的沃尔特里德陆军研究所/海军医学研究中心机构动物保健和使用委员会符合所有适用的联邦法规的保护动物的研究。

2.2。后肢缺血再灌注损伤模型

在实验之前,10动物被指定作为天真的控制。其余的动物被随机分为对照组车辆或FTY720-treatment集团和分配为安乐死6,24日或72年hr post-IRI ( 对于每一个生存时间点,共计60老鼠)。所有控制和FTY720-treated动物收到最初的腹腔内(i.p)注入tiletamine / zolazepam (Telazol)(40毫克/公斤)和随后的体重依赖型剂量腹腔注射tiletamine / zolazepam(10-40毫克/公斤),以达到和维持足够的麻醉。老鼠然后接受临时放置3 m®游手好闲的矫正橡皮筋(4.6毫米,沉重的力量;3 m Unitek公司蒙罗维亚,CA)在左后肢近1小时的大转子。条施在15分钟后,老鼠收到一个静脉丸(0.75毫升)的FTY720(0.3毫克/公斤;诺华制药集团,NJ)或车辆控制在D-PBS乙醇(50%)。

2.3。手术后的护理

乐队去除后,动物被允许恢复和监控,直到完全清醒,回廊,稳定。老鼠接受buprenorphine-sustained版本(1.2毫克/公斤,皮下,Zoopharm,拉勒米,王寅)postrecovery回到家里笼前,对缓解疼痛与全面获取食物和水。老鼠在24和72年人力资源部门监控postrecovery至少一天两次影响肢体水肿或痛苦的训练研究小组人员。

2.4。安乐死、血液采集和组织收割

动物进行安乐死与戊巴比妥0.5毫升i.p。通过心脏,其次是放血。临床实验室检测血液收集EDTA管(CBC微分,CHEM-7,丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸(ALT),肌酐,和白蛋白)和多色流仪分析T细胞的子集。肝、脾、肺、肾和脑缺血肢体肌肉收集进行进一步分析。

2.5。流式细胞术

流式细胞术分析是用来量化T细胞在循环和CD45的脾,αβ细胞、CD4和CD8表面标记表达式和FoxP3细胞内表达。大约三分之一的每个脾轻轻碎使用无菌注射器在染色缓冲区(PBS + 1% FCS + 0.01%南₃通过70)和过滤μM细胞尼龙过滤器(猎鹰,那里,MA)。分离脾细胞被清洗和resuspended染色缓冲区。细胞染色使用标准方法进行。简单地说,10⁶脾细胞或100μL(全血了10分钟的预处理FC-Block [100μ包含0.5 L染色缓冲区中μ克anti-rat CD32 (BD生物科学,圣何塞,CA)],以防止非特异性Fc受体介导抗体绑定。细胞首先沾饱和浓度anti-CD45-APC-Cy7 (BioLegend,圣地亚哥,CA), anti-CD4-V450 (BD生物科学),反αβ-PerCP (BD生物科学,圣何塞,CA)和anti-CD8-PE-Cy7 (eBioscience,圣地亚哥,CA) 30分钟在黑暗中在4°C。接下来,全血样品细胞溶解3分钟在室温下使用氯化铵裂解缓冲(ACK;Lonza Walkerville博士)。所有样品都洗了两次,在染色resuspended缓冲区。permeabilized,随后,所有样本固定和染色细胞anti-FoxP3-APC (eBioscience)进行清洗和固定在1%多聚甲醛后,细胞内染色设备制造商提供的(eBioscience)。样品采集和多色数据分析进行使用BD FACSAria™II细胞分选仪和BD FACSDiva™软件(Becton, Dickinson和公司,圣何塞,CA)。目标细胞群被确定使用前进和侧散射光检测控制是反映细胞的大小和粒度。

2.6。Multianalyte检测血清炎症介质

血清炎症介质(il - 1β、il - 6、il - 10、IL-12p70干扰素-γIL-17A地震-,g - csf, gm - csf MIP-1α,IP-10 MCP-1 MIP-2, TNFα和咆哮)测量使用Luminex multianalyte分析(鼠MILLIPLEX®地图工具;EMD密理博公司Billerica)根据设备制造商提供的说明。

2.7。肺水肿的组织病理分析和评估

组织样本缓冲福尔马林固定在10%,削减/处理,石蜡包埋,连续切片(5μ米),安装在玻璃幻灯片,然后用苏木精和伊红染色。彩色部分进行评估和分级兽医病理学家使用分级标准中描述表1- - - - - -3和图1。肺水肿是评估使用wet-to-dry比率,一个不固定的肺片段之前从每个动物体重和脱水。

2.8。免疫组织化学(包含IHC)肺MPO⁺白细胞

收获与neutral-buffered 10%福尔马林灌注肺膨胀,。肺组织进行组织病理学分析处理和切割如上所述。部分是de-paraffinized、固定、阻塞和immuno-stained最佳浓度的多克隆兔anti-rat髓过氧化物酶(MPO)抗体(Abcam、剑桥、MA)其次是一个最佳的生物素化的二次抗体的浓度,然后HRP-streptavidin共轭试剂。污点是可视化使用3 3-diaminobenzidine盐酸(DAB)作为发色体。部分与迈耶的苏木精复染色方案。数字brightfield显微镜的图像应用使用幻灯片幻灯片都被扫描和成像系统软件进行分析(Image-Pro +和7.0,媒体控制论,罗克维尔市,马里兰州)。数据被表示为MPO的平均数⁺白细胞从10个随机领域(200 x总放大)。

2.9。RNA隔离和基因表达

表示时间点,小样本的肺、肝、肾和缺血性肌肉组织收集并存储在RNALater(美国Ambion Inc .、奥斯汀、TX)在4°C。组织样本来自年龄的天真的大鼠( )作为控制的组织。总RNA分离和纯化使用RNeasy列和DNase-I工具包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的协议。总RNA定量光谱方法通过使用NanoDrop 1000 (ThermoFisher科学、沃尔瑟姆,MA)和RNA完整/质量是由微细管电泳使用安捷伦2100年评估生物分析仪(安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)进行使用1μ克的RNA合成的互补。86关键ischemia-reperfusion-related目标基因mRNA转录,考察了深入文献综述的基础上,实时PCR (QuantStudio 7 Flex实时PCR系统;应用生物系统公司)使用一个定制的低密度微阵列(RT²数组分析器PCR试剂盒)。基因表达是标准化的参考基因[3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)或肌动蛋白β(ACTB)],并计算相对的组织从noninjured老鼠收集使用2^−ΔΔCt方法。准备热图中补充图1,得到的基因表达数据第一次被转换为一个日志₂基本格式(更好的显示范围的数据)。图是准备使用Matlab R2016a(版本9.0)项目(MathWorks纳蒂克,MA)。

2.10。统计分析

连续控制和治疗组之间比较结果使用学生的双尾在每个时间点t以及,使用卡方测试分类结果比较,病理使用Mann-Whitney分数进行比较U测试。统计异常值检测使用格拉布的测试和删除是必要的。值≤0.05(双边)被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。FTY720对循环CD4治疗的影响⁺和CD8⁺后肢缺血再灌注损伤后T细胞

循环白细胞(WBC)(1.2倍和时间0)和中性粒细胞的绝对数量(5.3倍与时间0)达到24小时postinjury和72小时恢复到基线水平,而水平FTY720治疗组明显降低,如图2。淋巴细胞减少的绝对数量在两个治疗组nadirs 6小时和72小时的车辆控制和FTY720治疗组,分别。

流仪T淋巴细胞亚群分析演示了一个初始的减少外周血CD4的数量⁺αβ⁺和CD8⁺αβ⁺T细胞在车辆控制和FTY720治疗组在6 h后带位置。然而,FTY720老鼠有一个更深刻的减少αβ⁺T细胞在72 h仍低于基线值,如图3。具体来说,FTY720-treated老鼠相比,车辆控制老鼠CD4细胞明显减少⁺αβ⁺Foxp3⁻(6小时:117.9×10³细胞/毫升与598.4×10³细胞/毫升, ;24小时:14.6×10³细胞/毫升与797.9×10³细胞/毫升, ,72 h: 72.3×10³细胞/毫升与1256.7×10³细胞/毫升, ),CD4⁺αβ⁺Foxp3⁺(6小时:13.4×10³细胞/毫升与43.2×10³细胞/毫升, ;24小时:3.7×10³细胞/毫升与47.2×10³细胞/毫升, ,72 h: 23.0×10³细胞/毫升与112.5×10³细胞/毫升, ),而CD8⁺αβ⁺(6小时:83.2×10³细胞/毫升与344.2×10³细胞/毫升, ;24小时:15.7×10³细胞/毫升与325.2×10³细胞/毫升, ,72 h: 77.6×10³细胞/毫升与581.6×10³细胞/毫升, )在所有时间点检测淋巴细胞。相比之下,脾脏CD4之间没有显著差异存在⁺αβ⁺Foxp3⁻和CD8⁺αβ⁺T细胞控制与FTY720-treated组(数据子集3 (d)和3 (f))。

3.2。FTY720治疗影响系统性炎症和器官损伤

血清炎症介质的差异对HLI-injured老鼠处理车辆控制或FTY720如图4。的浓度il - 6、il - 10、IL-12p70 IL-17,地震,干扰素γ,MIP-1α、MIP-2和TNF -α在24小时对照组最高,而il - 1β达到72小时。这些炎症介质的浓度都显著降低,虽然高于基线值,在FTY720 IRI损伤后治疗组24 - 72小时。

之间没有区别观察肺水肿FTY720集团与车辆控制动物当比较wet-to-dry比率(平均比4.56和4.49, ;数据未显示)。同样,没有差别在肺部血管周围水肿的病理分级组在6小时(1.44和1.62, )、24小时(1.20和1.70, ),或72小时(1.69和1.71, ;数据未显示)时期。然而,我们测量一个瞬态MPO的显著增加⁺白细胞FTY720-treated动物的肺在24小时(图5)。

血清肌酐FTY720治疗组有更高的水平在6小时(0.71和0.50 mg / dL, ),但一个较低的水平在24小时(0.4和0.8 mg / dL, )和72小时(0.3和0.6 mg / dL, )(图6(一))。丙氨酸转氨酶(ALT)水平升高与基线相比在控制和治疗组,但没有显著差异在两组之间的这种酶水平在任何时间点(图6 (b))。

3.3。FTY720治疗减少了几个关键的组织损伤和细胞的表达有关信使rna基因转录

半定量的实时PCR进行mRNA隔绝缺血性肌肉,肝脏,肾脏和肺组织。褶皱的变化计算表达式和天真的组织使用ΔΔCt方法(21]。由此产生的值转换为Log 2值的范围(为了更好地代表数据)和代表热图补充图所示1模拟(S1模拟)。热量地图包括缺血性肌肉(S1A)的数据,肾(印地),肝脏(就是S1C)和肺(S1D)。数据,由基因功能,表明治疗结果在几个不同的表达模式,不同的组织类型和时间点后受伤。为了演示方差和突出统计学意义,选择基因的微分表达式如图7。noninjured组织相比,il - 6基因转录缺血性肌肉(图7(一))在两个治疗组升高,没有显著差异。HIF-1α同样基因转录增加缺血性肌肉从FTY720但是没有治疗效果相比,车辆控制(图7(b))。6人力资源、肝组织FTY720-treated老鼠显示减少垃圾量或压力诱导的基因的转录水平ATF3(图7(c))与车辆control-treated老鼠。然而,这一趋势在FTY720-treated扭转到72年人力资源与车辆control-treated老鼠。组件的AP-1转录因子在不同研究增加了治疗。值得注意的是,FTY720治疗增加了肝脏小君(图的表达7(d))在24小时和72小时也FosL1转录水平的增加(图7(e))在缺血性肌肉24 h。转录水平的LCN2被FTY720调节治疗肝脏(图7(f))和肺组织(图7(g)),但不是在缺血性肌肉(图7在24小时(h))。最后,HAS2的转录水平(图7(我)在早些时候提高缺血性肌肉(24小时)从FTY720-treated收集动物。

4所示。讨论

IRI的发病机制涉及多个因素引起免疫反应涉及特异表达支持和抗炎信号通路(11]。ischemic-injured肢体组织的再灌注时手术复苏止血带后去除导致缺血组织的炎症介质转移到外围国家促进发展的系统性炎症反应综合征(SIRS),肢体筋膜室综合征,多器官功能障碍综合征(MOD),和死亡4,22- - - - - -24]。在这里,我们表明,淋巴细胞的单个丸封存药品FTY720明显减少了循环T细胞的数量,减弱炎性细胞因子的生产,减轻了严重的肾损伤的老鼠受到tourniquet-induced肢体IRI。

淋巴细胞封存在这个模型中尤其是前显著减少血液中重要的促炎介质包括il - 1β、il - 10、il - 12、IL-17地震,TNF -α,MIP-1α,MIP-2在24 - 72小时。这些发现符合淋巴细胞在推动全身炎症的积极作用这个模型。正如所料,不同循环T淋巴细胞细胞群,包括CD4细胞⁺αβ⁺Foxp3⁻,CD4⁺αβ⁺Foxp3⁺,CD8⁺αβ⁺子集,被FTY720治疗显著降低。FTY720治疗没有,然而,导致明显的改变导航或出口的T细胞亚群的脾脏与其他报道结果一致14]。它同样表明S1P1受体受体激动剂减轻炎症反应在各种动物模型(25- - - - - -27]。然而,应该注意的是,这些研究调查炎症造成抗原适应性免疫反应,而不是天生的抗原特异性的免疫反应这里介绍。虽然机制的免疫抑制效应FTY720在这个模型中没有明确定义,淋巴细胞封存并与生产和减少系统性分泌多种炎症介质。不明显,从这些数据,如果T细胞的特定子集的封存或其他淋巴细胞人口淋巴器官是改善疾病的关键特性。

中性粒细胞在血液中越来越多地出现在24 h恰逢增加MPO的存在⁺中性粒细胞在肺FTY720治疗和伴随的T细胞外围的封存。的潜在作用机制FTY720在这个模型是近端是非激活淋巴细胞分离成二级淋巴器官和远离中性粒细胞已知介质IRI的发病机理。与淋巴细胞,FTY720绑定中性粒细胞SIP受体损害归航淋巴结炎症而不影响迁移到网站(28]。这种分离的细胞类型意味着嗜中性粒细胞的作用/ T细胞相声IRI归纳。先前的研究同样显示通过在体外实验,中性粒细胞cocultured刺激T细胞的存在增加的百分比IL-17和干扰素-γ第T细胞,而CD4的存在⁺T细胞也激活中性粒细胞(28,29日]。此外,减少MIP-1趋化蛋白的表达αMIP-2参与招聘和中性粒细胞的激活可能推断出炎症白细胞减少交易网站的器官损伤的下游再灌注结束。创伤和出血性休克的研究,事实上,显示肺保护作用的FTY720通过限制中性粒细胞启动和肺微血管功能障碍(30.]。虽然我们的研究没有证明有益FTY720对肺水肿和肺组织病理学的影响,渗透MPO增加⁺白细胞进入肺部似乎瞬态,解决72年人力资源。

肢体IRI可能导致直接肾侮辱通过rhabdomyolysis-induced近端小管的毒性,管阻塞、血管收缩以及间接侮辱通过肾脏免疫系统激活19,31日- - - - - -35]。虽然这些数据不允许投机是否减少肾损伤直接导致减少系统性炎症发生,这在24 h的合作表明潜在的联系。先前提出的解释FTY720-mediated肾保护还包括S1P1管信号、本地调制的树突细胞活动,增加了当地Treg细胞,改变TLR2和TLR4表达在肾缺血再灌注损伤研究[35,36]。

从多个组织的基因转录模式揭示了一些有趣的趋势FTY720对车辆控制受伤的老鼠。首先,促炎细胞因子il - 6基因的表达(图7(一))以及HIF-1缺氧反应基因α(图7(b))没有显著不同的损伤。这个观察与先前的研究一致FTY720模型中脓毒症的治疗降低了血清蛋白表达的il - 6水平,但不是mRNA转录水平(16]。另外,FTY720不可能减轻最初的侮辱,而是变弱的程度的系统性应对创伤后再灌注和符合FTY720的系统性(静脉)应用程序。第二个值得注意的趋势是在组件的基因的表达,或相关,AP-1转录因子复杂。这包括在小君的表达显著变化,ATF3, FosL。变量的增加表达的基因转录ATF3和小君在肺和肝脏由于发现治疗。AP-1,小君和安全系数的家人的二聚体蛋白质,可以提供抗ischemia-induced损伤(37]。它扮演着一个重要的角色在应对压力,包括低氧压力(38]。它控制炎性细胞因子的表达以及组件的凋亡信号通路39]。尽管这里给出的数据未指定一个角色AP-1-related基因与FTY720 IRI和治疗后,跨多个组织基因表达的图案变化突出一个潜在的作用,需要进一步调查。最后,也有个别人lipocalin-2变化(LCN2)基因表达的肌肉,肝脏和肺部。LCN2已知是一个复杂的角色在恢复从伤病和其他炎性事件(40,41]。一项研究报道,LCN2在巨噬细胞表达cytoprotective效果,防止器官损伤肾IRI的模型(40]。相反,其他研究已经表明,LCN2促进中性粒细胞趋化性和附着力,从而促进炎症(41]。因此,LCN2的来源可能是缺血性损伤的重要函数的响应。总的来说,基因表达数据表明FTY720治疗调节转录因子的表达(小君和ATF3)和蛋白质可能参与炎症反应(HAS2和LCN2)在系统性而不是地方。

作者愿意承认,这项研究并不是旨在衡量潜在的死亡率从FTY720输液中获益。此外,临床上FTY720给每天口服剂量单剂静脉输液。因此,长期的抗炎效应,FTY720所带来的好处可能是有限的在我们的研究中,虽然FTY720建议抗炎效应,短期影响和长期影响,需要进一步调查的结束这治疗肢体和多个器官功能恢复后tourniquet-induced IRI。

5。结论

我们的研究结果表明,治疗FTY720导致减少循环T细胞和随后的衰减的系统性炎症反应。此外,我们的数据表明,FTY720限制的程度可能通过抗炎效应器官损伤后IRI。未来的调查应该关注的领域的角色不同的T细胞亚群和多方面的评估方法众多代理相结合的不同机制的行动来减弱炎症,减轻器官损伤,并最终改善临床结果IRI。

伦理批准

每个作者证明他或她的机构批准的动物协议进行了这次调查,所有调查符合道德原则的研究。

信息披露

一些作者是美国政府的雇员。这项工作是准备作为自己的职责的一部分。标题17事项§105提供了“版权保护在这个标题不是美国政府的任何工作。“标题17事项§101定义了一个美国政府工作作为工作由一个军事服务成员或雇员的美国政府的一部分人的公务。意见或断言包含在本文作者的私人观点,并不被视为反映意见,政策,或位置的海军、国防部的健康科学统一服务大学,或任何其他美国政府机构。这项工作进行的海军医学研究中心,银泉,医学博士,美国。作者还想承认,这里给出的工作曾在2014年圣贤大会提供的合著者乔纳森·j·塞克斯顿。

的利益冲突

这个手稿的作者没有利益冲突的披露。

确认

作者要感谢MAJ康妮史密斯和MAJ玛格丽特·汉森的援助组织病理学和道格斯穆特先生流式细胞术支持。这项工作是支持和资助的单位数量屁股设计马力603115 hp.3730.001.a1268。

补充材料

补充图S1:微分表达式从组织热图FTY720-treated tourniquet-induced后与车辆控制治疗大鼠后肢缺血。组织在6、24和72年人力资源点后IRI是存储在RNALater信使rna,然后处理它们。互补转换1后面μg RNA是由rt - PCR半定量实时PCR基因表达分析使用2^−ΔΔCT方法。数据转置到一个日志₂基本格式更好的显示表达观察的范围。一个定制的低密度阵列面板与缺血再灌注损伤有关的基因被选为分析。对于每个组织,基因表达是量化相对幼稚的组织控制。补充图S1-A:缺血性肌肉基因表达,补充图S1-B:肾脏基因表达,补充图S1-C:肝脏基因表达,补充图S1-D:肺癌基因表达。(补充材料)