文摘

Visfatin adipokine,从脂肪组织分泌,并参与多种生理过程。特别是visfatin与代谢疾病,如肥胖和2型糖尿病,与全身炎症直接相关。然而,visfatin的潜在影响下丘脑控制体内平衡的能量,这是参与小胶质炎症,尚未完全被调查。在这项研究中,我们发现治疗外源性重组visfatin蛋白质导致炎症反应的激活小胶质细胞线。另外,我们观察到中央政府visfatin导致小胶质细胞的激活下丘脑。最后,我们发现,通过激活visfatin减少食物摄入量和体重POMC神经元与小胶质细胞激活小鼠。这些发现表明,中部海拔visfatin水平可能与稳态摄食行为在回应有关代谢的变化,如增加肥胖后下丘脑的炎症过程。

1。介绍

发病来源于脂肪组织和参与多种生理和病理过程的哺乳动物系统。特别是,他们有助于全身能量体内平衡的维护1]。虽然进行了大量的研究来了解发病的角色在外围的控制代谢2),发病的功能在下丘脑的复杂性和脂肪组织轴调节全身的能量平衡是不明确的。

Visfatin内脏脂肪组织中高度表达,循环Visfatin水平与肥胖相关(3]。此外,visfatin也被称为烟酰胺phosphoribosyltransferase (NAMPT)直接参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生物合成(NAD) [4]。多个证据表明线visfatin水平升高与促炎反应观察在肥胖5]。然而,它还没有探索visfatin是否参与下丘脑炎性反应,引发稳态代谢反应,导致扰动的能量平衡。

越来越多的证据表明,下丘脑电路控制能量代谢调节炎症反应,这一过程中胶质细胞也参与(6,7]。因为小胶质细胞主要有助于大脑的调节功能的免疫系统,包括炎症过程(8),在这里,我们确定的影响visfatin在下丘脑小胶质细胞在炎症过程。我们发现治疗重组visfatin刺激小胶质细胞的炎症反应,intracerebroventricular (icv)管理visfatin引起下丘脑小胶质细胞的激活,导致小胶质细胞的数量增加。此外,我们还发现,中央政府visfatin导致厌食,体重的损失,至少在某种程度上,通过促进的活动proopiomelanocortin POMC神经元。

2。材料和方法

2.1。动物

成年男性7-week-old老鼠用于组织学和行为实验。转基因小鼠表达绿色荧光蛋白(GFP)的POMC神经元(POMC-GFP老鼠(遗传背景:C57BL / 6 X CBA),数量008322年,杰克逊实验室、巴尔港,我,美国)被用于免疫组织化学分析。小鼠随意访问标准的饮食和自来水在12 h黑暗/ 12 h灯下(从上午6点。下午6点)条件。所有动物保健和实验过程进行按照协议机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)仁川国立大学(许可数量:犬- 2016 - 001)。

2.2。Intracerebroventricular Visfatin (icv)管子和注射

小鼠麻醉的腹腔内注射(ip)三溴乙醇(250毫克/公斤,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),放置在一个立体定位器(美国Stoelting、木材Dale, IL)。套管(26日计)植入正确的侧脑室(0.1毫米横向坐标,0.03毫米后,和2.4毫米腹前囱),并确保与牙科水泥头骨。动物是保暖,直到他们从麻醉中苏醒过来,然后放置在单独的笼子里。手术后,7天的恢复期是允许在实验开始前。老鼠牺牲了90分钟后icv注入重组鼠标visfatin (2μg, Lugen Sci、Bucheon、韩国)准备的部分免疫组织化学(包含IHC)。食物摄入量和体重的变化测量每天visfatin政府后7天。评估是否需要小胶质细胞激活visfatin-induced厌食症和体重损失,小白鼠注射icv二甲胺四环素(10μg / 2μl /天,Sigma-Aldrich)或0.9%盐水连续3天每天一次。第四天,小白鼠注射icv用生理盐水或visfatin和测量他们的食物摄入量和体重变化注射后24小时。

2.3。免疫组织化学

小鼠麻醉和0.9%盐水灌注transcardially (wt /卷),紧随其后的是新鲜的4%多聚甲醛固定剂磷酸缓冲(铅、0.1、pH值7.4)。大脑收集和前后缀隔夜日冕部分(50μ米厚度)被使用vibratome (VT1000P;位于德国徕卡微系统公司)。部分用PB洗净,然后接受1% H₂O₂在PB(卷/期)20分钟消除内源性过氧化物酶活性。在PB多次洗涤后,部分是preincubated Triton x - 100 0.2% (Sigma-Aldrich)在室温下30分钟(RT)然后孵化主要抗体(抗体兔子Iba-1, 1: 1000稀释一夜之间在RT, Wako,大阪,日本;抗体兔子c-Fos, 1: 2000稀释一夜之间在RT,圣克鲁斯;抗体的羊α-MSH, 1: 10000稀释一夜之间在4°C,微孔)。与二次抗体进行免疫荧光(Alexa 594 -标记anti-rabbit萤石,1:1000稀释2 h RT,英杰公司生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国;647 -标记anti-sheep Alexa萤石,1:500稀释1 h RT,生活技术)。diaminobenzidine - (DAB)基于Iba-1包含IHC,部分广泛洗和孵化与生物素化的二次抗体兔子,ABC试剂(向量实验室,伯林盖姆、钙、美国),和民建联衬底(向量实验室)。

2.4。细胞培养和治疗

的鼠小胶质细胞BV2细胞系是维护在杜尔贝科修改鹰中(DMEM)与高葡萄糖(美国纽约Gibco BRL)含5%胎牛血清(/卷卷)(美国纽约Gibco BRL)和37°C湿润5%孵化有限公司₂。基因表达分析,细胞被播种1×10⁶细胞/在6-well盘子。2小时后细胞播种,细胞治疗visfatin 24 h。

2.5。测量细胞因子水平

细胞因子水平文化上层清液使用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定。进行了化验使用OptEIA鼠标MCP-1 DuoSet (BD生物科学Pharmingen、钙、美国),鼠标il - 1β,il - 6 DuoSet, TNF -α工具包(研发系统、明尼阿波利斯、MN)根据制造商的指示。

2.6。实时定量PCR(存在)

从培养细胞总RNA reverse-transcribed让cDNA马克西姆使用RT预混料箱(内含生物技术、首尔、韩国)。实时PCR扩增的互补脱氧核糖核酸进行SYBR预混料交货Taq工具包(豆类生物公司,福斯特,CA)使用7300实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。数据规范化的看家基因β肌动蛋白。引物序列见表使用1。

2.7。免疫印迹分析

在1×10 BV2细胞被镀⁶细胞/在6-well板块和孵化visfatin (100 ng / ml或500 ng / ml) 30分钟或24小时。PBS的细胞被冲洗,resuspended刮在裂解缓冲(10毫米Tris-HCl,氯化钠10毫米,0.1毫米EDTA,氟化钠50毫米,10毫米Na₄P₂O₇1毫米MgCl₂IGEPAL脱氧胆酸盐,0.5%,1%,和蛋白酶抑制剂的鸡尾酒),离心机。样品含有10 - 30μ克总蛋白多克隆抗体进行免疫印迹分析使用包括anti-phospho-ERK anti-ERK(细胞信号,丹弗斯、马、美国),anti-IκBα(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),anti-Cox-2(圣克鲁斯生物技术)和反β肌动蛋白(σ)。

2.8。统计分析

统计分析使用Prism 6.0软件(GraphPad)。所有数据都表示为±SEM和失明的方式进行了分析。没有使用随机化分配实验团体或收集数据,但老鼠被分配到具体的实验组没有偏见。一个未配对t以及进行分析实验两组之间的意义。意义是在 。

3所示。结果

3.1。Visfatin诱导小胶质细胞的炎症反应

虽然以前的研究报道,海拔在循环visfatin水平参与多种病理条件下引起的炎症反应(5),证据表明循环visfatin水平和下丘脑炎症之间的关系与肥胖的发展仍然有限。在这项研究中,我们试图确定visfatin作为促炎adipokine在小胶质细胞。我们第一次测试的炎症反应BV2管理重组visfatin后小胶质细胞系。在数据显示1(一)- - - - - -1 (d),我们观察到一个释放炎性细胞因子包括MCP-1升高,肿瘤坏死因子-α、il - 6和il - 1β与外生visfatin对治疗的反应,评估ELISA。此外,我们发现visfatin治疗导致增加基因的mRNA水平编码MCP-1等炎性细胞因子TNF -α、il - 6和il - 1β(数据1 (e)- - - - - -1 (h))。这些结果表明,visfatin提高小胶质细胞的炎症反应。

3.2。Visfatin提升水平的信号分子在小胶质细胞参与炎症过程

进一步确认是否visfatin触发炎症在小胶质细胞中,我们评估的水平胞质蛋白参与细胞炎症反应的信号级联。免疫印迹结果表明管理visfatin导致剂量依赖性增加磷酸化细胞外signal-related激酶(ERK)(图2(一个)),这是耦合在多种类型的细胞,炎症刺激和cyclooxygenase-2 (cox - 2)、病原反应酶的合成前列腺素E2,调节细胞的炎症反应(图2 (b))。此外,我们发现visfatin治疗导致我的减少κBα块,NF -的活性κ转录因子(图2 (c))。从这些数据,我们阐明visfatin的影响在小胶质细胞对细胞炎症的发展。

3.3。中央政府Visfatin触发小胶质激活下丘脑

验证visfatin对小胶质细胞的促炎效应由上述决定的在体外方法,我们另外评估小胶质细胞的激活下丘脑弓状核(ARC)等领域的丘脑腹内侧核(VMH)和dorsomedial下丘脑核(DMH)与Iba-1疣状后,小胶质细胞的分子标记。符合细胞的发现,我们发现icv visfatin管理导致小胶质细胞的数量的增加在弧,VMH、DMH(数字3(一个)和3 (b))和密度的增加Iba-1信号在DMH(图3 (c)),反映出小胶质激活。此外,我们注意到,中央政府visfatin导致海马CA1小胶质细胞数量的增加,表明小胶质细胞的激活在海拔visfatin水平并不局限在下丘脑区域(数据3 (b)和3 (c))。我们还发现,中央政府visfatin没有改变下丘脑的星形胶质细胞的数量(数据没有显示)。这些数据表明,中部海拔visfatin诱导小胶质细胞的炎症反应和预测之间的密切关系循环visfatin和短期波动调节食欲和能量消耗与下丘脑的炎症。

3.4。Visfatin-Induced小胶质激活导致厌食症和身体减肥通过激活小胶质细胞和POMC神经元轴

由于下丘脑食欲调节的控制(紧密相连6]因为visfatin也被确认为一种化学信使,反映了周边能量状态(2),我们评估摄食行为和体重的变化响应visfatin集中处理。如数据所示4(一)和4 (b),icv visfatin管理局导致减少食物摄入量和体重。确认是否需要小胶质细胞的激活visfatin-treated厌食症和减肥的老鼠,我们测试了食物摄入量和体重的变化响应icv管理visfatin二甲胺四环素预处理后,这是通常用于抑制小胶质细胞激活。我们发现visfatin-induced厌食症和身体减肥几乎是完全由二甲胺四环素治疗(数字获救4 (c)和4 (d))。支持这些行为的结果,我们证实二甲胺四环素在下丘脑小胶质细胞激活的抑制效应引起中央政府visfatin(图4 (e))。最近,我们报道,下丘脑小胶质细胞的激活与炎症导致POMC神经元的激活,伴随着海拔在肾上腺皮质的语气7]。根据这些证据,我们下一个测试visfatin的影响的活动proopiomelanocortin POMC神经元,它主要存在于下丘脑腹侧区和食欲控制至关重要。的icv政府visfatin高架的数量c-Fos-positive POMC细胞相比vehicle-treated组通过检测c-Fos蛋白质的存在,分子标记的神经元活动使用含有下丘脑的大脑部分区域从转基因小鼠行表达绿色荧光蛋白(GFP)特别是在POMC神经元(数字4 (f)和4 (g))。自α-MSH作为蛋白水解生成产品从乳沟POMC基因和目标室旁核(PVN)传出POMC神经元被认为引发饱足信号,我们进一步检查的模式α-MSH纤维在PVN icv注入visfatin结合二甲胺四环素。我们观察到visfatin-induced海拔α-MSH神经支配在PVN几乎完全被preadministration拯救二甲胺四环素(数字4 (h)- - - - - -4 (j))。

综上所述,我们的观察表明,visfatin-induced小胶质激活下丘脑的功能与稳态摄食行为的感应,至少部分通过POMC神经元的激活。

4所示。讨论

本研究的结果强调小说的功能visfatin调节下丘脑炎症与小胶质激活,建议改变visfatin水平影响的短期控制下丘脑神经元电路触发适当的自我平衡的摄食行为依照全身能量状态。

多个证据表明小胶质细胞的激活是直接参与大脑炎症与生理反应,以及病理条件(9- - - - - -11]。因为它已经被证实,下丘脑炎症密切相关的扰动能量体内平衡(12]和visfatin还参与炎症过程的各种周边器官(5),我们推测visfatin的积极作用下丘脑炎症的发展及其相关代谢控制。

在这项研究中,我们首先确定治疗外源性重组visfatin导致炎症的刺激小胶质细胞。此外,我们发现visfatin改变蛋白质的合成参与细胞的炎症过程。最近,我们报道,toll样受体2 (TLR2)的激活导致下丘脑小胶质细胞的形态变化,导致下丘脑小胶质的炎症过程和神经轴(7]。基于这些实验方法,我们评估了小胶质细胞激活,以应对visfatin治疗后观察小胶质细胞通过与Iba-1抗体免疫染色。有趣的是,我们观察到中央政府visfatin导致小胶质细胞数量的增加和积累Iba-1蛋白质,反映了一个活跃的炎症状态。

最近,已确定主内分泌因素导致下丘脑炎症与营养过剩条件下(6,13],这些调查表明,多个化学信使和营养来自周边器官积极影响下丘脑神经元电路保持全身能量体内平衡(14]。此外,目前认为慢性海拔这些因素与恶化密切相关的下丘脑神经回路调节能量平衡,这可能是代谢紊乱的主要原因(2,15]。例如,瘦素,一个adipokine来源于脂肪组织,充当传入下丘脑神经元的输入与负反馈系统,和长期暴露于营养过剩引起瘦素抵抗功能尽管高水平的循环瘦素(16,17]。作为adipokine visfatin也被认为是,我们推测,改变visfatin水平中枢神经系统的生理控制耦合能量稳态以及肥胖发病机制。有趣的是,最近的一项研究表明,小胶质细胞的激活与炎性刺激细胞事件触发自我平衡的摄食行为(18]。在这项研究中,我们还建议引发的小胶质细胞激活的生理贡献visfatin调节体内平衡的能量。为了澄清visfatin生理变化的相关性,我们评估了体重和食物摄入量的变化,经过中央政府的visfatin。我们发现icv注入visfatin导致减少食物摄入量和体重,这是符合先前的观察显示visfatin使食欲减退的影响(19]。

中央肾上腺皮质通路参与能量稳态的控制通过集成各种外围信号,包括营养和内分泌激素如瘦素,饥饿激素(20.]。破坏家庭的小肽,源自POMC前体(21]。因此,神经元表达Pomc基因在体内平衡摄食行为的控制是至关重要的。我们最近报道,下丘脑星形胶质细胞有助于维持能量平衡通过瞄准下丘脑神经元,如POMC和AgRP神经元,在正常生理条件下(22]。此外,我们发现TLR2-induced下丘脑小胶质细胞的激活目标POMC神经元,从而导致负面的能量平衡。事实上,我们报道,中央visfatin参与发展的负面能量平衡通过调节肾上腺皮质通路(19]。从这些证据,我们建议修订假设visfatin可以通过激活小胶质细胞产生变更的摄食行为和肾上腺皮质的连接。符合这些概念,我们观察到一个icv注入visfatin增强POMC神经元的活动和确定visfatin注入引起的厌食症和体重损失被合成的抗生素治疗有效的逆转,抑制小胶质细胞的激活,这表明visfatin有助于大脑控制能量平衡,至少在某种程度上,通过下丘脑小胶质细胞的炎症过程,影响POMC神经元的活动。

本研究也提出了一个开放的问题对于visfatin参与肥胖发病机制。因此,进一步的研究是需要询问是否visfatin-induced稳态摄食行为被废除肥胖诱导的高脂肪饮食的长期治疗。

总的来说,我们的研究表明下丘脑小胶质细胞可能是一个重要的参与者下丘脑电路负责维护全身能量代谢,visfatin的积极贡献者下丘脑的负面反馈循环和脂肪组织轴。

附加分

高光。(我)Visfatin导致炎症反应的激活的小胶质细胞。(2)中央政府visfatin导致下丘脑小胶质细胞的激活。(3)Visfatin减少食物摄入量和激活POMC神经元在老鼠身上。(iv)海拔在visfatin可能与自我平衡的摄食行为

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

泰国掩藏你和Il Seong Nam-Goong贡献同样co-first作者这项工作。

确认

这项工作是由韩国卫生技术研发项目的资助通过韩国健康产业发展研究所(KHIDI),由卫生部&福利,大韩民国(批准号HI17C1600), Kim Jae Geun支持由一个仁川国立大学(国际合作)研究基金会资助。