Platelet-Released生长因子调节细胞因子的分泌在Synoviocytes炎性关节疾病

文摘

类风湿性关节炎(RA)的病因和发病机理的各种细胞群之间复杂的相互作用,是由不同的信号通路。传统上,治疗主要集中在缓解疼痛,减少炎症和关节功能的恢复。然而,最近研究人员讨论了自体富含血小板血浆(PRP)的治疗效果。这项工作的主要目的是检查的影响platelet-released生长因子在炎症条件下人类synoviocytes (PRGF)。此外,它是检查,延长治疗血小板synoviocytes集中影响细胞因子的释放形式。为了这个目的,一个体外RA模型是由刺激细胞与肿瘤坏死因子-α。细胞因子的释放被ELISA测定。实时聚合酶链反应的细胞因子基因表达进行了分析。已经观察到的刺激浓度10 ng / ml TNF -α导致显著增加内源性分泌il - 6和TNF -和基因表达α。的抗炎效果PRGF可以通过显著降低TNF -被证实α和il - 1β。一个诱导炎症条件似乎导致PRGF抑制促炎细胞因子的释放。需要进一步的研究来理解synoviocytes PRGF的确切作用机制。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种常见的慢性炎症性疾病,影响关节,其次是肿胀和疼痛。这炎性疾病影响的影响表现在日常生活活动能力和功能能力(1]。

治疗RA的旨在减少炎症和疼痛,从而防止关节和组织损伤。非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)和生物物质,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)抑制剂是常用的治疗应用。

血小板浓缩液(PC)经常用作自体注射准备各种肌肉骨骼疾病的治疗(2- - - - - -4]。准备相当简单,可以在门诊进行。一般的临床应用电脑的理由是其内容的高浓度的自然再生蛋白质由thrombocytes。为了加强和减弱组织再生,电脑可以应用在本地(5,6]。

绝大多数的血小板浓缩处理的障碍,也就是说,跟腱炎,足底筋膜炎,和上髁炎,炎症病理生理学的共同点。在最近的研究中,使用PC关节炎讨论。尽管这些发现都要小心,因为他们提供证据,进一步的调查似乎承诺(5,7,8]。通等人的体外研究表明,PRP抑制核转录因子ĸβ(NFĸB),减少了β白介素1 (il - 1β)和肿瘤坏死因子-α治疗后表达synoviocytes与脂多糖(LPS) (5]。浓缩血小板的质量依赖于捐赠以及制备过程(9- - - - - -12]。一些研究表明,变异会导致不一致的结果(13]。我们声称的功效PRGF细胞类型和组织之间的不同。在先前的研究中,我们可以表明,低浓度的PRGF更有效诱导tenogenic标记tenocytes例如低血管组织。亦然,高浓度的PRGF更方便地对成骨细胞和骨组织为例对高血管组织。thrombocytes行动的基本模式和释放生长因子在synoviocytes迄今为止并没有得到充分的研究。因此,本研究的目的是进一步研究PRGF的影响,作为一个混合的各种细胞因子和生长因子没有白细胞和等离子的参与,synoviocytes。我们还针对调查如果添加PRGF可以调节内源性synoviocytes炎症介质的表达。我们假设plasma-free PRGF作为抗炎加法和防止TNF -α、il - 6和il - 1β表达式。为了进一步阐明血小板集中在关节炎的可能的行动,我们有PRGF的效果进行了调查在体外类风湿性关节炎模型使用TNF -α刺激K4IM细胞。

2。材料和方法

2.1。制备PRGF

PRGF从liquid-preserved产生血小板浓缩液(PC)通过血小板apheresis依照当前德国道德法律(EK116/10当地伦理委员会亚琛工业大学)。9×10的PC⁹每毫升不超过一天,包含少于5×10⁴白细胞。2毫升PC离心机在2000与柠檬酸缓冲10分钟,洗两次,然后在2000年再次离心10分钟去除纤维蛋白原和其他等离子体组件。总共1中的颗粒当时resuspended毫升培养基实现8-10-fold血小板的浓度。两个冻融循环用于血小板的激活。激活血小板在18000离心机1分钟去除细胞碎片。PRGF收集上层的。PRGF各浓度被添加到培养基中。

2.2。培养的人类Synoviocytes

稳定的人类synoviocyte线(从基督教kap K4IM,慷慨的礼物,查利特,柏林,德国)与SV40 T抗原不灭的是用于体外研究[14- - - - - -17]。单层细胞培养在杜尔贝科的磷酸盐(DMEM) (GIBCO®,热费希尔科学)含10%胎牛血清penicillin-streptomycin (FCS)和1%。细胞培养在37°C 95%的湿润的空气和5%的有限公司₂的气氛。亚文化,细胞分离有1%胰蛋白酶(GIBCO热费希尔科学)治疗。生命的细胞成像和相衬显微镜,日本基恩士bz - 9000使用显微镜(日本基恩士、日本)。

2.3。刺激细胞重组人类TNF -α

10⁵细胞/ ml被播种在6-well板,然后在培养基培养24小时。中被serum-starved中含有1% FCS所取代。不同浓度的重组体人肿瘤坏死因子-α培养基中添加了30分钟和1 h。

2.4。与PRGF治疗的细胞

10⁵细胞/毫升或10⁶细胞/ ml被播种到新鲜6-well盘子培养皿或10厘米,分别培养24 h synoviocyte中附加的细胞。然后,介质被serum-starved中含有1% FCS所取代。一半的板是用10 ng / ml TNF -刺激α30分钟。然后PRGF浓度为0%,5%,10%添加到媒体的细胞有或没有TNF -α6 h。

2.5。ELISA

synoviocytes ELISA分析,治疗后,这些细胞被洗两次磷酸盐(PBS)和另一个24小时孵化serum-starved中允许细胞因子的释放到上清液。上层整除(200μl)被用于ELISA。蛋白质的总量决定用BCA (bicinchoninic酸)工具包(皮尔斯化学)。使用相同的蛋白质浓度和细胞因子水平分析夹心ELISA(血管内皮生长因子(VEGF)、il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α:研发系统,明尼阿波利斯,美国、il - 10:美国PeproTech)。

2.6。实时rt - pcr

细胞治疗后,这些细胞被洗两次磷酸盐(PBS)和孵化为另一个6 h serum-starved媒介。RNA与NucleoSpin提取RNA XS(德国Macherey Nagel)根据制造商的协议。核糖核酸的浓度是由光度分析使用NanoDrop 1000系统(PEQLAB Biotechnologie GmbH)。实时pcr是一式三份处理使用ABI StepOnePlus™设备(应用生物系统公司)总量的15μ包含70 - 100 l ng的cDNA、gene-specific底漆,SYBR绿色试剂(应用生物系统公司)。肿瘤坏死因子-目标基因α(弗兰克-威廉姆斯5-GGTCTTTGCCTTTTATCCCTCC-3和房车5-AAGCTCCCCCTCTTTTTCAGG-3)(MWG、德国),il - 1β和il - 6(试剂盒,日耳曼敦,医学博士,美国)进行了分析。Beta-2-microglobulin (B2M) (FW 5-TGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT-3和房车5-TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT-3)担任内部控制。

2.7。CyQuant细胞增殖试验

10⁴细胞被播种到一个全新的96孔板和培养24小时为了把细胞。然后细胞治疗与不同浓度的PRGF 24 h。中被样本冷冻和储存在−70°C。细胞解冻后,200年μl CyQuant GR染料/细胞裂解缓冲是添加到每个按照制造商(美国热费希尔科学)。DNA含量测定用荧光标(M200无限,TECAN)在480 nm励磁和520海里排放相关标准的细胞的数量与使胰蛋白酶化细胞(计算)。

2.8。细胞Titer-Blue®细胞生存能力分析

评估最优最小浓度的FCS组装serum-starved媒体,一个细胞Titer-Blue细胞进行了可行性分析。10⁴细胞被播种到一个全新的96孔板与synoviocyte媒体和培育。24小时后,中包含各种浓度的FCS serum-starved媒体所取代。样本孵化24 h .媒体补充了60μl所有试剂(1:5稀释serum-staved媒体)。这些细胞被孵化2 h。荧光检测在560 nm使用荧光激发和590海里排放标(M200无限,TECAN)。FCS的最低浓度,这对细胞生存能力没有显著影响,被选为serum-starved媒体。

2.9。统计分析

分析PRGF synoviocyte生存能力和扩散的影响,6各种PRGF集中不同患者使用。试验是在重复运行每个值和均值用于统计分析和比较使用单向方差分析和非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验。结果表示为平均值±标准错误(SEM)。ELISA试验,6 - 9不同PRGF集中不同患者使用。

说明结果在图组使用双向方差分析分析,非参数、多比较。差异被视为重要的价值观 。创建的所有统计图表和分析GraphPad Prism 6.0(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。

3所示。结果

3.1。选择最优Serum-Starved媒介

为了避免细胞增殖实验期间,serum-starved媒体使用。确定一个适当的serum-starved介质,synoviocytes FCS培养浓度从零到百分之十。细胞生存能力是评估使用细胞Titer-Blue(施)细胞生存能力分析(图1)。1% FCS没有减少的细胞生存能力(35629±192.0控制38482±836.6)相比,没有毒性(相对于消极控制20178±1316)和被改编为serum-starved介质( , 和 )。

3.2。体外模型炎症

首先,我们进行了实验,以描述一个体外模型通过刺激与TNF K4IM——对类风湿性关节炎α(数据2(一个)- - - - - -2 (d))。K4IM使用不同浓度的TNF -α(2、5、10、20 ng / ml) 1小时30分钟。细胞治疗后,这些细胞被洗了,进一步培养另一个24小时serum-starved媒介释放细胞因子。使用10 ng / ml TNF -α,释放内源性肿瘤坏死因子-α为136.3±24.5 pg / ml和217.6±43.7 pg / ml。30和60分钟后,il - 6的版本是180.0±15.8 pg / ml和722.8±147.2 pg / ml 30和60分钟后,分别 , 。当一个20 ng / ml的TNF -的浓度α应用,细胞形态急剧恶化后30分钟和60分钟后诱导细胞凋亡(图2 (e))。因此,20 ng / ml被认为是过量和不用于这项研究。ELISA的验证数据,实时rt - pcr进行。不同浓度的细胞治疗肿瘤坏死因子-α30分钟,水洗,并进一步孵化serum-starved中另一个6 h。ELISA结果证实了基因表达分析10 ng / ml TNF -α导致峰值相对TNF -α表达5.0±0.9,3.4±0.4的il - 6表达的增加6小时后,分别 , 。

3.3。PRGF Synoviocyte生存和增殖的影响

接下来,我们研究了PRGF K4IM细胞(数据的影响3(一个)和3 (b))。添加5%、10%、和20% PRGF积极影响细胞生存能力在所有细胞生存能力分析后24小时(29977±612.7、28926±617.0和31938±773.6 560_前女友/ 590_新兴市场、职责)与对照组相比没有PRGF (26188±900.9 560_前女友/ 590_新兴市场) , 。5%,10%,和20% PRGF诱导CyQuant K4IM细胞的增殖细胞增殖试验(5%:824.6±16.1细胞/厘米²10%:799.3±27.8细胞/厘米²,20%:805.1±41.5细胞/厘米²相对于控制:670.7±31.4), , 。

3.4。PRGF对肿瘤坏死因子的影响αSynoviocyte预处理细胞因子释放和细胞因子表达

3.4.1。释放内源性TNF -α从细胞后,肿瘤坏死因子-α刺激和PRGF治疗(图4(一))

治疗5或10%的PRGF内生TNF -显示没有影响α释放(灰色的列,375.0±40.48,315.8±42.46,分别比483.0±28.8; , 和 )。增加肿瘤坏死因子-α细胞培养基(+ TNF -α,剥夺了列)导致显著增加内源性TNF -α释放细胞(比较灰色和剥夺了列0% PRGF)。

添加10% PRGF TNF的媒体αK4IM预处理(+ TNF -α)导致显著减少内源性肿瘤坏死因子-α发布(489.6±47.6比877.9±128.6)未经处理的细胞的水平(图4(一),剥夺了列)。

3.4.2。释放il - 6的细胞后,肿瘤坏死因子-α刺激和PRGF治疗(图4 (b))

另外的5%和10% PRGF没有影响内源性il - 6在未经处理的细胞(灰色的列)。释放il - 6在+ TNF -减少αK4IM PRGF浓度的10%比2701年(1129±286.0±307.1)。PRGF没有影响il - 6在未经处理的细胞中释放, , (图4 (b))。

3.4.3。释放il - 1β从细胞后,肿瘤坏死因子-α刺激和PRGF治疗(图4 (c))

另外的5%和10% PRGF没有影响内源性il - 1β未经处理的细胞中释放(灰色的列)。内生释放il - 1β时减少5% PRGF添加到prestimulate K4IM(202.0±15.2比408.7±50.57)。10% PRGF没有对il - 1的影响β在未经处理或预处理细胞释放, , 。

3.4.4。释放il - 10的细胞后,肿瘤坏死因子-α刺激和PRGF治疗(图4 (d))

添加5% PRGF或预处理细胞与肿瘤坏死因子-α没有影响内源性il - 10在未经处理的细胞中释放(灰色的列,列,职责)。

添加10% PRGF K4IM导致显著的释放介质的抗炎细胞因子il - 10在未经处理的细胞(−TNF -α)和肿瘤坏死因子-α进行预处理(+ TNF -α)细胞(−TNF -α:271.2±38.7比205.7±15.7,+ TNF -α:407.5±42.5和408.7±50.6)相比, , (图4 (d))。

3.4.5。释放细胞的VEGF在肿瘤坏死因子-α刺激和PRGF治疗(图4 (e))

释放内源性VEGF也调查了使用ELISA。预处理的细胞与肿瘤坏死因子-α没有影响释放L-10 K4IM细胞。

添加PRGF对VEGF释放未经处理的细胞没有明显的影响,而增加PRGF导致TNF - 5%和10%α细胞预处理增加VEGF发布(664.2±37.13,647.6±42.3和529.0±14.4相比,职责), , (图4 (e))。

确认PRGF对炎症介质的影响,实时rt - pcr进行。

肿瘤坏死因子-的内源性基因表达α时减少5%和10% PRGF被添加到培养基(3.8±0.5,3.7±0.6和6.9±1.2相比,职责)。添加PRGF内生TNF -没有影响α基因表达, , (图5(一个))。添加10% PRGF增加了il - 6基因表达2.4±0.4倍的对照组, , (图5 (c))。对+ TNF -没有影响α集团如果PRGF添加5%或10% + TNF -媒体相比α集团没有PRGF(3.4±0.5, 3.9±0.6比2.9±0.4,分别地), , (图5 (b))。

il - 1β基因表达下调,当PRGF添加10%(3.1±0.2比4.9±0.4)。摘要意思之间没有显著的影响β+ TNF -基因表达α和−TNF -α集团10% PRGF添加时, , (图5 (c))。

4所示。讨论

滑膜炎是共同的特征反应如果其体内平衡是打扰18,19]。无论何种原因,内源释放肿瘤坏死因子-α和il - 6通常增加而il - 10和VEGF降低(20.,21]。

大多数研究集中在膝关节骨关节炎和报告的结果血小板及其衍生物集中在关节内注射膝关节(7,22,23)而另一些报告有利影响基底拇指关节的关节炎(24]。

肿瘤坏死因子-α作为一个电感的关节炎一直被认为扮演一个关键的角色在所有类型的关节炎使得我们的模型设置一个适当的实验室测试PRGF的可能影响。

在这项研究中,我们测试了PRGF体外的抗炎作用,研究生长因子释放的调制thrombocytes通过细胞因子释放的synoviocytes在体外关节炎模型。

PRGF PRP的衍生物,最大限度地降低了等离子体的内容,纤维蛋白、纤维蛋白原、细胞碎片作为交换媒介来使用补充在这个研究。这个传统PRP制剂有一定的优势。PRGF允许我们分析唯一的血小板的作用,无血清或血浆蛋白的细胞。之间有显著差异观察浓缩血小板生长因子和细胞因子水平相比,血浆和血清10,25]。我们能够在以前的工作,促炎细胞因子il - 6和TNF水平α在血小板显著小于集中在血浆和血清25),而一些生长因子如血小板源生长水平factor-BB (PDGF-BB)、转化生长因子(TGF -β),VEGF明显高于血浆和血清(10,25]。此外,通过使用PRGF,凝血和血清培养基成分引起的纤维蛋白形成在体外研究是预防。

最有可能的是大量的well-investigated PRGF组件和其他血小板浓度可以提高扩张,也就是说,许多细胞类型包括软骨细胞的生存能力和扩散,synoviocytes, tenocytes [6,9,26]。因此,这些结果符合从其他研究结果。

我们首先实现了体外模型类风湿性关节炎根据之前报道的结果。我们确认10 ng / ml TNF -α代表一个适当浓度诱导生产和TNF的表达α和il - 6典型的滑膜早期关节炎症反应(27- - - - - -30.]。

唯一的细胞因子的影响synoviocytes有点预期比较不同作者的研究结果发表在过去(16]。

当PRGF被添加到媒体TNF -α刺激synoviocytes,我们发现一个调制暗示抗炎细胞因子释放的影响。肿瘤坏死因子-α、il - 6和il - 1β水平明显下降相比,如果细胞培养而il - 10和VEGF释放增加。

PRGF包含一个高可变性的细胞因子和生长因子,如TGF -β和每个位置,抑制促炎细胞因子的表达在类风湿性关节炎(30.]。此外,PRGF包含少量的促炎细胞因子。这些介质的疗效为5% PRGF可以限制他们的特定的细胞表面受体的存在。PRGF浓度高达10%的增加提高了促炎细胞因子供应在媒体上,应该批判性的反映(25]。

VEGF释放的增加可以解释为暗示可能在类风湿关节炎治疗使用。VEGF是治疗风湿病的药物和的目标被接受为免疫原性关节炎[pathomechanism内的一个重要因素31日]。的调制PRGF因此可能被用来减弱在类风湿性关节炎滑膜炎与我们描述的其他影响。

肿瘤坏死因子-促炎的效果α、il - 6和il - 1β之前已经被许多作者描述,因此这一发现时可能看到的上下文中platelet-released因素和滑膜炎(20.,21]。我们的发现似乎特别感兴趣的如果关节炎和潜在的病理是很好理解的。

数据显示PRGF有抗关节炎药和免疫调节作用在体外和体内的类风湿性关节炎模型。

我们这里使用的模型作为一个简化模型首次炎症状态synoviocytes和有限的几个点。这个模型是建立在我们的实验室29日)和用于出版物在我们组和其他一些同事(32]。他们用K4IM细胞,这是一个稳定的人类synoviocyte细胞系获得健康的捐赠者。这些结果应该确认使用主细胞从风湿性关节炎患者获得或人类风湿性纤维母细胞如MH7A或HSE (33- - - - - -35]。此外,在类风湿性关节炎的复杂的过程,有一个广泛的细胞(t细胞,巨噬细胞、软骨细胞等),介质,受体,参与发病机理和途径,不被认为是在我们的模型中。

5。结论

总之,我们实现了一个基于单元的系统,允许调查的血小板浓缩(PRGF)是当前临床实践中实现的。我们将演示K4IM细胞的增殖效应细胞培养和显示的模式调制内源释放的重要的细胞因子,VEGF是指示性的整体抗炎作用。进一步的调查具体确定单因素的潜在机制在PRGF将有必要进一步了解骨关节炎的临床应用和疾病疾病背后的基本原理。

缩写

°C:	摄氏度
施:	细胞Titer-Blue细胞生存能力分析
DMEM:	杜尔贝科的磷酸盐
FCS:	胎牛血清
FGF:	纤维母细胞生长因子
旅客:	引力
h:	小时
H:	人类
IGF:	胰岛素样生长因子
IL:	白介素
有限合伙人:	脂多糖
分钟:	一分钟
MMP的:	基质金属蛋白酶
硕士:	间充质干细胞
NFĸB:	核因子ĸβ
非甾体抗炎药:	非甾体类抗炎药
办公自动化:	骨关节炎
PBS:	磷酸盐
PC:	血小板浓缩液
PDGF-BB:	血小板源生长factor-BB
PMC:	血小板中介集中
脉冲重复频率:	富含血小板纤维蛋白
PRGF:	Platelet-released生长因子
PRP:	富含血小板血浆
TGF -β:	转化生长因子β
肿瘤坏死因子:	肿瘤坏死因子
VEGF:	血管内皮生长因子。

的利益冲突

作者没有利益冲突的披露。

作者的贡献

托马斯Pufe Mersedeh Tohidnezhad安德烈拜耳,塞巴斯蒂安Lippross贡献同样这项工作。

确认

这项研究是由默克夏普和Dohme;通过跨学科的临床研究中心的资助(IZKF, T9-5, T11-3);人队,提高内OPBF071 RWTH亚琛大学医学院。

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