文摘
Midkine(可)是一种细胞因子,调节amphetamine-induced纹状体astrogliosis,暗示可能的可在安非他明引起的神经炎症中的作用。为了验证这个假设,我们研究astrogliosis和小胶质反应引起的安非他命(10毫克/公斤ip四次,每2小时)在不同的大脑区域可−−/小鼠和野生型小鼠(WT)。我们发现amphetamine-induced microgliosis和astrocytosis增强可−/−小鼠纹状体的区域的方式。令人惊讶的是,LPS-induced astrogliosis在纹状体被可−−老鼠。因为引起纹状体神经炎症相关的安非他明类兴奋剂这些药物引起的认知障碍,我们还测试了periadolescent安非他命治疗的长期效应(3毫克/公斤ip每日10天)记忆任务中可−−和WT老鼠。巨大的赤字在Y-maze测试只有在amphetamine-pretreated可−−老鼠。数据第一次证明,可根据炎症是一种新型调制器的神经炎症刺激和大脑区域。数据显示,可限制amphetamine-induced纹状体神经炎症。此外,我们的数据表明,periadolescent安非他命治疗小鼠导致学习和记忆过程的瞬态干扰缺乏内生可。
1。介绍
药物的滥用,酒精和安非他命等及其衍生物,诱发神经炎症(1]。小胶质细胞和星形胶质细胞等炎性细胞增殖2)是一个标志性的神经炎症和发病机制与不同的事件相关联的特征包括神经退化(3- - - - - -5]。证据表明在药物成瘾障碍神经炎症过程可能会导致神经退化在特定大脑区域的目标药物的滥用。因此,甲基苯丙胺引起纹状体神经炎症似乎是构成认知障碍,抑郁症和帕金森症在冰毒成瘾者(6]。此外,独立的研究已经证明了一个高度显著增加帕金森病(PD)的患病率在成瘾者(的安非他明类兴奋剂7,8]。因此,识别和表征的新遗传因素参与药物成瘾疾病和炎症相关验证的新生物标志物和开发新药物的神经炎症过程潜在成瘾障碍(9]。
Midkine(可)是一个重要的功能的细胞因子在外围炎症过程在不同病理条件下10,11]。可促进巨噬细胞和中性粒细胞的迁移12- - - - - -14),防止分化的调控t细胞通过抑制发展的耐受性树突状细胞(15,16]。在中枢神经系统(CNS),可在炎症的作用知之甚少。这已被证实细胞因子没有参与的发展astrogliosis或小胶质细胞的激活脊髓损伤模型(17]。然而,可发现高度调节在脑梗死等病理表现为炎症和神经退行性疾病18,19),在大脑不同区域政府的药物滥用(20.]。这一证据支持的假设可可以在神经炎症发挥重要作用。为了验证这个假设,我们已经证实amphetamine-induced纹状体astrogliosis是可增强敲除小鼠(可−−)(21第一次,我们已经测试了纹状体小胶质反应诱导可−−和安非他命的野生型小鼠(WT)。测试的可能性有针对性的监管astrogliosis可,我们还测试了海马的安非他命的影响,一个地区,吸引了越来越多的关注作为精神刺激剂行动回应大脑区域(22]。我们也调查了是否可调节胶质反应取决于炎症刺激通过比较脂多糖的影响(LPS)注入可−−和WT老鼠。此外,年初以来出现药物滥用导致成年各种不良结果包括认知障碍(23),与这些药物诱导的能力(纹状体神经炎症6),我们还测试了periadolescent安非他命治疗的长期效应记忆任务中可−−老鼠。
2。材料和方法
2.1。动物
/可−−老鼠请博士提供的托马斯·f·以利雅萨(斯克里普斯研究所的拉霍亚,CA)。可−−/老鼠产生如前所述[24];男性可8-10-week-old−−和WT在C57BL / 6 j小鼠免疫组织化学研究背景使用;还是男性可−−和WT老鼠用于periadolescent安非他命治疗前行为评估。
本研究中使用的动物保持按照到达的指导方针和欧盟(EU)实验动物保健规则(欧盟指令2010/63 /动物实验)和协议USP-CEU动物研究委员会批准。
2.2。组织学研究:神经胶质过多症
2.2.1。治疗
可−−和WT老鼠注射了4 (i.p)的安非他命(10毫克/公斤)或生理盐水(控制、10毫升/公斤),允许注射2小时之间的间隔。这方案管理安非他命以前用于观察不同的纹状体astrocytosis引起这种药物在WT和可−−老鼠21]。四天后的动物收到的第一个政府安非他命或生理盐水(控制),免疫组织化学研究小鼠安乐死如下所述。
与有限合伙人在这项研究中,可−−和WT老鼠收到一个ip注射LPS(σ,马德里,西班牙)(0.5毫克/公斤)或生理盐水(控制、10毫升/公斤),牺牲8 h后治疗。为了更好地分析可能的基因型差异我们使用低剂量的有限合伙人,被证明是有用的在老鼠身上测试神经炎症(25]。
2.2.2。免疫组织化学分析
同等或更高/组是用于所有的研究。老鼠transcardially灌注4%p-formaldehyde,大脑被移除和守恒的p-formaldehyde24 h和转移到30%的蔗糖溶液含有叠氮化钠0.02%存储在4°C。30µm纹状体和海马自由浮动部分处理如前所述[21,26,27]。在180年一片进行了免疫组织化学研究µ米(纹状体从前囱1.54毫米到0.10毫米;海马体的前囱−−2.54毫米1.06毫米)。
为了研究astrogliosis,一夜之间,部分被孵化在4°C anti-GFAP抗体(微孔,马德里,西班牙;1:1000),然后用适当的生物素化的30分钟二次抗体(向量实验室,伯林盖姆、钙、美国;在PBS室温1:5000);avidin-biotin反应是使用Vectastain精英执行ABC过氧化物酶工具包(向量实验室)后,协议由制造商建议;immunolabeling可视化通过使用3、3′-diaminobenzidine (DAB)。部分是安装在gelatin-coated幻灯片,风干一夜之间,通过分级乙醇脱水,二甲苯清理,安装与DPX媒介。研究纹状体microgliosis,一夜之间,部分被孵化在4°C anti-Iba1抗体(Wako,大阪,日本;1:1000),其次是30分钟的孵化和alexa -萤石- 488二级抗体(马表达载体,沃尔瑟姆,美国;1:500)。显微照片与数码相机捕获耦合光学显微镜(DM5500B、徕卡、德国索姆)。 Analysis was performed using ImageJ (NIH), in the three most central slices of each area. GFAP+ astrocytes were counted inµ米标准化领域在内侧纹状体如前所述21,26)和lacunosum moleculare (LMol)位于CA1区、海马。1100年Iba1 +细胞数µm×1400µ标准化的纹状体区域。
2.3。行为研究:Y-Maze
四个独立的实验进行到一个适当的每个实验组的受试者数Y-maze化验。治疗期间开始periadolescence(还是老鼠)。男性可−−和WT小鼠被随机分配和注射安非他命(3毫克/公斤,i.p。)溶解在盐水或生理盐水(10毫升/公斤,i.p。),每天一次连续10天。六天后上届政府的安非他命(或盐水),行为测试开始后以前公布的协议(28)并留下适当的“洗涤”时间不同Y-maze化验。
为了研究识别过程对新奇和工作记忆在老鼠身上,我们使用了Y-maze测试如前所述[29日]。记忆是测量60分钟intertrial间隔(来)收购和检索。在第一次试验(收购),动物放在迷宫的中心和允许访问5分钟两臂(“开始”和“其他”武器)的Y-maze三个手臂长34厘米,宽8厘米,高14.5厘米,第三个被屏蔽门。在第二次试验(检索,5分钟),门开了,动物可以自由访问所有三个武器(“开始”;“其他”;和“小说”武器)。在测试期间,条目到每个部门的数量(当鼠标的地方所有的四个爪子变成一只手臂)被记录。歧视的新奇与熟悉的分析计算,研究了偏爱“小说”的手臂的歧视比(小说/[小说+其他])的手臂条目的数量。分数超过0.5显示偏好“小说”的手臂表明建立空间记忆。
老鼠(WT:生理盐水,;安非他命,,可−−:生理盐水,;安非他命,)测试在6周的Y-maze时代最后的安非他命(6天后政府)和7和9周的年龄。所有的实验都是在光阶段进行。
2.4。统计分析
数据分析使用双向方差分析考虑基因型变异和治疗。相关的差异是由事后比较分析与Bonferroni事后测试。所有统计分析使用GraphPad棱镜6程序(美国圣地亚哥,CA)。
3所示。结果
3.1。Amphetamine-Induced纹状体的神经胶质过多症是可增强−−老鼠
为了确认之前报道增强astrocytosis安非他明引起的小鼠在可−−[21],striata GFAP-positive细胞的免疫组织化学分析可−−和WT老鼠了。saline-treated动物从基因型相比,安非他明引起的反应性星形胶质细胞的特点是大量人口染色较长的身体和广泛的过程(图1(一)黑色的箭头)。正如所料,有效地增加了安非他明GFAP +细胞的基因型(图1 (b))。GFAP +星形胶质细胞的数量的striata amphetamine-treated可−−/老鼠明显高于WT老鼠(图1 (b))。病患数据证实可调节amphetamine-induced纹状体的反应。
(一)
(b)
增强小胶质反应是一个标志的安非他命derivative-induced神经毒性(30.)和神经炎症的签名。为Iba1免疫组织化学显示Iba1 +细胞数量显著增加的striata WT老鼠安非他命治疗后4天(图2)。saline-treated老鼠相比,我们发现更明显增加Iba1-ir后安非他明政府可−−老鼠(图2)。数据首次展示,可调节小胶质安非他明引起的反应。
(一)
(b)
3.2。基因失活Midkine防止Amphetamine-Induced Astrogliosis海马
在WT的纹状体和可获得的数据/−−老鼠表明可调节神经胶质安非他明引起的反应。数据尤其强劲的病患反应这是高度可安非他命治疗后增加−−老鼠。测试的可能性可调节astrocytosis取决于大脑区域考虑,我们也评估了影响海马体的安非他命可−−和WT老鼠(图3(一个))。安非他明引起的不同的效果在WT(图和可−−老鼠3)。在纹状体病患反应相比,明显降低GFAP +星形胶质细胞在amphetamine-treated可−−/老鼠相比WT老鼠(图3 (b))被观察到。数据证明regional-specific监管amphetamine-induced astrocytosis可。
(一)
(b)
3.3。的基因失活Midkine不同调节LPS-Induced纹状体神经胶质过多症
可不仅仅是发现大脑中调节后政府不同药物的滥用。大脑的表达水平在不同的疾病,可增加份额存在作为常见的致病机制,包括缺血和神经退行性疾病(20.]。测试的可能性可调节神经胶质反应取决于所使用的炎症刺激,我们评估的影响有限合伙人可−−和WT老鼠。正如所料,低剂量的有限合伙人(0.5毫克/公斤)诱导一个温和~ GFAP +细胞的数量增加2倍WT小鼠纹状体,影响中,完全没有可−−老鼠(图4)。在小胶质细胞的情况下,有限合伙人诱导一个健壮的反应在两种基因型(图5)。然而,与相应的saline-paired对照组相比,Iba-1 +细胞的数量增加后的纹状体有限合伙人管理往往是相似的WT(图和可−−老鼠5 (b))。数据表明,可调节的病患,但不是小胶质,响应LPS诱导的纹状体。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.4。安非他命Y-Maze行为的影响
这里给出的数据首次展示的一个重要的角色,可调制的纹状体中的安非他明引起的神经炎症过程。这些流程已经与安非他命滥用人类引起的认知障碍(6]。因此,我们下一个测试的可能性内生可调节为期10天的安非他明引起的认知效果治疗青春期,一个阶段特别容易受到这些药物引起的认知障碍(23,31日]。最后6天之后安非他命(或盐水)管理,我们首次评估六个老鼠的行为从基因型在Y-maze(图6)。测试可能的长期影响的安非他命治疗青春期WT的行为表现和可−−小鼠记忆任务中,我们测试了一遍(7-week-old老鼠)和三周后一周(9-week-old老鼠)。首先,它发现控制(saline-treated) WT有效和可−−小鼠空间记忆建立在类似的方式(数字6(一)- - - - - -6 (c))。安非他命治疗青春期倾向于损害识别记忆在Y-maze 6可−−老鼠(图6(一))。这amphetamine-induced损伤的识别记忆而加剧7-week-old可−−/ WT老鼠相比(图6 (b))。然而,这种效应识别记忆的安非他命6 -和7-week-old MK−−老鼠被发现瞬态自废除9-week-old老鼠(图6 (c))。数据表明,periadolescent安非他命治疗引起的认知障碍是由内生可调制。
(一)六周大
(b)七周大
(c) 9周大
4所示。讨论
根据欧洲毒品和药物成瘾,监测中心在一生中使用安非他明的年轻人在欧洲存在着很大的差别,30 - 70%的水平。尽管广泛使用,的安非他明类兴奋剂滥用这些药物的医疗后果和机制都只是部分理解。(这些药物引起神经炎症1),致病机制导致黑amphetamine-induced多巴胺能损伤途径(32]。因此,在帕金森病的患病率显著增加非药物滥用者已报告(7,8]。在目前的工作,我们已经证实amphetamine-induced astrogliosis纹状体,非他的一个特点,药源性神经炎症会使基因失活的可21]。更重要的是,我们第一次证明amphetamine-induced纹状体小胶质反应也在增强可−−老鼠。数据表明可遗传因子,调节神经炎症效应引起的这种精神刺激剂。在这种背景下,同样重要的是要注意,可表达和信号在大脑中被激活后政府不同药物的滥用(33- - - - - -35]。在一起,我们的数据表明,前面所示的神经保护作用对药物引起的神经毒性(可20.,36)可能与它能够防止神经炎症。
的反作用的效果可与安非他命astrogliosis似乎有针对性,因为它是观察到纹状体,主要区域受到安非他命的神经毒性效应的影响,但不是在海马体。一个可能的解释这些差异可能与不同的表达模式在这两方面可受伤后。而增加的表达可发现在GFAP +星形胶质细胞在海马体受伤的老鼠37),可表达神经退行性黑通路中的主要发现在神经元(20.]。因此,它是合理的假设本构基因删除可可能导致反应损伤根据地区不同的效果。
Midkine大脑中的表达水平也在不同的病理表现为明显的神经炎症调节(3,10,20.,38]。已知Midkine起到神经保护作用在一些病理包括阿尔茨海默病(18和脑缺血39]。因此,它是合理的假设的能力可限制神经炎症可能导致其神经行为在不同的病理情况下。然而,我们的数据表明小胶质反应在有限合伙人管理不是由可显著调节。相比之下,LPS-induced纹状体astrogliosis被遗传失活的可演示astrocytosis微分调节的数据可根据炎症刺激。这里给出的数据提供了新的见解的机制和所扮演的角色可在中枢神经系统疾病astrogliosis扮演关键的角色。例如,可表达老年斑的阿尔茨海默氏症患者(40]。Astrocytosis促进一个β斑块沉积在阿尔茨海默病(41]提出有趣的可能性,可减少一个β斑块沉积(18通过它能够防止astrogliosis]。
的作用机制可支持我们的研究结果。可一个受体是受体蛋白酪氨酸磷酸酶β/ζ(RPTPβ/ζ)(也称为PTPRZ1) [42]。可结合RPTPβ/ζ其磷酸酶活性,使其失去活性。RPTP抑制磷酸酶的活性β/ζ可绑定调节RPTP的酪氨酸磷酸化水平的基板β/ζ这是已知的神经炎症过程,如监管机构TrkA [43]。信号通路的下游可/ RPTPβ/ζ这也被认为是参与神经胶质过多症包括MAPK通路(10]。还需要进一步的研究来测试这些信号通路可能参与调节的行为可在神经炎症。
总的来说,这里给出的数据是相关的,因为可促进炎症的角色已经详细描述周边器官如肾脏和肝脏(10),但却很少有人研究可在中央炎症中的作用。现在我们首次展示,可大脑是一种新型调制器amphetamine-induced神经炎症的地方。我们还表明,可调节不同astrogliosis根据有害刺激触发神经炎症过程。我们的数据支持的需要进一步研究,以分析的具体调节角色可在不同的大脑神经炎症病理可已被证明是调节。
除了参与神经毒性和神经退行性变的神经炎症明显导致行为的改变可能通过影响突触功能(44]。因此,新的实验治疗提供减少神经炎症和改善认知障碍之间的相关性在阿尔茨海默病(45]。有趣的是,行为变化在青春期与安非他命治疗认知障碍(31日]。我们的数据表明,periadolescent安非他命治疗适度后果WT老鼠在Y-maze测试但引起的瞬态干扰工作记忆在Y-maze可−−老鼠。的数据表明,基因失活可授予更大的漏洞与periadolescent安非他命治疗相关的瞬态认知障碍。它很容易连接这些行为数据与减少amphetamine-induced astrocytosis可−/−鼠标海马,相关区域识别记忆。然而,对于这种类型的药物,它最近表明,神经炎症过程冰毒在纹状体基础认知缺陷引起的这种药物的成瘾者6]。我们的数据支持认知障碍之间的相关性和增强amphetamine-induced在纹状体神经炎症可−−老鼠。
5。结论
数据首次展示,可是一种新型调节器存在炎症的刺激和大脑全区道的方式。本文提供的数据表明,可限制amphetamine-induced纹状体神经炎症。数据还表明,periadolescent安非他命治疗小鼠导致学习和记忆过程的瞬态干扰可−−老鼠,效果可能与缺乏可在纹状体神经炎症的反抗行动。
相互竞争的利益
作者没有任何利益冲突声明。
确认
这项工作已经被赠款支持saf2014 - 56671 r从Ministerio de隐藏y Competitividad大学的西班牙和USP-BS-APP03/2014 CEU圣巴勃罗和桑坦德银行。玛尔塔Vicente-Rodriguez和猩红热Fernandez-Calle支持从Fundacion大学联盟San Pablo CEU奖学金。