文摘

炎症反应是一个重要的主机在牛乳腺炎等细菌感染。内皮细胞是一个适当的关键炎症反应和血管屏障完整性损失有牵连的发病机理链球菌uberis全身的乳腺炎。先前的研究表明,亚油酸的积累(LA)氧化产品来源于15-lipoxygenase-1 (15-LOX-1)代谢可以调节血管功能。最初的LA导数15-LOX-1通路,13-hydroperoxyoctadecadienoic酸(HPODE),可以诱导内皮细胞死亡,而减少羟基产品,过程中能产生大量13-hydroxyoctadecadienoic酸(蚯蚓)、血管活化。然而,特定的相对贡献LA-derived代谢物在乳腺损伤内皮完整性是未知的。我们的假设是,美国uberis全身LA-derived 15-LOX-1氧化产品损害乳腺细胞凋亡内皮屏障的完整性。暴露(BMEC)的牛乳腺上皮细胞美国uberis没有增加15-LOX-1 LA新陈代谢。然而,美国uberis挑战的牛单核细胞表明单核细胞可能是13-HPODE和13-HODE在乳腺炎的重要来源。接触BMEC 13-HPODE,但不是13-HODE,显著降低内皮屏障的完整性和细胞凋亡增加。改变氧化剂状态由coexposure抗氧化剂13-HPODE 13-HPODE治疗期间避免副作用,包括细胞凋亡的改进。更好的理解的氧化剂状态血管微环境如何影响内皮屏障属性可能导致更有效的治疗美国uberis乳腺炎。

1。介绍

炎症会导致各种各样的人类和动物疾病,包括乳腺炎。牛乳房炎引起的链球菌uberis导致严重损坏乳用组织由于炎症失控。以前的临床和组织病理学的数据表明内皮屏障的破坏导致疾病病理。例如,美国uberis乳房内的挑战的研究报道显示亏损blood-milk障碍持续增加牛奶中的血浆蛋白(1]。同样,组织病理学分析表明,中性粒细胞在乳腺组织中积累了几天后美国uberis乳房内的挑战表明内皮的能力限制白细胞涌入整个blood-milk障碍(2,3]。皮下水肿后乳房内的美国uberis挑战还表示无法保护的选择性渗透血管障碍(4]。期间可能会导致内皮功能障碍的机制美国uberis乳腺炎是未定义的,但是一些脂肪acid-derived oxylipids被卷入造成发展不正常内皮反应(5,6]。

Oxylipids从酯化合成多不饱和脂肪酸(PUFA)从磷脂膜通过胞质磷脂酶裂解₂。裂解PUFA往往通过几种不同的酶氧化途径包括15-lipoxygenase (15-LOX) [7,8]。初始酶氧化产品可以进一步保持酶的代谢下游由多种酶包括水解酶和脱氢酶(9,10]。此外,初始氧化产品在oxylipid生物合成可能会减少取决于细胞的氧化还原状态的环境。例如,酶氧化亚油酸(LA) 15-LOX-1主要收益率13-hydroperoxyoctadecadienoic酸(13-HPODE)和可以减少13-hydroxyoctadecadienoic酸(13-HODE)通过抗氧化剂和减少代理,如谷胱甘肽(11]。脱氢抗炎的13-HODE 13-oxooctadecadienoic酸(13-oxoODE)可能发生的行动NADPH-dependent脂肪酸脱氢酶(9]。自氧化和代谢是一个连续的过程,13-HPODE生物合成需要后续代13-HODE和13-oxoODE。当前文献支持一个重要的角色对于一些LA-derived 15-LOX-1 oxylipids在一般的炎症反应(12- - - - - -14]。但是,以前的数据还建议13-HPODE生物合成诱导各种细胞类型和死亡与严重炎症的病理基础疾病(15,16]。

当前作者最近发表的一项研究提出,LA-derived oxylipids可能导致负责美国uberis发病机制(17]。作者特别强调的潜在贡献15-LOX-1氧化途径破坏内皮屏障(17]。各种研究表明,13-HODE诱导血管活化,可能扮演一个角色在炎症调节内皮屏障的完整性(6,18]。13-HPODE初始15-LOX-1 LA氧化产品,涉及导致内皮细胞凋亡,这可能是一个关键事件导致内皮功能障碍(19- - - - - -21]。然而,特定的能力拉妥协乳腺内皮屏障在氧化产品美国uberis乳腺炎是未知的。因此,当前研究假设美国uberis全身LA-derived 15-LOX-1氧化产品损害乳腺细胞凋亡内皮屏障的完整性。

2。材料和方法

2.1。试剂

高效液相色谱法(高效液相色谱)年级乙腈,HPLC-grade甲醇、甲酸、亚硒酸钠,胰岛素,肝素,转铁蛋白,乙二胺四乙酸(EDTA)、三苯基膦(TPP),亚硒酸钠,大豆脂肪氧合酶类型V和亚油酸买来Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。乙醚和丁基羟基甲苯(二叔丁基对甲酚)购买的记述有机物(公平的草坪,NJ)。YOPRO-1和propidium碘染色来自热费希尔科学(沃尔瑟姆,MA)。抗生素/抗真菌的trypsin-EDTA、谷氨酰胺和牛胶原蛋白是来自生命技术(CA)卡尔斯巴德。所有预先设计牛TaqMan®引物是从应用生物系统公司购买(CA)福斯特城。氘oxylipid标准,nondeuterated oxylipid标准和吲哚美辛从开曼群岛购买化学(安阿伯市MI)。硫酸镁是购自Avantor性能材料,Inc .(中央山谷,PA)和四硼酸钠费舍尔科学教育(拿撒勒,PA)。胎牛血清从Hyclone实验室购买,Inc .(犹他州洛根)。消息灵通的缓冲区,火腿F-12k, RPMI 1640人从康宁公司(纽约康宁)。

2.2。的制备链球菌uberis为在体外挑战

链球菌uberis是有血琼脂板上,使收集3纯集落形成单位(CFU)。3 CFU加入100毫升RPMI 1640中含5%胎牛血清的边后卫,300毫克/毫升谷酰胺,0.1μ亚硒酸钠。暂停在37°C动摇了13小时。BMEC挑战实验中,细菌悬液离心机在11000 g×30分钟在4°C。使离心后,上清液是通过一个过滤器过滤孔径为0.22μm .单核细胞挑战实验,所述上层清液过滤是利用细菌悬液也在65°C水浴heat-killed 45分钟。heat-killing功效是由多尝试整洁的细菌悬液在血琼脂板和孵化37°C到确认没有美国uberis增长。

2.3。主要牛细胞隔离和文化

2.3.1。隔离和文化(BMEC)的主要牛乳腺上皮细胞

乳腺supramammary动脉的内皮细胞收集健康荷斯坦奶牛基于前面描述的技术(22]。BMEC被净化有限的克隆技术,然后培养BMEC媒体包含火腿的F-12K中含有10%的边后卫,20毫米玫瑰,抗生素和抗真菌的(100 U /毫升组成的青霉素、链霉素、和两性霉素B),肝素(100μg / mL)、胰岛素(10μ转铁蛋白(5 g / mL)μg / mL)和亚硒酸钠(10 ng / mL)。细胞被重新从液态氮通过4和10通道。实验涉及接触美国uberis在2.5之前,细胞被播种的那一天10⁶细胞/ 100 mm细胞培养皿。的美国uberis上层清液稀释1:3 BMEC媒体的挑战。挑战时,所有媒体都从100 mm的菜肴,取而代之的是稀释吸气美国uberis上层清液。然后BMEC孵化了4人力资源和36小时37°C。脂多糖(LPS) 25 ng / mL添加4人力资源作为一个积极的控制。

2.3.2。隔离和文化主要牛单核细胞

外周血单核细胞(PBMC)收集健康荷斯坦奶牛先前描述的方法(23]。板主要单核细胞被分离PBMC的依从性方法RPMI 1640中含5%胎牛血清的边后卫,谷酰胺300毫克/毫升、抗生素和抗真菌的(100 U /毫升组成的青霉素、链霉素、和两性霉素B),和0.1μM亚硒酸钠(24]。PBMC和单核细胞收集和准备为每个复制新鲜。为美国uberis单核细胞的挑战,PBMC被播种在8的浓度10⁷细胞/ 100 mm细胞培养皿中大约10%细胞坚持3小时孵化后37°C和3随后洗涤。人口百分比的单核细胞粘附细胞的流式细胞术评估是基于以前的工作在我们的实验室25),在当前的研究中单核细胞大约是75%。洗后美国uberis上层清液或heat-killed美国uberis增加了4小时和36小时。heat-killed感染复数美国uberis挑战是平均54:1。的美国uberis为挑战上层清液稀释1:3。单核细胞培养4人力资源和36小时37°C。脂多糖在25 ng / mL添加4人力资源作为一个积极的控制。

2.4。主要BMEC和单核细胞信使rna量化

总mRNA孤立RNeasy迷你包(Venlo试剂盒,林堡)后,制造商的指示。完成了存在使用预先设计TaqMan小沟结合引物与家调查来自应用生物系统公司(表1)。反应混合物包括TaqMan基因表达主人混合,cDNA、和TaqMan基因表达测定混合包含感兴趣的基因的引物。样本运行一式三份β肌动蛋白,着重结合蛋白(真沸点),磷酸甘油酸酯激酶1 (PGK1)作为内生控制。目标基因评估BMEC炎性表型是cyclooxygenase-2 (cox - 2), 15-LOX-1,血管细胞粘附molecule-1,细胞间粘附molecule-1, interleukin-8(引发)。热循环条件BMEC如下:第一阶段,20年代95°C;第二阶段,3 s 95°C;第三阶段,60°C 30年代,与40复制阶段2和3。主要单核细胞cDNA需要放大,放大使用TaqMan前置放大器工具包(应用生物系统公司Inc .)。目标基因评估单核细胞炎性表型cox - 2, 15-LOX-1,诱导一氧化氮合酶(间接宾语),il - 10、il - 6。热循环单核细胞条件如下:第一阶段:50°C 2分钟,第二阶段:10分钟95°C,阶段3:15秒95°C,和第四阶段:1分钟60°C, 40复制的阶段3和4。基因表达是使用ΔCt计算方法统计分析和使用方法用于图形(26,27]。

2.5。Oxylipids提取和量化

Oxylipids从后上层清液中提取美国uberis挑战在单核细胞和BMEC基于先前技术描述(28]。短暂,上层的收集和抗氧化剂还原剂在4μL /毫升和内部标准的混合物含有0.01%甲酸是补充道。抗氧化剂和还原剂制备了以50%甲醇、25% EtOH,和25% HPLC-grade水含有0.54毫米0.9毫米EDTA二叔丁基对甲酚,TPP 3.2毫米,5.6毫米吲哚美辛。内部标准混合物包含以下氘oxylipids (0.1 ng /μL, 10 ng总):,,,,13 (S) -,6-keto9 (S) -,12 (S) -,15(年代)。解决方案是60% (v / v)甲醇促进蛋白质沉淀。样本离心机在4000 g×30分钟在4°C。上层清液吸气,稀释到5% (v / v)甲醇和保持冷之前通过列墨盒之前传递提取样品。的Phenomenex Strata-X 33 u聚合物反相列(500毫克/ 12毫升,Phenomenex托兰斯,CA)是用6毫升甲醇然后6毫升水条件。调节后,样品被贯穿的列,然后用40%甲醇洗净。列干完全然后oxylipids列的筛选了甲醇/乙腈(50:50,v / v)。样品在莎凡特干SVD121P SpeedVac(热科学、沃尔瑟姆,MA), resuspended在乙腈/水/甲酸(37:63:0.02;v / v / v),和离心机14000 g×30分钟。上层清液吸气和色谱瓶前液体色谱/质谱法转移到(质)量化。Oxylipids量化是根据先前描述的方法(17]。

2.6。制备13-HPODE

13-HPODE准备根据先前的报道与修改日本岛津公司LC-photo二极管阵列检测器系统(日本京都)[29日]。短暂,30毫升0.15米(pH值9)硼酸钠缓冲是混合着50毫克大豆脂肪氧合酶类型的LA - 300000 U v .暂停在冰搅拌1 h。氧化反应是停止通过降低pH值3与1 n盐酸。立即,60毫升高效液相色谱乙醚是添加和提取30毫升水清洗。分离和分配水后,提取在硫酸镁干燥去除剩余的水。提取物在2毫升resuspended HPLC-grade己烷:异丙醇(96.1:3.9 v / v), 200年注射μL整除到2504.6毫米Luna列(Phenomenex托兰斯,CA)在室温下。准备13-HPODE分数收集基于preinjected 13-HPODE标准。该方法使用了一个权力平等主义的流动相(己烷:异丙醇,96.1:3.9 v / v) 6毫升/分钟的流量。一个线性13-HPODE标准曲线(0.48 -300μ米)生成在反相LC水域Acquity UPLC本·C18 1.7μ米列(2.1100毫米)。流量为0.6毫升/分钟35°C和四极女士是在电喷雾-电离模式。电压与涡轮−3 kV离子喷雾源温度为450°C。流动相乙腈:甲醇:水:甲酸(47.4:15.8:26.8:0.01 v / v / v / v),并分析了10分钟的时间。13-HPODE的浓度在合成和收集到的部分被水使Z量化软件(水域,米尔福德,MA)根据潜油电泵标准曲线。

2.7。电动细胞基质阻抗传感分析:内皮屏障的完整性

评估内皮屏障的完整性,BMEC镀在牛collagen-coated井用金电极和融合发展。电流通过单层被电动的细胞基质连续测量阻抗传感系统(欧洲互通性系统委员会,应用生物物理学,Inc .,特洛伊,纽约)。约4 - 6小时治疗之前,媒体改为0%的边后卫火腿F12k媒体包含20毫米玫瑰、抗生素和抗真菌的(100 U /毫升组成的青霉素、链霉素、和两性霉素B),肝素(100μg / mL)、胰岛素(10μ转铁蛋白(5 g / mL)μg / mL)和亚硒酸钠(10 ng / mL)。电阻在单层监测治疗后24小时。阻力是归一化之前的时间点立即治疗。

2.8。测量细胞凋亡和坏死

细胞凋亡和坏死BMEC暴露于13-HPODE或H₂O₂测量用costaining YOPRO-1和碘化propidium商业工具(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。简而言之,BMEC一夜之间被播种在100 mm细胞培养皿中。媒体被改为0%的边后卫媒体包含20毫米玫瑰、抗生素和抗真菌的(100 U /毫升组成的青霉素、链霉素、和两性霉素B),肝素(100μg / mL)、胰岛素(10μ转铁蛋白(5 g / mL)μg / mL)和亚硒酸钠(10 ng / mL)大约4小时。治疗增加了6小时和24小时根据实验。荧光是由流式细胞仪根据制造商的协议。细胞凋亡或坏死被表示为褶皱的变化量,对媒体控制。细胞凋亡也衡量Apo-ONE®均匀Caspase-3/7工具包(Promega,麦迪逊,WI)根据制造商的协议在治疗后6小时。细胞凋亡或坏死被表示为褶皱的变化量,对媒体控制。

2.9。统计分析

BMEC mRNA的表达差异选择oxylipid生物合成的酶之间选择粘附分子和趋化细胞因子(有限合伙人和各自的时间点控制和治疗美国uberis上层清液)是由学生的决定t测试。差异之间的BMEC oxylipid生物合成控制和治疗在每个时间点都以同样的方式进行测试。同样,牛的单核细胞信使rna表达的差异选择oxylipid生物合成的酶,单核细胞活化的标志,各个时间点控制和有限合伙人之间的炎性细胞因子治疗是由学生的决定t测试。之间的差异控制,美国uberis上层清液,heat-killed美国uberis在时间点测定普通单向方差分析与图基事后修正。牛单核细胞暴露于不同oxylipid生物合成美国uberis上层清液和heat-killed美国uberis在相同的方式测试。确定治疗组之间的差异(例如,控制和13-HPODE)规范化抗内皮跨越时间,双向重复测量方差分析事后Bonferroni的多个测试进行比较。褶皱变化在细胞凋亡和坏死(流式细胞术和caspase-3/7活动)BMEC暴露后治疗(例如,13-HPODE)相对于0%的边后卫媒体控制由普通单向方差分析与图基的决定事后修正。几个剂量的防治效果与13-HPODE coexposure也测试了普通单向方差分析与图基事后修正。意义在所有的测试。

3所示。结果

3.1。美国uberis暴露诱导炎性标志物表达,但不是Oxylipid生物合成的酶的表达,在BMEC

Oxylipid生物合成的酶(cox - 2和15-LOX-1) mRNA表达没有明显增加4人力资源或36小时后接触美国uberis上层清液(图1(一)和1 (b))。相比之下,ICAM-1 mRNA表达,引发后显著增加4人力资源风险美国uberis后上层清液和VCAM-1 mRNA表达显著增加36接触人力资源(数据1 (c),1 (d),1 (e))。暴露在有限合伙人(积极控制)在所有基因测试显示出显著增加4人力资源(图1)。

3.2。BMEC 13-HODE 13-oxoODE生物合成并没有改变美国uberis曝光

暴露在美国uberis没有引起任何显著变化在13-HODE和13-oxoODE生物合成4和36小时后(数据吗2(一个)和2 (b))。13-oxoODE增加,但不是13-HODE, 4小时后重要的有限合伙人曝光(图2 (b))。

3.3。美国uberis暴露诱导的炎症标记物的表达,包括Oxylipid生物合成的酶表达,在牛单核细胞

cox - 2的mRNA表达显著调节相对于控制BMEC以下治疗和时间点:4小时美国uberis上层清液,4 hr heat-killed美国uberis,36小时heat-killed美国uberis(图3(一个))。15-LOX-1显著调节的mRNA表达以下治疗方法和时间点相对于控制BMEC: 4小时美国uberis上层清液和36 hr heat-killed美国uberis(图3 (b))。伊诺的mRNA表达显著调节相对4人力资源和36小时之后控制BMEC接触美国uberis上层清液和heat-killed美国uberis(图3 (c))。的mRNA表达il - 6显著调节由以下治疗和时间点相对于控制BMEC: 4小时美国uberis上层清液和36 hr heat-killed美国uberis(图3 (d))。il - 10的mRNA表达显著调节相对于4小时之后控制BMEC heat-killed敞口美国uberis(图3 (e))。暴露在有限合伙人在所有基因测试显示出显著增加4人力资源(图3)。

3.4。13-HODE,但不是13-oxoODE,生物合成牛Heat-Killed后单核细胞是调节美国uberis曝光

13-HODE增加,但不是13-oxoODE, 36小时heat-killed后显著美国uberis曝光(图4(一))。暴露在美国uberis上层清液4和36人力资源未能在13-HODE引起重大变化和13-oxoODE生物合成(数字4(一)和4 (b))。同样,牛单核细胞的接触有限合伙人4人力资源没有在13-HODE引起重大变化和13-oxoODE生物合成(数字4(一)和4 (b))。

3.5。乳腺内皮屏障完整性是在13-HPODE治疗有所下降

培养内皮屏障的完整性明显减少了150μM 13-HPODE曝光后2小时至12小时后暴露相比,媒体控制在相应的时间点(图5(一个))。6小时时间点和24小时时间点被用于后续的决心13-HPODE治疗后细胞凋亡和坏死。屏障完整性不变期间暴露于100年μM 13-HODE(图5 (b))。治疗内皮单层膜与25 ng / mL有限合伙人所有欧洲互通性系统委员会的积极控制实验。有限合伙人治疗持续降低屏障完整性在2小时后处理程序(图5 (c))。

3.6。细胞凋亡和坏死的BMEC 13-HPODE治疗期间增加

暴露BMEC到150μM 13-HPODE 6小时显著增加YOPRO-1染色表明控制权的增加细胞凋亡早期,而0.5μM和30μM 13-HPODE没有(图6(一))。同样,暴露BMEC到150μM 13-HPODE 6小时显著增加propidium碘染色表明控制权的增加主要晚期凋亡/坏死,但0.5μM和30μM 13-HPODE没有(图6 (b))。没有明显差异在24小时后细胞凋亡或坏死13-HPODE曝光(图6 (c)和6 (d))。暴露在2毫米H₂O₂为1小时(积极控制)表现出显著增加YOPRO-1和propidium碘染色(数字6(一)和6 (b))。暴露BMEC到150μM 13-HPODE 6小时显著增加caspase-3/7活动但0.5μM和30μ米没有(图7)。暴露在1毫米H₂O₂6小时(积极控制)表现出显著增加caspase-3/7活动(图7)。

3.7。防治作用改善13-HPODE-Induced BMEC的细胞凋亡和坏死

Coexposure BMEC 150μM 13-HPODE和3剂量的防治(0.1毫米,1毫米,10毫米)阻止13-HPODE-induced早期细胞凋亡,减少YOPRO-1染色(图控制权8(一个))。Coexposure BMEC 150μM 13-HPODE和2剂(1毫米和10毫米)的防治作用阻止13-HPODE-induced晚期凋亡/坏死早期证明了降低propidium碘染色(图控制权8 (b))。

3.8。防治救助13-HPODE-Induced损伤内皮的完整性

150年Coexposure BMEC单层的μM 13-HPODE 1毫米防治预防显著降低内皮屏障完整性而曝光的150μM 13-HPODE(图9)。

4所示。讨论

内皮细胞在炎症反应中发挥积极作用的细菌和细菌的产品。符合增加粘附分子表达美国uberis来华的乳腺组织,我们的数据表明增加ICAM-1和VCAM-1表达BMEC接触美国uberis上层清液(17]。观察增加粘附分子表达证实BMEC有能力应对美国uberis曝光。一种激活内皮细胞可能调解的炎症反应是通过酶生产oxylipids通过考克斯和液态氧酶通路(5,30.,31日]。与观察到的粘附分子的增加记录,然而,cox - 2的表达和15-LOX-1 mRNA在BMEC没有明显改变美国uberis接触(17]。先前的小鼠研究表明,cox - 2表达依赖于识别病原体相关分子模式由宿主病原体受体,如toll样受体(TLR) [32]。在的情况下美国uberis,最近的一项研究证明heat-killed和生活的能力美国uberis诱导TLR-2信号在乳腺上皮细胞33]。虽然我们的研究没有评估TLR活动,未能激活BMEC TLR-2通路可能导致未能引起显著的表达oxylipid生物合成的酶,特别是cox - 2和15-LOX-1。符合15-LOX-1 mRNA表达后没有变化美国uberis浮在表面的接触,BMEC没有显著增加LA-derived 15-LOX-1途径氧化产品。此外,诱导期间BMEC oxylipid概要文件美国uberis曝光不模仿先前描述美国uberis来华的乳腺组织概要文件(17]。最重要的是,生物合成的13-HODE BMEC并不增加美国uberis浮在表面的接触表明BMEC可能不是oxylipids来自洛杉矶的一个重要来源通过15-LOX-1通路在新陈代谢美国uberis乳腺炎。

证明内皮细胞可能不是13-HODE期间的一个重要来源美国uberis乳腺炎需要评估的其他潜在的细胞来源oxylipid生物合成在炎症反应。在小鼠研究中,巨噬细胞12/15-LOX的最高表达和代表的一个重要来源15-LOX-derived oxylipids [28,34]。常驻巨噬细胞也在提醒被侮辱的乳腺细胞周围存在(35]。因此,我们开发了一个主要的牛单核细胞美国uberis挑战模式,表明heat-killed美国uberis增加15-LOX-1表达式和13-HODE生物合成。目前的研究结果相反体内s uberis乳房内的挑战,没有展示在15-LOX-1 mRNA表达显著增加美国uberis来华的乳腺组织(17]。的集合美国uberis来华的组织可能发生后峰值15-LOX-1表达因为13-HODE生物合成增加美国uberis来华的乳腺组织支持15-LOX-1活动增加(17]。另外,巨噬细胞表达的相对贡献15-LOX-1相比,乳腺上皮细胞和浸润的中性粒细胞在受感染的组织是不知道3]。Heat-killed美国uberis暴露的牛单核细胞诱导显著增加13-HODE生物合成,可能表明,最优单核细胞15-LOX-1激活需要识别细菌的宿主病原体识别受体(33]。例如,美国uberis上层清液在当前的研究中未能诱导显著增加13-HODE牛单核细胞以及BMEC生物合成。尽管如此,我们的数据表明,牛的单核细胞代表一种更健壮的来源在heat-killed 13-HPODE和13-HODE美国uberis暴露乳房内皮细胞相比。更好的理解细胞来源的脂质介质内炎症病灶可能导致更多的靶向治疗某些炎症控制基于乳腺炎等疾病。

尽管LA-derived oxylipids从15-LOX-1新陈代谢期间被证明是显著增加美国uberis乳腺炎(17)的相对贡献个人oxylipids血管功能障碍还没有被查明。我们的研究结果首次证明13-HPODE的能力,而不是减少羟基(13-HODE),修改内皮单层的完整性。这些发现不符合先前的研究,证明了花生四烯酸acid-derived羟基(15-hydroxyicosatetraenoic酸,15-HETE)能够减少牛视网膜微血管内皮屏障的完整性(36]。除了不同的基质15-HETE 13-HODE派生,之间的差异的影响花生四烯酸acid-derived氢氧根和13-HODE屏障完整性可能是由于内皮细胞的来源。在这项研究中,BMEC从macrovasculature获得,而视网膜内皮细胞分离的微脉管系统(37]。因此,可能存在oxylipids脂肪酸的来源和内皮细胞的位置将决定的相对影响脂质代谢通过15-LOX-1通路血管屏障的完整性。

13-HODE相比,然而,我们表明,13-HPODE减少乳腺内皮屏障功能,但减少不是持续在治疗期的持续时间。这些观察表明内皮细胞的能力克服13-HPODE,任何损失的不利影响血管屏障功能可能是可逆的。然而,细菌感染的炎症反应期间,可能会有反复接触新合成13-HPODE可能不允许内皮屏障的恢复。虽然我们预期13-HPODE会降低屏障的完整性,确认13-HODE无法修改屏障完整性在我们的模型中是至关重要的。减少13-HPODE生成13-HODE和治疗13-HPODE最有可能有助于增加接触13-HODE。其他的研究已经显示微分13-HPODE和13-HODE对内皮细胞活化的影响,但目前的研究是第一个展示不同的影响内皮单层完整性(13]。支持了屏障的完整性,附加功能的研究将有助于评估13-HPODE可能有助于增强血管通透性大分子或不受控制的白细胞轮回。

内皮细胞的凋亡和坏死破坏连续,单细胞层编排一个有效的和自限性炎症反应所必需的。目前的研究表明诱导细胞凋亡和坏死BMEC结合减少乳腺内皮屏障的完整性。我们的研究结果与以前的工作相一致,证明13-HPODE-induced细胞凋亡在牛主动脉内皮细胞19- - - - - -21]。虽然不是评估在目前的研究中,以前的数据表明13-HPODE激活细胞凋亡的内在途径由于线粒体功能障碍(19,20.]。例如,暴露的牛主动脉内皮细胞13-HPODE增加的活动还存在内在途径3和9,与线粒体功能损失(20.]。13-HPODE可以诱导细胞凋亡的主要提议机制是通过细胞膜的脂质过氧化作用[38]。在细胞膜磷脂含有丰富的酯化PUFA和极其容易受到脂质氢过氧化物的攻击。传播发生脂质过氧化脂质氢过氧化物的分解生成脂质烷氧基的过渡金属(LO^∙(厕所)和脂质过氧化氢自由基^∙)[39]。脂质过氧化氢自由基可以充当prooxidants和攻击membrane-esterified PUFA生成额外的损失^∙,厕所^∙,LOOH 13-HPODE等。过氧化脂质膜由细胞外13-HPODE可能导致不可逆的增加线粒体渗透性和永久损失函数(39]。从而防止脂质过氧化物的积累和其他prooxidants可能保护或有利于限制13-HPODE的影响(40]。总体而言,当前的研究的数据表明,氧化剂在内皮微环境状态转移13-HPODE治疗与抗氧化剂可能会限制通过促进减少prooxidants萌生和扩展的脂质过氧化,从而防止细胞凋亡和屏障的完整性受损。

5。结论

严格监管,自限性的炎症反应是依赖于最佳内皮屏障内皮功能和维护。一些oxylipids可能减少内皮细胞的能力安排最优的炎症反应。因此,我们的研究定义的一个潜在来源和作用LA-derived 15-LOX-1代谢物。我们的数据表明,牛单核细胞,但不是BMEC,可能是一个重要的15-LOX-1来源拉在氧化产品美国uberis曝光。此外,接触BMEC 13-HPODE,但不是13-HODE,导致受损乳腺BMEC内皮屏障的完整性和细胞凋亡。我们还表明,氧化剂状态13-HPODE治疗期间可能导致细胞死亡和屏障的完整性。阐明氧化剂介导血管功能状态的机制可能为牛乳腺炎开发靶向治疗的关键。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者承认杰夫铁路工人的技术援助和詹妮弗Devries。这项工作是资助,在某种程度上,通过资助(2011-67015-30179和2011-67015-30179)的农业和食品研究倡议竞争性赠款项目的美国农业部国家粮食与农业研究所和玛蒂尔达·r·威尔逊的养老基金(底特律,MI)。