文摘

作为功能活性氨基酸之一,精氨酸是一种免疫的关键位置。然而,精氨酸的机制调节奶牛乳腺炎性反应在反刍动物还不清楚。因此,本研究探讨精氨酸对炎症反应的影响和酪蛋白表达后挑战牛乳腺上皮细胞(BMECs)和脂多糖(LPS)。细胞被分成四组,有或没有刺激有限合伙人(10μg / mL)和治疗有或没有精氨酸(100μg / mL) 12 h。促炎细胞因子的浓度,诱导一氧化氮合酶(间接宾语),哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)和toll样受体4 (TLR4)信号通路以及酪蛋白含量进行了测定。结果表明,精氨酸减少LPS-induced生产像il - 1β、il - 6、TNF -α,进气阀打开。尽管NF -的表达κB是减毒和mTOR信号通路的调节,精氨酸对TLR4表达没有影响。此外,我们的研究结果显示的内容β酪蛋白和总酪蛋白增强补充精氨酸后在LPS-induced BMECs。总之,精氨酸可以减轻LPS诱导的炎症反应和增强的浓度β酪蛋白和总酪蛋白在牛乳腺上皮细胞。

1。介绍

今天的集约化奶牛管理系统鼓励包容大量的谷物饮食的泌乳奶牛来支持高牛奶产量,提高成本效率。然而,过食高谷物饮食与亚急性瘤胃酸中毒(SARA),特点是快速和长期减少瘤胃pH值和释放的脂多糖(LPS)由于增加溶解革兰氏阴性细菌细胞在瘤胃1- - - - - -3]。瘤胃中的积累有限合伙人可以把到周围血液循环和入侵后的牛乳腺组织打破Milk-Blood障碍(4]。一旦有限合伙人进入乳房,促炎细胞因子il - 1等β、il - 6和TNF -α会过度生产。必然地,当地乳腺炎症事件通过LPS诱导/ TLR4信号通路(5- - - - - -7]。事实上,从乳腺上皮细胞正常乳汁分泌是中断,和酪蛋白表达也拒绝[8,9]。

人们普遍认为精氨酸作为功能性氨基酸(10]。除了蛋白质合成,精氨酸是先天和后天免疫的关键位置。它是唯一的基质生产一氧化氮(NO)和多胺的合成前体,脯氨酸,胍丁胺(11这是重要的免疫分子。精氨酸对其免疫功能调节的功能活动,免疫细胞的增殖和凋亡[12]。此外,证据表明,精氨酸促进免疫功能通过调节mTOR信号通路(13,14]。调查单胃的动物和家禽也表明,膳食补充精氨酸或静脉管理的积极影响在LPS引起的炎症和免疫反应。朱镕基等人声称,精氨酸补充保护和增强断奶猪的肠道粘膜免疫屏障功能和维护肠道的完整性大肠杆菌有限合伙人的挑战[15]。此外,棕褐色等人发现,饮食补充精氨酸1.42%减毒促炎细胞因子的过度的肉鸡(16]。然而,很少研究进行了奶牛。

牛乳腺上皮细胞的主要网站(BMECs)牛奶蛋白质合成和分泌。他们对细菌致病性的第一道防线(17]。我们之前的体外研究表明,精氨酸的合成增加酪蛋白BMECs通过激活哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)和Janus激酶信号传感器2和转录的活化剂5信号通路(18]。本研究的目的是探讨是否精氨酸可以减轻炎症反应,提高酪蛋白的表达在BMECs LPS引起的。

2。材料和方法

2.1。细胞隔离和文化

所有程序包括动物在我们的研究中被批准的江苏省扬州大学动物保健和使用委员会,中国(SCXK、协议# 2012 - 0004)。三个多产的奶牛(公斤,天哺乳期)是来自扬州大学实验农场。早晨后挤奶,组织样本被活组织检查(19]。样品放置在DMEM / F12(1: 1)中补充了antibiotic-antimycotic组合(Sigma-A5955)和冲洗几次与PBS包括100国际单位/毫升mycillin确保没有牛奶和血液中。组织然后切碎的1毫米³块,消化0.5% (w / v)胶原酶二世在38°C 3 h。上皮细胞被过滤后得到74μ过滤器和离心5分钟1811 g。这些细胞悬浮在5毫升生长培养基(DMEM / F12 10%的边后卫,100国际单位/毫升mycillin, 2.5μg / mL两性霉素B, 1μg / mL催乳素,1μ0.5 g / mL insulin-transferrin,µg / mL氢化可的松,10 ng / mL牛上皮生长因子),然后在38°C孵化有限公司5%₂在一个25-square-centimeter塑料培养瓶。每48小时增长媒体所取代。细胞被胰蛋白酶消化0.25%和0.1% EDTA-2Na不同时期(首先3分钟,然后5分钟)净化的主要上皮细胞细胞数量增加时,融合达到90%。纯乳腺上皮细胞的识别是根据我们之前作品中描述的方法(18]。所确定的乳腺上皮细胞被用于这项研究。

2.2。实验设计和治疗

第二代乳腺上皮细胞被播种在6-well文化板块的密度10⁶每孔基因表达分析和播种在10厘米细胞培养皿10⁷细胞每道菜蛋白质浓度分析。细胞培养在38°C公司为5%₂在湿润的孵化器。增长媒体改变了DMEM / F12培养基在细胞表面附着的船。通过16 h孵化,细胞被分成四组,介质被替换为不同的介质如下:(1)控制、DMEM / F12培养基;(2)精氨酸治疗,DMEM / F12培养基与100年补充μg / mL精氨酸;(3)有限合伙人治疗,DMEM / F12培养基补充10μg / mL有限合伙人大肠杆菌055:B5 (Sigma-Aldrich L2880数量);(4)有限合伙人与精氨酸治疗,DMEM / F12培养基补充与10μg / mL有限合伙人和100年μ克/毫升精氨酸。

2.3。RNA提取和基因mRNA表达分析

培养12小时后,总RNA提取与试剂盒(表达载体)试剂及其数量和完整性进行评估NanoDrop 1000分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德、美国)。RNA样本reverse-transcribed使用PrimeScript第一链cDNA合成装备(豆类代码:D6110A,豆类生物科技(大连)有限公司,有限公司,大连,中国)根据制造商的指示。执行实时PCR与Bio-Rad IQ5实时PCR (Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国),使用SYBR预混料交货Taq II工具包(豆类代码:DRR081A,豆类生物科技(大连)有限公司,有限公司,大连,中国)。协议中详细描述了在我们之前的工作18]。引物为目标和内部参考基因(β肌动蛋白)设计引物由上海Sangon 5.0和合成生物工程技术与服务有限公司有限公司(中国)。引物的信息显示在表中1。

2.4。蛋白质分离和总蛋白浓度测定

12 h与挑战中,孵化后总蛋白提取使用里帕裂解缓冲(Beyotime P0013B数量,Beyotime生物科技、上海、中国)由1:100稀释phenylmethylsulfonyl氟化物(σ)和鸡尾酒(σ,P8340)。总蛋白浓度的测定与BCA化验用品(Beyotime P0010数量)。

2.5。免疫印迹分析

蛋白质样品在100°C煮5分钟;30μ克每车道总蛋白质是解决通过sds - page,然后转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(Pall公司、港口华盛顿,纽约,美国;# 66543)通过使用湿转移TransBlot组装(Bio-Rad)。膜被封锁在Tris-buffered盐水(TBS-T;50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.6,150毫米氯化钠和1%渐变20)含有5% (w / v)牛血清白蛋白(BSA)在室温下2 h与温和的风潮。膜被孵化TBS-TV (TBS-T;50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4,150毫米氯化钠,1%渐变20,100毫米钒酸钠)与5% BSA包含抗体β肌动蛋白(Beyotime AA128数量),TLR4(罗福斯生物制品,号码nbp2 - 24538), NF -κB p65 (CST, # 4764), p-NF -κB p65 (CST, # 3033), PI3K p85 (CST, # 4292), p-PI3K p85 (CST, # 4228),一种蛋白激酶(CST, # 9272), p-AKT (Ser473) (CST, # 4060), mTOR (CST, # 2972),和p-mTOR (Ser2448) (CST, # 5536)一夜之间在4°C与温柔的风潮。孵化后主要抗体,膜清洗和孵化HRP-conjugated二级抗体(TBS-TV Beyotime A0208数量)在室温下1 h。螺栓是水洗,然后用超级发达ECL +试剂(P1010数量,应用技术有限公司,北京,中国)。的β肌动蛋白,管家基因,是作为积极的加载控制。捕获的图像使用FluorChem HD2(蛋白质简单,美国)。乐队的强度测量Image-ProPlus 6.0软件。

2.6。细胞因子测定

il - 1的浓度β、il - 6和TNF -α从细胞文化上层清液测定酶Immunometric测定(ELISA)试剂盒(从研发系统、# DY401 DY8190, MTA00;测定长度是15.6 -1000 pg / mL, 15.6 -1000 pg / mL, 10.9 -700 pg / mL)。详细检查步骤进行作为制造商的协议。每个好读的光学密度在450海里。

2.7。测量一氧化氮(NO)含量

细胞培养上清液(0.5毫升)分别聚集在1 h和12 h后细胞与挑战中孵化。没有在上层清液分泌的数量确定没有检测设备(Beyotime A0208数量)。简单地说,100年μL上层清液或标准的NaNO₂和100年μL格里斯试剂在96孔板在室温和孵化了15分钟。没有确定浓度标准曲线的基础上通过测量吸光度标在570海里。

2.8。酪蛋白含量测量

的内容α- - - - - -,β- - - - - -,κ酪蛋白是用ELISA试剂盒(从研发、明尼阿波利斯,美国,除以鑫公司,上海,中国,# CK-E94189B, CK-E94192B, CK-E94193B)。测定长度是20 - 320μg / mL, 25 - 400μ12.5克/毫升,-200μ克/毫升。详细检查步骤进行作为制造商的协议。每个好读的光学密度在450海里

2.9。统计分析

本研究的数据集都表示为三个独立实验的均值±SEM。单向方差分析(SPSS V16.0软件;SPSS Inc .,芝加哥,IL)进行统计分析。被认为是显著的差异。

3所示。结果

3.1。精氨酸减少LPS-Induced BMECs促炎细胞因子的生产

相对mRNA表达il - 1的水平β、il - 6和TNF -α说明在图1。与对比季度相比,有限合伙人的大大增加了il - 1的mRNA丰富β(高6.7倍;)、il - 6(高3.1倍;)和肿瘤坏死因子-α(高2.0倍;)。和添加精氨酸抑制mRNA水平的il - 1β(低2.4倍;)、il - 6(低1.7倍;)和肿瘤坏死因子-α(低1.4倍;)在细胞与LPS诱导,而有限合伙人。精氨酸对il - 1蛋白表达的影响β、il - 6和TNF -α在LPS-activated BMECs相似的基因表达(表2)。

3.2。精氨酸抑制LPS-Induced NF -κB p65表达TLR4表达但没有影响

如图2控制相比,一季度,地和NF -的水平κB p65 BMECs后基因表达明显增强与LPS刺激()。值得强调,在有限合伙人季度相比,补充精氨酸的LPS-induced BMECs显著下降()的NF -κNF - B p65表达水平κB p65磷酸化(图2 (b)),但它没有效果(TLR4表达(图)2(一个))。

3.3。精氨酸对伊诺的影响和没有LPS-Stimulated BMECs

伊诺mRNA丰富的结果,没有内容显示在图3。伊诺的mRNA水平有限合伙人与精氨酸治疗有效地控制季度高高卷()和精氨酸季()低于有限合伙人季度()。没有内容的有限合伙人夸脱与精氨酸治疗显著高于(有限合伙人控制季度)和精氨酸季度都在1 h和12 h。令我们吃惊的是,没有内容的有限合伙人与精氨酸治疗没有差别()与有限合伙人季度相比1 h,但明显低于()有限合伙人季度12 h。

3.4。精氨酸对PI3K / AKT的影响/ mTOR信号通路在LPS-Stimulated BMECs

PI3K的相对基因表达的结果,一种蛋白激酶,mTOR如图4。结果表明,大量的PI3K和有限合伙人季度mTOR基因表达明显降低(比控制季度),然而AKT的丰度没有明显不同()。与LPS季度相比,PI3K的mRNA水平,mTOR, AKT在季度处理有限合伙人和精氨酸都明显增强()。我们还发现,有限合伙人显著下降()p-mTOR / mTOR的水平,但是它没有影响水平p-PI3K / PI3K和p-AKT / AKT ()。有限合伙人季度相比,水平p-AKT / AKT和p-mTOR / mTOR有限合伙人和精氨酸明显增强治疗的细胞(),但p-PI3K / PI3K的水平没有影响()。

3.5。精氨酸增加了β酪蛋白和总酪蛋白合成LPS-Treated BMECs

酪蛋白浓度的结果如表所示3。结果表明,蛋白质的表达β酪蛋白和总酪蛋白有限合伙人季度显著降低(比在控制季度)α酪蛋白有一个轻微的改善()。的水平β酪蛋白和总酪蛋白合成的季度有限合伙人与精氨酸明显走高(有限合伙人)比一季度,然而α酪蛋白和κ酪蛋白合成无显著变化()。

4所示。讨论

反刍动物消化道港口的革兰氏阴性细菌能够产生的脂多糖(LPS),但上皮作为屏障,以防止它进入体循环。然而,在grain-induced莎拉呼吸道上皮屏障失败后,有限合伙人可以易位到身体的内部,例如,进入血液循环和淋巴系统。一旦发生易位,有限合伙人与细胞相互作用和刺激生产的促炎介质如细胞因子、乳腺和免疫反应可能会扩大。

BMECs是第一个提出细胞面对细菌病原体和作为一种重要的线保护乳腺的细菌入侵问题[17,20.]。证据表明,快速和强烈的炎症反应与LPS诱导BMECs挑战时(21]。在目前的研究中,挑战了BMECs 10μg / mL有限合伙人(22模仿炎症状态,瘤胃有限合伙人侵入BMECs受伤后Milk-Blood障碍。精氨酸是一种氨基酸semiessential动物。它不足时的生理压力如伤口,组织学损伤和炎症。据报道,补充精氨酸在病理的状态有助于加强免于疾病(23,24]。因此,试验后补充LPS-induced BMECs 100μg / mL精氨酸(25)进行调查精氨酸对炎症反应的影响。

众所周知,LPS-induced炎症活动的特点是诱发和释放大量的促炎细胞因子(如TNF -α,il - 1β和il - 6)在巨噬细胞和上皮细胞(26]。这些细胞因子有至关重要的作用在促进和调节免疫功能对细菌病原体的反应27]。和他们的表达,在一定程度上,反映了炎症反应的大小。在这个实验中,我们证实il - 1的浓度β、il - 6和TNF -α在12 h后显著增加BMECs与LPS刺激。与此同时,我们发现精氨酸抑制这些细胞因子的分泌。相似的结果被棕褐色等人报道和卡尔金斯et al。16,28]。此外,江泽民等人也发现,治疗100 - 300μg / mL精氨酸在少年鲤鱼肠完全防止增加il - 6和TNF -α和il - 1的显著减少β信使rna表达(25]。这一结果表明,精氨酸会导致衰减炎症反应。

为进一步了解精氨酸抑制促炎细胞因子表达的可能机制,我们研究了TLR4的表达水平和NF -κB,重要的上游信号分子调节LPS-induced炎症反应。细菌LPS受体TLR4,已被证明是负责配合CD14 LPS识别;这导致我的退化κNF - B和解放κ88 B通过骨髓分化因子(MyD88), IL-1R-associated激酶(伊拉克共和国)和TNFR-associated因子6 (TRAF6)。然后NF -κB是易位到细胞核和诱导促炎基因的转录激活后磷酸化(29日- - - - - -31日]。从而抑制NF -κB激活已被视为一个关键目标和有效的方法抑制炎症反应32,33]。我们的研究表明,与LPS刺激增强NF -的表达κB p65和NF -的磷酸化κB p65。这促使NF -κB p65活跃和提高促炎的表达式。这些结果与先前的金等人的研究和整合时et al。4,34]。然而,NF -的高程κB p65表达式完全逆转后补充精氨酸。这可能意味着精氨酸减少促炎的表达通过抑制NF -的激活κB。

精氨酸是唯一前体的生产没有通过的三个合成酶(诺斯)。在正常生理条件下,低浓度的产生以挪士(内皮NOS)和nNOS(神经元NOS)亚型。但是,在病理条件下(病毒和细菌感染),高层没有被伊诺合成促进免疫细胞的增殖和抵御病原菌。尽管没有浓度高的早期炎症促进免疫功能,抑制NF -的磷酸化κB (12),它还会导致无法控制的组织损伤和可能导致炎性疾病35- - - - - -37]。在这个实验中,我们测量了诱导NOS(间接宾语)mRNA表达水平和细胞上清液中没有内容。我们的调查表明,有限合伙人挑战的基因表达调节进气阀打开,没有争用的升高,这是与以往的研究一致38,39]。但是我们的期望,精氨酸政府抑制伊诺mRNA表达和拒绝任何内容在12 h LPS-induced BMECs。同样,加入雪发现精氨酸增加的活动以挪士但不是伊诺未成熟心肌缺血再灌注损伤后(40]。此外,Colasanti等人建议,硝普酸钠(SNP,没有捐赠者)和真正的没有解决方案能够抑制LPS-induced伊诺mRNA表达(41]。这可能提供证据来支持我们的观察。在我们的研究中,结果导致精氨酸政府下调伊诺mRNA表达和没有内容的衰落在12 h表示,精氨酸可以减轻炎症损伤后LPS-induced急性炎症。

PI3K / AKT / mTOR通路被公认是极度参与细胞代谢、生长、生存,和膜泡运输很长一段时间(42,43]。最近,越来越多的证据表明,这个途径也参加了先天和适应性免疫调制(44- - - - - -46]。等已知的受体细胞因子受体,胰岛素,胰岛素样生长因子I (igf - 1)受体,同时toll样受体能够激活mTOR / PI3K / AKT途径提高PI3K随后AKT的磷酸化和mTOR [47,48]。显示数据在这个研究表明,有限合伙人治疗可能会改变mTOR / PI3K / AKT通路的表达(PI3K和mTOR的mRNA表达降低,降低的程度p-mTOR / mTOR)。这些发现表明,mTOR / PI3K / AKT通路密切相关LPS-induced上皮细胞炎症活动。我们还发现精氨酸政府提高了信使rna及其一种蛋白激酶的磷酸化表达和mTOR(图4)。曼德斯等人认为,PI3K / AKT / mTOR可以负调控的影响通过阻断NF - LPS引起的炎症反应κB transactivation体外模型小鼠巨噬细胞的49]。Mackman和张古哈等人表示抑制PI3K / AKT信号在人类单核细胞的THP-1细胞增强NF -κB激活(50,51]。然而,矛盾的结果报告的谢et al ., Lorne et al .,和福丁等。46,52,53]。他们声称PI3K和mTOR的抑制剂可显著抑制细胞因子的分泌单核细胞和巨噬细胞和中性粒细胞。不同的细胞类型和治疗可能回答对这些矛盾的结果。到目前为止,还没有直接的证据证明mTOR / PI3K / AKT通路如何适应LPS-induced炎症在乳腺上皮细胞。因此,还需要进一步的研究来解决一系列的机械问题为了增加了解精氨酸参与LPS-induced炎症调制。

本研究的另一个目的是探讨精氨酸对酪蛋白合成的影响在LPS-stimulated BMECs。牛乳蛋白质是人类饮食的一个重要组成部分。酪蛋白是牛奶蛋白的主要成分,约占据总数的80%乳蛋白质,α酪蛋白(α- cn)由45 - 55%,β酪蛋白(β- cn)组成的25 - 35%κ酪蛋白(κ- cn)组成的8 - 15%。酪蛋白合成的内容通常被视为能力的标志合成蛋白质和细胞功能的条件。有限合伙人在牛的瘤胃翻译后乳腺遭受莎拉,乳腺炎会诱导,以及一系列的不良事件发生,其中一个是减少酪蛋白合成的9]。在目前的研究中,我们模仿瘤胃有限合伙人侵入乳腺的状态与LPS刺激BMECs建立炎症模型。我们发现有限合伙人明显下降β酪蛋白和总酪蛋白含量,还稍微淡化了的内容α- cn和κ- cn尽管没有显著差异。施密茨并行海因茨等人报告的结果和et al。54,55]。我们还发现,补充精氨酸能够扭转LPS-caused酪蛋白合成的减少的趋势。最后,目前的研究表明,精氨酸可以提高的表现β酪蛋白和总酪蛋白。

5。结论

总之,从目前的实验结果暗示精氨酸有效减毒LPS-induced牛乳腺上皮细胞炎症反应通过抑制NF -κB信号通路。另外,精氨酸可能参与参数/不和PI3K / AKT / mTOR通路。此外,精氨酸也能提高β酪蛋白和总酪蛋白表达LPS-induced牛乳腺上皮细胞(图5)。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

第一个两位作者(Tianyou吴邦国委员长和曹国伟王)的贡献同样工作。

确认

作者要感谢收到的资金进行这项研究从项目由中国国家重点基础研究计划(973计划:2011 cb100803),国家自然科学基金委(批准号31572429),江苏高等教育机构的优先级学术程序开发(PAPD)。