文摘

IL-33 il - 1细胞因子家族成员,诱导Th1、Th2免疫反应的能力。ST2受体结合,其缺乏与增强炎症反应有关。最近的研究表明IL-33在亚群的免疫调节效应在动物模型。1型糖尿病是一种自身免疫、炎症性疾病,在Treg缺陷描述,我们旨在分析在体外影响重组IL-33定量监管CD4的属性+CD25高FOXP3+T细胞。CD4+CD25高FOXP3+以及CD4+CD25高FOXP3+ST2+亚被流式细胞术分析。在一群1型糖尿病患者在体外监管CD4 IL-33治疗诱导+CD25高FOXP3+细胞频率以及移植的表面表达ST2分子。此外,CD4细胞的数量+CD25高FOXP3+细胞携带ST2受体显著增加。类似的效果观察,以防FOXP3的表达。我们没有观察到任何重大变化IL-33健康对照组的细胞治疗。ST2较高水平的血清1型糖尿病患者与健康同行相比。我们建议IL-33变得额外用于免疫刺激性因素诱发Treg扩张未来过继治疗1型糖尿病的临床试验。

1。介绍

IL-33是il - 1细胞因子家族的一员,2005年被确定(1]。相比其他il - 1的家庭成员,IL-33主要是描述为response-inducing Th2型细胞因子(1- - - - - -3]。ST2受体结合,表达对各种细胞的免疫系统,如Th2淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞(1,2,4),但不是Th1细胞(5]。然而,Th1免疫反应也可以由IL-33 [6]。IL-33单独或协同与白介素上调干扰素-γ表达在NK和NKT细胞(6,7),进而促进Th1淋巴细胞的活性。因此,尽管缺乏ST2受体,IL-33可能间接影响Th1诱导免疫反应。ST2受体可以存在于两个forms-soluble和膜结合1]。建议ST2缺乏改变Th1 / Th2平衡,导致增强炎症反应(8,9]。此外,它表明,删除ST2更容易感染T细胞介导的基因是伴随着瀑特异性自身免疫性疾病(10]。BALB / c小鼠接受anti-ST2抗体显示削弱Th2免疫和活跃Th1反应(11]。

IL-33在不同疾病的作用是双重的发病机理和免疫机制取决于每个条件(12]。2型糖尿病小鼠模型(ob / ob)或节段性回肠炎,条件特点是深刻的Th1免疫反应,IL-33诱导Th2细胞,从而防止炎症(13,14]。然而,在小鼠模型的溃疡性结肠炎的病理生理学与Th2细胞因子、IL-33的有害影响是,尽管它能抑制Th1-related细胞因子在这些老鼠15]。

活跃的Th1免疫反应是由调节性T细胞亚群),扮演着重要的角色在维持免疫内稳态。然而他们的定性和/或定量缺陷经常观察到一些自身免疫和/或炎症性疾病,包括1型糖尿病(DM1) [16,17]。因此,新生物制剂需要分析对他们增加Treg和功能的能力。

唯一出版数据的角色IL-33调节性T细胞来自动物模型的研究(14,18,19]。在这些研究中使用IL-33显示有前景的结果在促进监管表型(14,18,19]。1型糖尿病的特点是增强炎症反应以及调节性T细胞缺陷(16,20.]。此外,没有数据的影响IL-33调节性T细胞DM1患者的子集。考虑到这些事实,当前研究的目的是分析在体外IL-33对监管的定量性质的影响 1型糖尿病患者的T细胞数量。

2。材料和方法

2.1。学习小组

研究小组由16个年轻患者招募从儿科诊所,糖尿病学和内分泌学、Gdańsk医科大学,1型糖尿病诊断和8个健康人作为对照组。1型糖尿病的诊断是根据美国糖尿病协会标准(21]。抽样时,血糖水平以及肾功能的生化测定,c反应蛋白和糖化血红蛋白(HbA1c)。所有DM1患者进入微血管并发症的研究自由和其他自身免疫性慢性和急性炎症性疾病。DM1患者的临床特点提出了在桌子上1。对照组包括年龄和性别匹配的健康个体控制访问期间招募门诊诊所。没有自身免疫的迹象,慢性、炎症或肿瘤疾病的采样和在他们的家人没有证据表明DM1披露所确认的医疗记录,实验室检查和实验室检测。研究遵循赫尔辛基宣言的原则,道德委员会批准Gdańsk的医科大学。

表1
1型糖尿病患者的临床特点。
2.2。细胞隔离和文化

Heparin-stabilized静脉血样采集无菌,并用于分离外周血单核细胞(PBMCs) histopaque - 1083(σ)密度梯度离心法。细胞被暂停1×10的密度6细胞/毫升和培养1毫升RPMI 1640补充heat-inactivated 5%胎牛血清(FCS)。对于每一个研究个人,刺激是使用以下模式:1控制指定为“nonstimulated”和2日指定为“刺激。“细胞在两种井处理anti-CD3(美国BioLegend克隆UCHT1)和anti-CD28(美国BioLegend克隆CD28.2)抗体,在5μ克/毫升。此外,重组IL-33(美国BioLegend)浓度25 ng / mL被添加到井指定为“刺激。“细胞培养在37°C和5%孵化有限公司224 h。

2.3。流仪染色和分析

细胞被收获,用细胞染色缓冲区(美国BioLegend),并与抗体染色Treg分析:anti-CD4 (IgG1、鼠标APC、克隆RPA-T4 BioLegend,美国),anti-CD127 (IgG1、鼠标PE-Cy7克隆A019D5 BioLegend,美国),anti-CD25 (IgG1、鼠标PerCP-Cy5.5克隆BC96 BioLegend,美国),和anti-ST2 (IgG1鼠标PE、克隆97203年研发、美国)抗体。在室温20分钟的孵化后,细胞被洗,染色细胞内FOXP3的表达(IgG1、鼠标FITC克隆206 d, BioLegend,美国)。细胞内染色的具体执行根据制造商的建议(美国BioLegend)。表达的细胞表面和细胞内标记评估使用流式细胞仪(美国正欲LSRII)浇注后活细胞由散射特征。积极的信号建立了每个染色使用适当的同形像控制。此外,FOXP3的表达和ST2 门被确定量化的平均荧光强度(MFI)。这是量化的平均荧光强度比FOXP3 / ST2 MFI控制适当的同形像。数据分析FACSDiva 6.0软件(美国,正欲)。

2.4。测定血清ST2水平

血清水平ST2 (sST2)是衡量(Quantikine ELISA方法 系统,明尼阿波利斯,美国)根据制造商的协议。最低检测浓度是由制造商决定5.1 pg / mL。自动板上的结果是读读者(Labsystems MCC断层/ 340年,芬兰赫尔辛基)。

2.5。统计分析

结果分析了使用Statistica版本。10.0(美国StatSoft Inc .)。的比较skew-distributed变量,非参数Mann-Whitney 或Wilcoxon测试应用。斯皮尔曼的相关性是用于比较分析参数之间的关系。是水平的意义 。

3所示。结果

在一群1型糖尿病患者在体外IL-33治疗诱导的监管 细胞(数据1和2)。与IL-33刺激后,的频率 有显著增加(表吗2; )。这是与对照组相比,显示无显著变化Treg频率IL-33治疗后(图2;表3)。此外,我们注意到,在体外IL-33治疗显著诱导亚群的频率表达ST2分子,只有在1型糖尿病组(表2)。更重要的是,FOXP3的表达转录因子定义为平均荧光强度高(MFI) IL-33刺激细胞相比nonstimulated同行(数据吗1 (c)和1 (d);表2)。类似的结果在ST2表达式。这是调节在1型糖尿病患者的细胞培养介质包含IL-33(数字1 (f)和1 (g);表2)。在一个健康的对照组,亚群表现出某种程度的ST2表达式,然而IL-33治疗后没有明显变化(表3)。

表2
CD4细胞的状态+CD FOXP3+和CD4+CD FOXP3+ST2+Treg细胞后在体外IL-33治疗1型糖尿病患者。
表3
CD4细胞的状态+CD FOXP3+和CD4+CD FOXP3+ST2+Treg细胞后在体外IL-33治疗对照组。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
图1
代表流量仪的分析 在DM1患者T细胞在体外IL-33治疗。PBMCs 1型糖尿病病人的培养和刺激中描述的材料和方法,沾Treg相关抗体分子,并使用流式细胞术分析。分析 T细胞,点代表anti-CD4情节与学生进行了建立CD4细胞+和CD4−淋巴细胞大门。然后,以下点情节生成:anti-CD4对CD127 CD4细胞+门。在浇注后CD4+127年−细胞的频率nonstimulated (a)和IL-33刺激(b) 细胞决定。封闭的,nonstimulated (c)和IL-33刺激(d) T细胞是检查FOXP3的表达定义为平均荧光强度。同样,表达式的ST2 nonstimulated (f)和IL-33刺激(g) 进行了分析。在分析FOXP3 (e)和同形像控制ST2 (h)染色。小额信贷机构:平均荧光强度。

图2
定量的特点 亚群后在体外治疗与IL-33 DM1患者和对照组。PBMCs来自16个1型糖尿病患者和8个健康的人在刺激中描述的材料和方法和染色与特定的抗体Treg分子有关。在仪分析的频率 是确定。数据计算与非参数Wilcoxon测试。水平线表示细胞的平均频率。DM1:组1型糖尿病患者;C:健康人的对照组。

扩展我们的研究中,我们分析了浓度的血清中可溶性ST2个人参加这项研究。我们发现ST2水平明显高于1型糖尿病患者与健康受试者相比(图3; )。此外,1型糖尿病患者ST2表达的频率更高 T细胞血清ST2较低级别( ;皮尔森相关)。分析FOXP3与ST2 IL-33言论刺激,nonstimulated细胞培养显示,在这两种情况下FOXP3的表达呈正相关,ST2分子(图的表达3)。


图3
血清ST2水平的1型糖尿病患者和健康人对照组。血清水平ST2 (sST2) ELISA测定的所有个人学习。sST2的平均值(10/90百分位数)是37.3 (26.4/48.9),17 (13.9/20)pg / mL DM1和对照组,分别。由Mann-Whitney差异计算 测试。

4所示。讨论

到目前为止,没有数据上IL-33 FOXP3的影响+调节性T细胞在1型糖尿病患者。只有一些研究显示IL-33免疫调节效应在这个细胞在炎症性肠病小鼠模型子集(14和在小鼠心脏移植19]。在这些研究中,IL-33上调CD4显示+FOXP3+亚通过增加它们的数量,加强抑制活动,以及ST2表面表达。此外,最近发表的两篇论文已经证实IL-33能够诱导监管表型通过促进ST2的扩张+亚[19,22]。

表面ST2表达式可以找到Th2淋巴细胞,以及亚群,但程度,但不是Th1细胞(5,18,22,23]。这取决于STAT5和GATA3核激活(24]。有趣的是,调节性T细胞还需要STAT5以及GATA3适当的函数(25,26]。GATA3−−/亚群中被证明是有缺陷的抑制功能。他们表达下调FOXP3的表达,更容易Th17炎性表型转换(27]。你可能怀疑,如果亚群有障碍在STAT5 / GATA3信号通路,减少ST2表达式可能减弱他们的抑制活性18]。更因为ST2+亚群代表一个激活FOXP3的子集+高抑制细胞活动(19]。在当前的研究中,我们发现低水平的ST2表情亚只有anti-CD3 / anti-CD28抗体治疗,证实可用的发布数据,treg ST2受体表达。在体外然而IL-33治疗的频率增加 细胞表达ST2以及其表面分子表达。这些影响没有观察到的细胞健康的主题。此外,ST2增加的表达FOXP3的表达,这表明基因编码这两个分子可能相互依赖。ST2+FOXP3+亚群已被证明GATA3高水平表达的转录因子(22)由IL-33完全激活(23]。更重要的是,GATA3也激活[- 225]。2缺乏小鼠表达GATA3并没有减少Treg频率(25]。马特等人的研究表明,IL-33刺激树突状细胞分泌有选择地扩大ST2 - 2+抑制亚(19]。增加ST2 - 2表达树突细胞和亚群互动(19),这可能是由于GATA3转录因子的激活。似乎那ST2和FOXP3表达水平紧密相关,这种相关性是由美国(图所示4)。与之前的研究相一致(18,19),我们的研究表明,IL-33上调ST2表情Treg细胞,诱导同时FOXP3转录因子。基于我们的研究结果和其他可用的数据,我们可以怀疑FOXP3的表达随着ST2可能反映了Treg活动水平,这应该更详细地分析了在未来的实验中。当然,这是一个正确的方向进行进一步的研究,以进一步探讨之间的关系ST2 / IL-33轴和亚群。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
FOXP3的表达之间的联系和ST2之间 细胞后IL-33在体外DM1患者的治疗。FOXP3的表达值和ST2定义为MFI nonstimulated (a)和IL-33刺激(b) 细胞的1型糖尿病患者相关的。斯皮尔曼测试是用来计算相关性的强度。小额信贷机构:平均荧光强度。

表明自身免疫性疾病患者,以及2型糖尿病患者,有高浓度的可溶性形式的ST228- - - - - -30.]。我们已经证实这样一个协会。1型糖尿病患者有更高水平的血清ST2相比健康的个体。此外,ST2越低+亚群频率,观察血清sST2。这可能表明,在炎症微环境ST2-positive细胞脱落这个分子从细胞表面,从而失去表型和/或功能性质。这是更有可能的研究,显示删除的ST2在BALB / c小鼠基因导致增强敏感性体外糖尿病(8,9]。此外,糖尿病圣−−/小鼠产生高浓度的促炎细胞因子(8,9]。促炎细胞因子提高sST2的分泌,同时显示在体外和在活的有机体内(31日]。

基于可用的科学数据,不能说与确定IL-33 pro -或抗炎活动;但是可以怀疑其作用可能依赖于细胞因子微环境负责疾病病理。在我们之前的研究中,我们报道,炎性环境可能负责Treg定量和定性缺陷(32]。我们发现治疗的亚群anti-TNF抗体恢复受损的表型和FOXP3表达细胞的诱导频率。检查在这里,我们提出一个额外的因素可能诱导调节性T细胞,从而成为新的免疫治疗工具收养1型糖尿病的治疗,以及其他自身免疫和炎症相关的疾病,特点是缺陷Treg-mediated监管。IL-33可能诱发Treg细胞在1型糖尿病患者;然而,更多的研究包括定性表征IL-33治疗 在更大的群体的病人需要做。这将有助于进一步了解亚群之间的关系和ST2 / IL-33轴。

据我们所知,这是第一个研究表明之间的关系ST2 / IL-33轴和调节性T细胞在人类1型糖尿病。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的国家科学研究委员会ST28 (Gdańsk医科大学的)。