文摘
丁香酚(与氧化锌粉末混合)是广泛使用的直接覆盖材料在乳牙牙髓治疗。本研究的目的是评估丁香酚的影响在不同的基因参与炎症和细胞凋亡过程。丁香酚的监管效果在炎症和凋亡基因的表达是评估从提取第三磨牙,牙髓成纤维细胞培养的丁香酚的浓度下13μm .丁香酚允许炎症和凋亡基因的表达相比,积极的和消极的控制。丁香酚促炎的代理时,它是在直接接触健康的组织和行为作为抗炎剂在组织发生炎症/凋亡过程中,如例髓乳牙的炎症。这些发现适用于牙科,当考虑安全的应用髓治疗严重腐烂的孩子的牙齿。
1。介绍
龋齿是最常见的慢性疾病引起的童年主要由一个贫穷、长期的口腔卫生。在它的初期阶段,这种疾病可以预防和可逆的;然而,如果不适当和及时的控制,努力生龋齿的细菌可能严重破坏牙齿组织,因此影响到牙髓(1]。牙髓是一种结缔组织主要由成纤维细胞和成,与一个固有的功能修复牙质在有利的环境中(2]。因此,当务之急是保护乳牙牙髓活力和功能。
在牙髓组织炎症的情况下由腐烂的纸浆曝光,有渗透的生龋齿的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,主要在口腔微生物群。众所周知,生龋齿的细菌的细胞壁结构主要是构成的脂多糖(LPS)。有限合伙人可以激活浆免疫系统,诱导促炎趋化因子和细胞因子的隔离,毛细血管通透性增加(3]。此外,纸浆在炎症反应中的作用是通过免疫细胞对抗感染和组织损伤,如成纤维细胞和其他细胞识别损伤从生龋齿的细菌4];成纤维细胞激活细菌表面受体的识别,启动炎症反应通过刺激细胞因子的生产,包括促炎、抗炎和监管细胞因子(5]。此外,招募中性粒细胞和多形核的细胞发生,增加表达的白细胞介素6]。
维护主要牙齿功能的完整性和健康状态,直到他们自然剥落是儿科牙科的基本目标之一。至关重要的是实现正常口腔功能和面部增长(7]。为此,儿童牙科医师采用多样化的恢复性治疗深龋的病变或牙髓学的过程有或没有果肉组织暴露于乳牙。最常见的和被广泛接受的临床儿科牙科治疗牙髓学的是牙髓切除术技术(8]。牙髓切除术的目标是只删除受影响的冠髓组织,这样影响神经根髓组织依然存在和运转正常,直到牙齿准备去角质(9]。因为它的镇静或止痛的属性,低成本、简单,功效,氧化锌/丁香酚组合(佐伊)是常用的作为覆盖材料对根的纸浆在乳牙牙髓切除术时(9]。
丁香酚(4-allyl-1-hydroxy-2-methoxybenzene)是一种从植物中提取精油尤金尼亚caryophyllata(10),俗称“丁香”,生长在全球不同地区(11]。这种油已经证明具有不同的生物学特性,如抗菌、止痛、抗炎、抗氧化、抗诱变剂的,抗癌的效果(3,12]。最近在活的有机体内研究探讨了潜在的抗癌特性,丁香酚,展示在几个癌症细胞系凋亡的诱导动物肿瘤模型(4,13]。另一方面,通过不同的实验模型,丁香酚已被证明减少氧化应激(OS)通过阻止氧化损伤(14- - - - - -16]。矛盾的是,佐伊也被证明具有不良影响时直接放置于牙质组织或工作时在乳牙牙髓切除术材料(17,18]。丁香酚是几种类型的人类细胞的细胞毒性,包括牙髓成纤维细胞;不仅降低了这些细胞的生长和存活,而且他们的胶原蛋白合成和骨涎蛋白表达,在修复牙本质的形成起到至关重要的作用[18]。因此,有必要获得新的信息关于为什么时,在哪些情况下丁香酚提供有益或有害影响,以获得安全的就业佐伊在临床小儿牙科治疗深龋的乳牙。
本研究的目的是评估抗炎作用的丁香酚在牙髓成纤维细胞培养,在炎症条件下。这些影响是通过测量生产一些炎性细胞因子和炎症相关基因的表达。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
整个培养过程是基于先前的报道方法Escobar-Garcia et al。19]。的牙髓成纤维细胞来源于提取caries-free第三磨牙。提取的臼齿是放置在一个传输介质(磷酸盐(PBS)解决方案与抗生素混合3% (1000 U /毫升青霉素,链霉素1毫克/毫升、和两性霉素B 2.5毫克μL))。然后,髓室与钻石盘接触,和牙髓组织移除,用传输介质,和孵化在胶原酶溶液(2毫克/毫升)3 h在37°C, 5%的公司2,95%的湿度。使离心后,上清液被移除。其余的组织培养的外植体(组织切割成小,1 - 3毫米),连同3毫升的杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)培养基富含10%胎牛血清的边后卫和抗生素组合(1000 U /毫升青霉素,链霉素1毫克/毫升、和两性霉素B 2.5毫克μL);混合是在37°C的环境中,5%的公司2,95%的湿度,培养基是每隔一天更换一次。
2.2。治疗和控制组织
一旦细胞> 70%的文化达到融合,成纤维细胞被分配到不同的学习小组。五组指定如下:(1)成纤维细胞放置在一个丰富的边后卫培养基(阴性对照组);(2)成纤维细胞治疗只有有限合伙人10μ克/毫升(脂多糖大肠杆菌0127:B8),没有丁香酚为48 h(积极控制炎症);(3)成纤维细胞治疗24小时与LPS 10μ13 g / mL,丁香酚μM 24 h(实验组);(4)成纤维细胞治疗与丁香酚24 h,而有限合伙人(实验B组);和(5)成纤维细胞治疗H2O224 h,没有丁香酚(细胞凋亡的积极控制)。在实验组(A和B),介质被修改根据13丁香酚的浓度μ(这个浓度是基于以前的工作报道Escobar-Garcia et al。19),然后孵化24小时。每个实验进行了一式三份。实验后,细胞脱离文化框采用胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA) 0.025%,为后续收集RNA隔离。
2.3。RNA隔离
RNA的方法分离培养的成纤维细胞通过三试剂(Sigma-Aldrich生物科学,圣路易斯,密苏里州,美国)后,制造商的指示。提取的RNA就悬浮在RNase-free水。遗传物质的浓度是量化使用NanoDrop试剂(热科学FC Multiskan®;热科学,万塔、芬兰)。
2.4。互补脱氧核糖核酸的合成
互补DNA(互补)合成了1μg的RNA利用逆转录长期逆转录酶(试剂盒GmbH是一家现代化、d - 40724希尔登,德国)试剂和孕育了两次,也就是说,在37°C和60分钟5分钟在85°C到转录酶灭活。
2.5。扩增的PCR产物
具体放大炎症(NF -κB, il - 1β肿瘤坏死因子-α和VEGFA)和凋亡(p53和Apaf-1)基因进行了分别利用引物对扩增(表1)。正向和反向PCR反应在25日进行μL绿色GoTaq (WI Promega有限公司麦迪逊,美国)掌握混合,组成的cDNA 0.5 250 ng和底漆μm .设计引物,Amplifix 1.5.4项目就业;校准和温度被证实使用Oligocalculator在线软件。引物的序列和表中描述的退火温度1。最后,PCR产物进行琼脂糖凝胶上电泳1%,90伏特1 h。分析了琼脂糖凝胶在数量BioRad(美国BioRad实验室、大力神、CA)登记照片,其中每个基因的相对表达与对照组相比;3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是利用看家基因。
2.6。统计分析
结果学习小组都是连续变量,因此均值和标准差表示为(SD):三个数据集每组从每个治疗组和6个数据集。意味着由单向方差分析比较(方差分析)其次是图基测试多个比较,雇佣SigmaPlot版本。11.0统计软件(Systat软件,Inc .)。一个值< 0.05为显著。
3所示。结果
3.1。丁香酚和炎症
评估是否有纤维母细胞的基因表达差异,比较了如下:(一)消极的控制与治疗组细胞与丁香酚和(b)积极控制(有限合伙人)和细胞组与丁香酚治疗。第一个比较(负控制与细胞用丁香酚治疗组)表明,核转录因子(NF -κBκB)表示1.16倍比消极的控制,相应的增加了16%(图1(一))。白介素- 1β(摘要意思β)是表示2.4倍高于相对应的控制(图表达的增加了145%1 (b))。肿瘤坏死因子-α(TNF -α)是表示控制细胞的1.3倍,代表表达(图增加了30%1 (c))。血管内皮生长因子的细胞治疗(VEGFA)基因表达丁香酚1.08倍消极的控制,代表基因表达(图增加了6.5%1 (d))。通过执行一个分析的表达式与炎症eugenol-treated细胞基因治疗和细胞与有限合伙人曾接受治疗浓度的10μNF - g / mLκB基因表达是对照组的0.9倍,占8.5%的抑制表达(图1(一))。肿瘤坏死因子-α表示只有0.7倍,代表25.4%抑制(图1 (b)),而摘要意思-β和VEGFA继续表现出促炎的行为,表示为1.8倍和1.08倍,控制炎症,分别对应于摘要意思——81.2%β和7.2%的VEGFA诱导表达增加(数据1 (c)和1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。丁香酚对细胞凋亡过程的影响
两个基因及其表达参与了细胞凋亡过程:肿瘤抑制基因p53 (p53)和凋亡肽酶活化因子1 (Apaf-1)。p53基因表达控制的1.04倍或感应(图增加了4%2(一个)),这是统计学意义()。同样,Apaf-1 gene-treated细胞抑制丁香酚表达式在32%(0.68倍)对控制(图2 (b));这种抑制作用也显著()。
(一)
(b)
4所示。讨论
过早乳牙丧失会导致咬合不正和语音或功能问题日益增长的孩子。因此,它是必要的,儿童牙科医生总是打算保留主要炎症牙髓活力自由/感染[20.]。致病性细菌和他们的产品参与严重形式的炎症牙髓暴露时龋齿。然而,事实证明,即使没有发生牙髓的炎症的细菌和其他因素参与炎症过程;例如,考虑到ZOE-based材料释放少量的丁香酚在接触牙质组织,丁香酚可以通过牙本质小管扩散,造成潜在伤害纸浆(21]。佐伊混合后,发生螯合反应和锌eugenolate就形成了。这种化合物很容易水解时暴露牙本质小管液屈服丁香酚和氢氧化锌;免费丁香酚可以通过小管扩散到达髓组织及其细胞组件,如成纤维细胞(17,21,22]。
目前的结果表明,丁香酚诱发不同基因的表达参与炎症过程;正是在这里观察到基因表达显著增加,成纤维细胞治疗与丁香酚与未经处理的纤维母细胞(图3(一个))。然而,丁香酚抑制NF -的表达κB当现有inflammatory-inducted过程(例如,有限合伙人),在这种情况下,先在炎症,如真正的乳牙牙髓的条件(图3 (b))。丁香酚与NF -允许交互κB抑制剂(IKB);后者IKB介导蛋白质磷酸化和退化,进而激活NF -κB转录因子促进nonapoptotic信号通路和基因表达通过凋亡途径,确保nonapoptotic信号激活(23]。此外,丁香酚已被视为抗炎剂由于其著名的参与抑制环氧酶2 (COX2)表达式。这种蛋白质负责炎症前列腺素的生产。Upregulation COX2也与增加细胞粘附,表型变化,抵抗细胞凋亡和肿瘤血管生成24,25]。
(一)
(b)
纤维母细胞文化构成一个适当的模型来研究炎症和细胞凋亡的机制在分子水平上26]。据报道,NF -κB包括转录因子调节炎症过程和参与许多细胞因子的转录,如肿瘤坏死因子-α摘要意思- - -β,il - 6 (27];因此,这个因素的抑制剂可以被认为是抗炎剂(28]。这个基因也在其他进程中起着重要作用,包括细胞发展、增长和扩散(29日]。肿瘤坏死因子-α是一种重要的促炎细胞因子分泌许多细胞类型,如巨噬细胞、淋巴细胞,成纤维细胞,可见,炎症反应,感染,或环境变化30.]。在相同的背景下,摘要意思-β是一个重要的调停人炎症反应的促炎的胞嘧啶,参与不同的细胞活动包括增殖、分化和细胞凋亡31日];它的作用在抗菌防御在急性反应阶段。VEGFA主要在内皮细胞生长因子表达,与不同的效果,如调解增加血管通透性,促进血管生成,细胞迁移,细胞凋亡抑制(32]。
细胞凋亡或程序性细胞死亡是一个复杂的现象包括微妙的信号调节蛋白通过基因表达和/或蛋白质的活动。细胞凋亡参与各种生理活动参与许多疾病,包括癌症和神经退行性疾病(33,34]。流程可以启动内在或外在,取决于细胞死亡信号的性质。收到内在凋亡刺激后,几个proapoptotic蛋白质从线粒体释放细胞溶质,涉及大量的基因,如p53和Apaf-1 [23]。一个肿瘤抑制基因p53是一种蛋白质编码。因此,编码蛋白响应多样化强调机制在细胞,调节靶基因的表达,引起细胞周期阻滞,细胞凋亡、衰老、DNA修复、细胞代谢的变化(35]。Apaf-1基因编码胞质蛋白,促进细胞凋亡过程中,介导细胞色素C打破,并激活procaspase 9;这个过程最终激活半胱天冬酶3,负责细胞凋亡的发生(36]。
NF -κB是一个异质二聚体复杂kappa-B DNA位点结合的靶基因。个人二聚体有偏好不同kappa-B网站,他们可以结合的亲和力和特异性。这二聚体复杂的局部在细胞质的活性连着kappa-B抑制剂(I-kappa-B)。激活传统I-kappa-through I-kappa-B激酶的磷酸化发生(IKK),以应对不同的活化剂,并随后退化,从而释放复合维生素b;一旦激活,NF -κB那么易位到细胞核。该基因参与的规定> 500个基因参与炎症过程,细胞生存、增殖、血管生成和转移37]。因为NF -κB是炎症过程的监管,抑制其表达被认为是抗炎效应(23]。
Apaf-1是一种胞质蛋白和轴控制细胞凋亡的监管网络。丁香酚能显著抑制Apaf-1的表达,表明丁香酚不产生程序性细胞死亡,虽然它能够明显诱导p53的表达,这可能表明,细胞接触这种油。层,如果有任何变更genome-increased p53的表达动机,为了修复遗传物质的损伤,但没有达到最终的细胞凋亡过程。因此,许多多细胞生物的细胞凋亡是一个正常的过程;然而,在这个过程中改变与不同疾病的发病机理有关。
5。结论
根据本研究的结果,低浓度丁香酚具有抗炎剂的性质时发现果肉组织的发炎状态,是可逆的情况下在乳牙牙髓炎,由于能够抑制基因表达,如NF -κB和肿瘤坏死因子-α。
伦理批准
本研究机构的伦理委员会批准的注册和圣路易斯波多西大学牙科学院墨西哥圣路易斯波多西(代码没有批准。ceife - 006 - 2016)。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这个研究项目的支持uaslp - c15 - fai - 04 - 101.101。手稿的英语复习玛吉Brunner尤为赞赏。