文摘

C57BL / 6小鼠测试为了调查饮食的影响壳聚糖(COS)补充肠道微生物区系和阻力枸橼酸杆菌属rodentium感染。后,研究结果显示,摄入300毫克/公斤因为饮食为14天,微生物群落更加多样化的补充。老鼠接受因为表现出增加的百分比拟杆菌门和厚壁菌门的百分比减少门。后枸橼酸杆菌属rodentium感染、组织病理学评分表明,因为喂养导致那么严重结肠炎。il - 6和TNF -α从COS-feeding小鼠结肠均明显低于对照组。此外,老鼠因为组还发现体验抑制活化的核factor-kappa (NF - Bκ在结肠组织B)。总的来说,研究结果显示,在饮食中加入300毫克/公斤因为改变小鼠的肠道微生物区系的组成,从而抑制NF -κB激活和TNF -产量减少α和il - 6;和这些变化导致更好地控制感染的炎症和决议c . rodentium。

1。介绍

枸橼酸杆菌属rodentium、粘膜病原体发现在老鼠和致肠病的大肠杆菌(EPEC)和肠出血大肠杆菌肠出血性大肠杆菌,肠病原体中发现的人类,创造附加和消除(A / E)损伤所导致的肠道内黏膜的殖民化(1,2]。肠上皮细胞变成细菌侵入了附件,刷状缘微绒毛变得枯竭,和pedestal-shaped结构开始形成附着细菌(下3]。结肠组织变化与肠出血性大肠杆菌和EPEC感染,以及增加炎症细胞因子和白细胞浸润的生产,由于a / E病原体后殖民的结肠上皮细胞(4]。c . rodentium在老鼠的数量已经被许多研究者代表肠道大肠杆菌因为肠道EPEC或肠出血性大肠杆菌不感染小鼠。

许多重要的肠道疾病中发现人类也经常模仿c . rodentium在老鼠身上,比如大肠肿瘤发生、溃疡性结肠炎、克罗恩病(5]。结肠炎的发展已感染的老鼠c . rodentium,从而导致细菌变得过多的和老鼠的自然微生物群减少在品种和数量6]。当感染,1 - 3%的小鼠的肠道菌群c . rodentium(7),而结肠受到攻击10⁹集落形成单位(cfu) / g (8]。老鼠的基因构成影响的形成c . rodentium全身的结肠炎,老鼠等影响HeJ和FVB / N容易开发结肠炎的感染和老鼠,如cd和C57BL / 6正在考虑在那些不容易患结肠炎,只是容易亚临床症状(9]。易受感染c . rodentium以及趋势显示特定的免疫反应,发现肠道菌群组成高度相关(10]。

人类肠道房屋500 - 1000种微生物群的总量近100万亿(11]。各种各样的因素,包括位置和饮食,metagenome产生重大影响,尽管这些因素没有同样的效果在一个生物体的基因组。病原体位移,提取的能量如SCFAs nondigestible膳食基质和免疫系统的发展都依赖于肠道微生物群。显著变化的自然微生物群内稳态与各种疾病在人类12]。

因为最丰富的多糖存在于昆虫、真菌、鱿鱼、牡蛎、鳞虾、蛤、贝类。这是一个自然N-deacetylated甲壳素的导数(13]。许多研究人员探索的方式Th1、Th2细胞因子的表达是影响COS (14]。在猪14],老鼠[15),大鼠(16),和鱼17),因为作为监管机构的免疫反应。然而,对肠道菌群是如何影响饮食因为尽管一小部分研究试图研究在猪和鸡18]。将是有用的洞察是否通过肠道微生物群,因为能够执行其有利的生物功能,因为它已经知道很多生物功能影响肠道微生物群(19,20.]。尽管如此,目前,一些研究结果存在的主题c . rodentium、肠道菌群的影响因为补充剂。因此,本研究的目的是评估补充因为微生物菌群组成变化的影响,减少促炎的分子(和/或抗炎分子增加)c . rodentium感染。

2。材料和方法

2.1。老鼠和饮食

本研究使用雄性C57BL / 6小鼠年龄在6 - 8周大,繁殖和饲养的饲养者湖南农业大学中国公司当中的线性实验动物中心。只使用雄性老鼠的原因是性和母性因素已被证明影响微生物群落组成。湖南农业大学动物保健和使用委员会为实验提供了批准。老鼠提供了充足的水和一个正常的饮食21),他们分别保持在动物免受病原体的殖民地。殖民地的温度保持在25°C,相对湿度53%,同等平衡的12小时的黑暗和光明。老鼠被随机分配给COS和控制组被安置在殖民地后三天,每组20只老鼠。一个正常的啮齿动物的饮食(21)为对照组。300毫克/公斤因为添加到标准饮食因为集团,连续使用14天。因为有一个6-sugar n -乙酰氨基葡萄糖单元β-(1 - 4)联系(8),平均分子量小于1000 Da,和一定程度的脱乙酰作用超过95%,木糖醇是免费的。因为提供给老鼠在这项研究是由中国科学院大连化学物理研究所。早期的发现研究论文(14)被用来指导因为给定的时间和数量。在整个实验中,小鼠的体重增加,用水量,食品消费记录。直到被准备分析、样本保存在−80°C。

2.2。c . rodentium感染和监控

基底或因为饮食后的14天内,每组10只老鼠被感染c . rodentium。有限公司₂窒息是所有老鼠D7感染后管理。老鼠的粪便样本,组织和结肠内容聚集。细菌生长在Luria Bertani肉汤(0.05 g / L萘啶酸/毫升)。离心是用于颗粒产生的文化和resuspended在无菌磷酸盐(PBS)。这导致了5×10的浓度⁹CFU /毫升。老鼠然后挑战早上9点5×10⁹CFUc . rodentium口服接种到小鼠使用填喂法的过程。为了防止脱落小鼠感染蔓延,所有老鼠感染时保持分开c . rodentium。的老鼠相同的基底或因为饮食7天,分别。粪便收集D7感染后进行,此时他们还重,悬浮在PBS。连续稀释被镀到盘子含有萘啶酸。经过一段时间的24小时内,细菌菌落数。每个稀释生长在37°C一夜之间使用MacConkey琼脂中的倾注平皿法与抗生素卡那霉素(40补充μ为了计算g / mL)c . rodentium。

2.3。结肠组织:组织学分析

每只小鼠的结肠和固定在10%福尔马林。苏木精和伊红染色剂和石蜡包埋部分做准备。六个标准(水肿、溃疡、侵蚀、炎症,杯状细胞增生,和cryptitis)被提出以组织学上年级结肠炎。0 - 4的规模是用来分病变如下:没有上皮增厚/结肠炎(0);小上皮细胞增生/更大数量的粘膜白细胞(1);炎症在众多位点、黏膜下层和粘膜渗透通过白细胞和/或重要的上皮细胞增生(2 - 3次的上升隐窝)(2);更大的上皮细胞增生(地穴计数高3 - 10倍),减少杯状细胞分泌黏液,溃疡,和/或重要的白细胞的浸润黏膜下层和粘膜(3);极高的上皮细胞增生(10个或更多倍墓穴计数),隐窝脓肿,和/或严重的透壁的浸润白细胞(4)。

2.4。16 s rDNA Illumina公司MiSeq测序

基底或因为饮食后的14天,收集粪便和每组10只老鼠被杀死收集结肠内容。然后,粪便和结肠内容用于16 s rDNA测序。按照指南DNA隔离,QiagenQIAamp DNA凳子迷你工具被用来从腔的结肠癌和粪便中提取DNA的内容。为了创建一个基线样品每个样品类型,相同数量的DNA来自六个人老鼠。引物515 f 5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′- 907 r 5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′(条形码作为eight-base序列个人每个特定样本)被用来放大V4-V5地区细菌16 s核糖体RNA基因的PCR。Biotree商业公司总部设在上海,进行数据分析和Illumina公司MiSeq测序。先前的研究结果用于指导MiSeq PE库,MiSeq测序,和额外的分析22]。相应的作者可以联系请求更多的信息参考,原始数据,排序。

2.5。结肠mRNA分析

il - 6和TNF-α表达式被纳入分析,收集和称重后发生的近端结肠。试剂盒摄政(美国英杰公司)是用于信使rna的提取。反转录的cDNA, ABI 7500 rt - PCR快速机(应用生物系统公司),上标二世逆转录酶(表达载体),和低聚糖(dT) 20人用来进行实时PCR。

2.6。细胞因子测定

一个50毫米Tris-HCl 10g / mL蛋白酶抑制剂的解决方案(Sigma-Aldrich有限公司美国)被用来使均匀结肠样本在冰。离心20分钟用的匀浆,享年30000岁g (4°C)。离心后,夹心酶联免疫试剂盒(美国ELISA Ready-SET-GO eBioscience, CA)是用于测试的上层清液TNF -α和il - 6。细胞因子进行了匹配正常化结肠样品的蛋白质含量。

2.7。NF -κB (p65)免疫印迹

NF -κB (p65)转录因子分析工具包(美国MI开曼化学公司)是用来测量NF -κB (p65)绑定活动核提取物。从核和细胞质分数被提取的蛋白质数量相等,然后使用sds - page(1)划分,(2)迁至PVDF膜(微孔、马、美国),和阻碍使用5%脱脂牛奶Tris-Tween缓冲盐水缓冲(20毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,150毫米氯化钠,Tween-20 0.1%)超过3小时的时间。之前进行分析与α成像仪2200(αInnotech公司、钙、美国),一夜之间在4°C进行了孵化的主要抗体,而60分钟孵化与HRP-conjugated在室温下进行了二次抗体。最后,电子信号强度的量化和归一化核纤层蛋白B蛋白丰度进行。

2.8。统计数据分析

SPSS 22.0(美国芝加哥,IL)是用来进行统计分析。在本节说明的数据意味着±标准平均误差(SEM)。学生的以及用于分析数据之间的两组。在这项研究中,统计学意义的价值观所示。

3所示。结果

根据体重测量,没有postinfection每个老鼠的体重变化的两组。此外,如图1D7感染后,没有提到数量的变化c . rodentium在每一组的粪便或结肠内容。然而,如图2观察结肠炎严重程度大幅提高,D7感染后在对照组的老鼠相比,因为提供的老鼠。

如表所示1,16 s rDNA测序分析肠道菌群一旦完成了实验。16 s rDNA测序的结果用于调查因为补充剂在组织病理学评分的影响。很明显,COS-fed老鼠减少微生物群多样性(根据他们的粪便样本),根据香农和辛普森指数,而对照组的老鼠。指数还显示,COS-fed老鼠显示微生物群的多样性高于对照组的小鼠结肠分析的基础上。有趣的是,它是由Ace和曹国伟表示丰富指标,两组的老鼠显示相似的微生物群社区丰富他们的粪便和结肠(表样本1)。

RDP分类器被用来执行taxon-dependent分析以确定肠道微生物群的分类。两组小鼠的粪便微生物群显示九门,包括一个候选人除法(TM7),而结肠微生物群显示七门,包括一个候选人部门(TM7)。此外,六门的老鼠被发现在每个组。如图3在结肠内容,厚壁菌门(96.8%)和变形菌门(1.3%)最高的类群比例COS-fed结肠微生物群的老鼠,在粪便厚壁菌门(96.1%)和变形菌门(1.8%)最高的类群中的百分比控制老鼠。拟杆菌门的百分比(61.4%)、厚壁菌门(27.1%),和变形菌门(4.5%)是三个最丰富的粪便微生物群COS-fed老鼠,而拟杆菌门的百分比(53.8%)、厚壁菌门(39.6%),和变形菌门(3.5%)是最丰富的在控制老鼠。

如图4(一)、结肠癌的分析控制老鼠明显更高il - 6和TNF-α信使rna比COS-fed老鼠D7后感染。这个发现支持通过ELISA结果(图4 (b))。

核NF -κB (p65)测量被识别激活NF -κB在冒号的老鼠。的目的是为了确定COS(即有益的结果。支持,减少感染)的抑制NF -κB激活途径。结果表明,明显高于对照组的小鼠核NF -κB (p65)比COS-fed组小鼠结肠样本,这表明因为抑制NF -κB激活(见图5)。

4所示。讨论

c . rodentium,这是类似于人类致肠病的大肠杆菌感染,是一种细胞外感染小鼠肠道病原体。它也指出,炎症性肠病(IBD)往往是模仿使用c . rodentium在老鼠身上。炎症性肠病导致肠道炎症。因此,肠道病理是诱导肿瘤坏死因子等炎性监管机构的监管α和il - 6 (6]。肠道细菌社区影响小鼠的易感性和能力去克服c . rodentium一样,感染小鼠的免疫反应(23]。大肠杆菌被感染的老鼠通常模仿c . rodentium因为不受老鼠EPEC或肠出血性大肠杆菌。c . rodentium老鼠被发现在所有的压力,但它在人类疾病是罕见的。根据应变,受感染的老鼠可以受感染后的亚临床疾病或死亡9]。例如,据信是抗药性发展导致结肠炎c . rodentium感染包括cd和C57BL / 6小鼠。另一方面,人们相信易感性老鼠菌株之间存在影响HeJ和FVB / N [9]。基于这些信息,人类大肠杆菌感染模型在本研究中通过感染C57BL / 6小鼠c . rodentium。

结果表明,感染小鼠后c . rodentium、炎症更快地解决在小鼠接受300毫克/公斤因为比控制老鼠。结果指出不影响的数量c . rodentium来自粪便样本,这表明COS的调节影响不是由于迅速根除致病,而是由于微生物群落多样性的改善。等各种生物功能是影响微生物群(19,20.,它与癌症有关24,25)、肝硬化(26),和其他疾病。因为壁厚菌门有能力向主机提供额外的能量通过发酵植物多糖SCFA,这是肥胖的原因与更高浓度的厚壁菌门:拟杆菌(27]。目前,因为数量的最小化影响壁厚菌门背后的原因还不清楚。一些研究也表明,减少肠道壁厚菌门可通过酸性寡糖、低聚半乳糖的/长链果聚糖溶液(GOS / lcF, 9/1), fructooligosaccharides和其他低聚糖(28]。也许因为可能函数的n -乙酰氨基葡萄糖作为粘合剂,因为可以影响肠道细菌的附件。有鉴于此,猪和鸡的研究表明,肠道微生物群落可以影响因为补充剂的引入18]。此外,肠道菌群可能会改变由于因为作为可发酵基质对某些细菌,因为这可以降低肠道的pH值,激活天然酸生产(26]。

各种研究表明在体外和在活的有机体内因为的抗炎作用。在最近的研究中,人们已经发现,il - 6和TNF -α结肠中表达减少因为,同时微生物菌丛是炎症的影响23]。因此,微生物变化可能受增加炎症的影响。由于粪便样品没有关系c . rodentium数量和COS的引入,这一发现是矛盾的。因此,的速度c . rodentium分辨率与微生物群落发生变化,没有炎症29日]。这项研究的结果表明,因为对肠道的影响只发生在肠道中的特定区域和特定的形式。老鼠,因为被发现更低的炎性细胞因子的表达,与感染菌群变化导致更快的恢复。

因为是一个d-glucosamine低聚物,不能被肠道酶侵蚀。因此,因为直接保护宿主肠道上皮细胞(IEC)。研究表明,IEC表达各种趋化因子和细胞因子受体TLR4等toll样受体(30.]。在IEC, NF -κB-regulated促炎细胞因子的生产是由TNF -之间的互动α和各自的受体TLR4、TNFR1 TNFR2 [31日]。研究还表明,肠上皮屏障的功能障碍可能发生的结果明显IEC-regulated粘膜炎症反应,这与大TLR4和TNFR表达(32]。在最近的研究中,据透露,显著减少NF -的激活κB在结肠肿瘤坏死因子-的生产α和il - 6是通过政府因为通过基底的饮食。从最近的研究发现,老鼠可以开发疾病共享与克罗恩病相似的特征由于IEC-derived TNF -α(32),这表明抗炎的影响因为可能的结果因为的NF -激活抑制的影响κB和IEC的促炎细胞因子的生产。

总的来说,很明显,体内c rodentium感染可以通过引入衰减COS成老鼠的饮食。研究结果表明,这是由于il - 6和TNF -的预防α表达和NF -κB激活以及肠道微生物区系的变化。保护宿主免受创新和成功的方法c . rodentium感染因此可以通过进一步调查的有机碳水化合物低聚物COS。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版这篇文章。

确认

本研究在一定程度上支持中国国家重点研发项目(2016 yfd0500504),中国国家自然科学基金(31402092),重点实验室的开放基础在亚热带地区农业生态的过程,亚热带农业研究所,中国科学院(ISA2015303),湖南省科学技术部(13 jj2034 2013 fj3011 2014 nk3048 nk4134 2014和2014 wk2032),和开放的项目计划的食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学(sklf - kf - 201416)。作者想扩展他们的真诚感谢院长以来在沙特国王大学科学研究的资助这项研究的研究小组项目没有。以序列- 213。