文摘

血清c反应蛋白(CRP)的评估建议中间心血管(CV)的风险。这里,系统性或intraplaque CRP水平调查主要不良心血管事件的预测因子(锤)严重颈动脉狭窄患者。血清CRP水平评估和内部不同部分(上游和下游)颈动脉斑块的217名患者发生动脉内膜切除术。c反应蛋白之间的关系和intraplaque脂质,胶原蛋白,中性粒细胞,平滑肌细胞(SMC),巨噬细胞确定子集。观察血清CRP和intraplaque生物标志物之间没有相关性。在上游部分,CRP内容直接与intraplaque中性粒细胞,巨噬细胞,巨噬细胞M1和反向与SMC相关内容。在下游部分,intraplaque CRP与M1和M2巨噬细胞有关。根据分界点(CRP > 2.9%)被ROC分析上游部分,kaplan meier分析表明,高c反应蛋白水平有更大的患者钉头槌。这种风险的钉头槌增加独立于年龄、男性性别,血清c反应蛋白,他汀类药物使用。总之,在严重颈动脉狭窄患者,高c反应蛋白水平在颈动脉斑块的上游部分直接和积极与intraplaque炎症细胞和预测在18个月的随访期间钉头槌。

1。介绍

人们普遍建立,适应性和先天免疫(血管硬化进行严格的检查1]。一些可溶性和intraplaque炎症介质已被证明不定地影响免疫和血管细胞的功能。研究最多的炎症分子之一,是c反应蛋白(CRP)、短pentraxin由肝脏产生回应白介素- 6 (IL)微生物引发或组织损伤后2]。在人类,c反应蛋白是一个急性期蛋白,血清从小于1.0 mg / L在基线1000倍高水平在急性反应(2]。CRP可以绑定到氧化或退化的低密度脂蛋白(LDL)激活补体;它能诱导粘附分子的表达,调节巨噬细胞低密度脂蛋白胆固醇的吸收,刺激单核细胞招聘在动脉壁内,和增加趋化因子的生产,如单核细胞化学引诱物蛋白1 (3- - - - - -5]。在过去的二十年里,CRP检测临床使用作为一个敏感、特异性的系统性感染的标志,炎症和组织损伤。特别是,它被强调为一个有前途的标志冠心病、缺血性中风和认知障碍,血管死亡率,从不同癌症和死亡6,7]。然而,CRP的影响的预测心血管事件(CV)已经削弱了Danesh和他的同事们(8]。鉴于之间存在强大的协会,慢性炎性疾病和冠状动脉疾病的风险增加,c反应蛋白是否提出的问题一直是一个无辜的旁观者或一个活跃的球员proatherosclerotic机制(9]。

颈动脉狭窄是缺血性脑血管病的一个独立危险因素和认知障碍的直接原因,估计患者的患病率为9.3%(超过70年的历史10,11]。在高加索人群,颈动脉动脉粥样硬化通常是发现在颈动脉分叉,包括远端颈总动脉和颈内动脉近端。系统性和已经提出intraplaque炎症可能与斑块易损性(12]。(血清高灵敏度)- hs - CRP已经证明是直接与颈动脉斑块易损性(13- - - - - -15]。然而,intraplaque CRP一直缺乏调查人类颈动脉斑块(15]。在冠状动脉平滑肌细胞(SMC)被发现c反应蛋白分泌炎性细胞因子(16,17),凸显出一个潜在的proatherosclerotic CRP在斑块破裂和血栓形成的作用18]。

在目前的研究中,我们调查了潜在的血清和intraplaque CRP水平之间的相关性和intraplaque炎症和血管细胞严重颈动脉狭窄患者。此外,考虑到斑块异质性,我们评估的潜在的预后价值,CRP值颈动脉斑块的上游和下游部分对主要不良心血管事件(锤)在18个月的随访。

2。方法

2.1。病人和临床评估

从2008年3月到2011年6月,我们招收了269名患者额外的颅,高档狭窄腔的狭窄(> 70%)的颈内动脉观察组在一个中心(IRCCS Azienda Ospedaliera大学联盟圣Martino-IST史重回/ la Ricerca南Cancro,热那亚,意大利)。一些样品已经被用于分析和发表(19- - - - - -21]。在总群(),颈动脉内膜切除术52人失踪,留下217个样本用于分析在当下substudy。如前所述(22),所有患者经历了颈动脉内膜切除术(CEA)根据公布的建议北美症状性颈动脉内膜切除手术试验(23),欧洲颈动脉手术试验(24),无症状的颈动脉手术试验(25]。伦理委员会IRCCS Azienda Ospedaliera大学联盟圣Martino-IST史重回/ la Ricerca南Cancro在热那亚,意大利,依法批准该协议,执行《赫尔辛基宣言》的指导方针。患者知情同意进入研究之前。东航之前,当天获得的血清样本评估心血管脆弱性的循环标志。药物被发表在表1和2个月没有修改之前报名。排除标准如下:自发脑栓塞术前30分钟或在解剖阶段的操作、恶性高血压、急性冠状动脉疾病、心律失常、充血性心力衰竭(II、III和IV纽约心脏协会类)、肝或肾功能障碍或功能异常、急性和慢性感染性疾病,自身免疫性和风湿性疾病、癌症、内分泌疾病、炎症性肠道疾病和抗炎(除了阿司匹林)药物,口服抗凝治疗(非肝素),激素,细胞因子或生长因子疗法。

2.2。研究端点和功率计算

这项研究的主要终点是确定intraplaque CRP水平是否在东航的时候可以预测的发生钉头槌,定义为致命或非致命的急性冠脉综合征和中风,超过18个月的随访期间。第二端点是在确定潜在的c反应蛋白和炎症参数之间的相关性,在血清和颈动脉斑块内。两个独立的调查人员被蒙蔽的生化和组织学分析研究裁决端点。检查访问期间获得信息在18个月后CEA和进一步证实了通过检查病人的医疗文件。所有端点计算基于数据可供217名患者的颈动脉斑块。

样本大小的计算是基于之前的研究显示,当地不同患者的CRP水平的稳定和脆弱的颈动脉粥样硬化斑块(15]。根据我们的力量计算logrank测试,最小样本量要求检测权杖的风险(增加四倍21)与80%的力量和一个双边α误差5%的138名患者。

2.3。检测生化和炎症生物标记

常规自动分析器被用来测定血液参数和血液化学,包括总胆固醇、低高密度脂蛋白胆固醇,甘油三酯,纤维蛋白原和glycaemia。血清CRP水平和白介素- 6 (IL)比色测定的酶联免疫吸附试验(ELISA)后,制造商的指令(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。检测的极限是31.25 pg / mL CRP和il - 6的0.156 pg / mL。意味着内部和interassay变异系数< 8%为所有标记用ELISA。

2.4。颈动脉斑块处理

手术切除后几分钟内,颈内动脉斑块标本被在4°C到实验室进行处理(20.,22]。动脉粥样硬化斑块都通过的削减垂直于长轴最大狭窄获得上游和下游部分。每个部分是进一步划分中间垂直于长轴在两个子分段。一半是snap-frozen在液氮和存储−80°C (mRNA隔离),而另一半是冻结在cryoembedding介质(10月)组织学分析。

2.5。油红O和小天狼星红染色在颈动脉斑块

每个部分冻结组织学分为8个部分,在一个时间间隔为105μm互相,沾油红O或天狼星红,如前所述[20.,22]。光学显微镜下拍摄的部分为了评估总胶原蛋白含量和偏光显微镜下。间质胶原蛋白亚型进行评估使用偏振光照明;在这种条件下厚I型胶原纤维出现橙色或红色,而薄III型胶原纤维是黄色或绿色。总、I型和III型胶原含量被MetaMorph量化™6软件。结果病变总面积染色面积的百分比。

2.6。Immmunostaining动脉内膜切除术标本

对于每个部分,八个部分削减为105μm互相间隔是固定在丙酮在室温和应用与特定的抗体。主要抗体,如反平滑肌肌动蛋白(平滑肌细胞(SMC);稀释:1:100;斯特鲁普Dako公司、丹麦),反CD66b(中性粒细胞;稀释:1:50;贝克曼库尔特尼翁,瑞士)和反c反应蛋白(稀释:1/100;Sigma-Aldrich,圣路易斯,MI)。检测巨噬细胞中,我们使用反CD68(总巨噬细胞的标记;稀释:1:100;Dako公司(CA),反CD86 (M1巨噬细胞的标记; dilution: 1 : 100; GeneTex Inc., Irvine, CA), anti-human HLA-DR (marker of M1 macrophages; dilution: 1 : 100; Dako Corporation), and anti-human CD163 (marker of M2 macrophages; dilution: 1 : 50; AbD Serotec, Oxford, UK) [26]。使用MetaMorph 6软件进行了量化。数据提出了染色面积的百分比总损伤面积。

2.7。实时逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)

总mRNA孤立与Tri-Reagent (MRC Inc .)的上游和下游部分颈动脉斑块。逆转录执行使用ImProm-II逆转录系统(美国WI Promega,麦迪逊)根据制造商的指示。rt - pcr (StepOne加上,应用生物系统公司,促进城市、钙、美国)进行了与ABsoluteTM QPCR混合(ABgene,埃,英国)。特定的引物和探针用来确定CRP的mRNA表达和RPS13(管家基因)27]:c反应蛋白,5′-GCTTTTGGCCAGACAGACA-3′;CRP反向5′-CGGTGCTTTGAGGGATACA-3′;CRP Taqman探针5′-CGAGGAAGGCTTTTGTGTTTCCC-3′;RPS13向前,5′-CGTCCCCACTTGGTTGAAG-3′;RPS13反向5′-CCGATCTGTGAAGGAGTAAGG-3′;和RPS13 Taqman探针5′-FAM-ACATCTGACGACGTGAAGGAGCAGATT-BHQ1-3′。的褶皱变化mRNA水平计算比较方法。测量价值观第一正常化RPS13内部控制,通过计算三角洲()。这是通过减去RPS13值感兴趣的基因价值。δδ()计算减去指定基线组研究小组的价值值。的当时预计相对褶皱变化用以下公式:。

2.8。统计分析

与IBM SPSS统计分析对于Windows,版本23.0 (IBM有限公司位于纽约阿蒙克市)和MedCalc 12.5 (MedCalc软件,奥斯坦德,比利时)。在临床研究中,提出了分类数据的相对和绝对频率,而连续变量表示为中位数和四分位范围(差)。组间比较确切概率法和Mann-Whitney测试,适当的。中斯皮尔曼相关系数进行了血清和intraplaque生物标志物之间建立相关性的上游和下游部分颈动脉斑块。CRP的预后能力评估的基础上,接收器算子特征(ROC)曲线,使用MedCalc 12.5 (MedCalc软件,奥斯坦德,比利时)。曲线下的面积(AUC)给出了95%可信区间(CI)和c反应蛋白的分界点是依照Youden最大化灵敏度计算的指数。kaplan meier与logrank测试进行生存分析,估计累积事件率在18个月后CEA和计算相应的风险差异根据c反应蛋白。最后,CRP的影响表现在梅斯风险估计通过Cox比例风险模型,并表示风险比率(人力资源)和95%可信区间。在多变量模型中,我们调整了年龄,男性性别、血清hs-CRP水平,他汀类药物使用。所有统计分析一个双边值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。病人的特点

队列中列出的临床和实验室特征表1和2,分别。病人的平均年龄是72岁,男性(62.7%)和高血压患病率和dyslipidemic病人(72.4%和57.6%,分别地。)(表1)。的中值价值总白细胞(WBC)是7.10×10⁹/ L,而血清hs-CRP的中位数是2.38毫克/毫升,表明低度系统性炎症(表2)。

3.2。Intraplaque但不是系统性的CRP水平与炎症在动脉粥样硬化斑块的参数

颈动脉斑块的下游部分的特点是增加中性粒细胞和巨噬细胞M1 (CD86 +细胞)上游地区相比(表的内容3)。颈动脉斑块的上游部分有显著较高的胶原蛋白(总、I型和类型III),平滑肌细胞(SMC), M2巨噬细胞相比,下游部分(表子集3)。c反应蛋白表达在颈动脉样本信使rna和蛋白质水平表明intraplaque CRP含量是在蛋白质水平检测所有样品的上游和下游部分颈动脉斑块(图1)。疲弱的增长intraplaque CRP水平在上游与下游部分是不重要的()(表3;图1)。相反,intraplaque c反应蛋白mRNA几乎检测不到(上游斑块:探测(即。在rt - pcr), < 40周期29总额的217名患者;下游斑块:检测在29日总量的217例;数据未显示)。

在上游部分,intraplaque CRP是直接与中性粒细胞(;),总巨噬细胞(;)和M1子集(HLA-DR +细胞,;),而这是与SMC(负相关;)(表4)。直接在下游部分,intraplaque CRP与M1 (CD86 +,;;HLA-DR +细胞,;)和M2巨噬细胞子集(CD163 +,,)(表4)。之间不存在相关性血清hs-CRP和intraplaque参数的脆弱性,在上游和下游部分颈动脉斑块(表5)。

3.3。颈动脉斑块的下游部分的CRP水平预测未来的钉头槌

ROC曲线分析表明,上游(图c反应蛋白含量2(一个)),但不是在下游(图2 (b))部分颈动脉斑块的重要预后预测准确性钉头槌(AUC 0.700 (95% CI 0.623 - -0.770);)。按照Youden指数,一个上游intraplaque CRP含量的2.9%被认定为最好的分界点,拥有一个敏感性为62.5%,特异性为78.4%(图2(一个))。后将上游斑块划分为低(≤2.9%)、高(> 2.9%)c反应蛋白组,kaplan meier分析表明高intraplaque患者CRP有钉头槌率大于患者CRP水平低(图3)。8的狼牙棒观察18个月的随访期间,5组中发生高CRP水平和3 c反应蛋白低组。Cox比例风险回归分析证实了上述结果。钉头槌的风险增加与CRP intraplaque含量增加斑块的上游部分(HR 6.22 (95% CI 1.49 - -26.05);)(表6)。这些结果也为年龄调整后仍具有统计学意义,男性性别,hs-CRP,他汀类药物使用(HR 8.57 (95% CI 1.89 - -38.77);)(表6)。

4所示。讨论

这项研究表明,intraplaque但不是系统性的CRP水平与不同的炎症斑块易损性参数相关联,特别是关于颈动脉斑块的上游部分。这些发现可能显然与之前的研究相比证明血清CRP水平与斑块易损性参数[呈正相关28- - - - - -30.]。另一方面,CRP已经证明人类冠状动脉早期动脉粥样硬化斑块内定位(31日]。proatherosclerotic角色推定为“本地”CRP存款积极贡献intraplaque炎症通过招募单核细胞/巨噬细胞,促进泡沫细胞形成和诱导补体激活(32- - - - - -35]。Devaraj和Jialal演示了一个关键活动的c反应蛋白在人类单核细胞分化向偏振促炎M1巨噬细胞表型(通过NFκFc - b和绑定γ受体CD32和CD64)和抑制M2巨噬细胞(36]。intraplaque CRP的病理生理意义是进一步支持其积极的协会CAD患者的临床不稳定(18,37]。考虑动脉粥样硬化斑块的异质性,我们研究的主要新奇的演示intraplaque CRP水平差异可以与斑块易损性参数,根据斑块的位置。特别是,CRP水平在斑块部分位于上游的狭窄与漏洞参数(即呈正相关。巨噬细胞、中性粒细胞和促炎M1)和负相关保护介质(如SMC)。不同于威尔逊和同事(38),我们无法显示intraplaque c反应蛋白的蛋白质之间的正相关和mRNA水平。事实上,c反应蛋白是只有少数样本中检测到缺少相关的信使rna降解。这些结果部分与假设intraplaque细胞(血管或炎症)可以表达和释放c反应蛋白(39]。考虑到适度intraplaque中的CRP检测到几乎所有的颈动脉斑块样本,我们可以假设c反应蛋白浸润subintimal地区通过血液(40]。我们已经在2008年推测血管CRP(局部动脉粥样硬化斑块内)作为一个有前途的CV风险因素可能发挥积极proatherosclerotic“intraplaque”作用。这些属性的intraplaque CRP可能代表一个有趣的问题可能解释为什么血清CRP水平与心血管风险没有关系在一些临床文章(9]。到目前为止,没有明确的分子和细胞机制的证据intraplaque CRP渗透与生产已经产生。c反应蛋白在动脉粥样硬化小鼠模型的边际作用没有帮助提高知识。考虑到这些限制,也证实了先前的结果(41,42),我们观察研究只支持CRP intraplaque内容作为促炎介质在人类动脉粥样化形成,没有澄清机械的见解。

另一方面,我们无法找到任何intraplaque血清CRP浓度与参数的脆弱性。hs-CRP水平曾被证明与atherothrombotic有关冠状动脉斑块(43]。此外,临床试验的结果表明血清hs-CRP作为一个可靠的参数监视他汀类药物治疗的疗效患者st段抬高心肌梗死(44]。最后,一些积极的协会之间的颈动脉斑块炎症/脆弱性和循环炎症生物标记(即。、c反应蛋白、肿瘤坏死因子-α和il - 6)已经被描述(45,46]。在与后者的研究中,我们发现在系统性CRP令人惊讶,他们证实Grufman及其同事的研究显示无显著关联等离子hs-CRP和intraplaque细胞因子水平47]。

我们研究的另一个相关的发现是简历CRP水平的预测价值在颈动脉斑块的上游部分。CRP含量大于2.9%是与钉头槌的概率增加了六倍,单变量和多变量分析。此外,上游CRP含量预测钉头槌独立于年龄、男性性别,hs-CRP,他汀类药物使用。在我们所知,这是第一次intraplaque但不是循环CRP水平有紧密的关联狼牙棒在一群严重颈动脉狭窄患者。

这项研究有一些局限性。首先,相对小样本大小()和一个中心的参与有限泛化的结果。我们希望将我们的数据与其他颈动脉斑块生物银行,但迄今未能找出任何与组织用于蛋白质和mRNA分析。此外,正如前面所承认的那样,我们没有能够识别的精确机制CRP在斑块沉积。

总之,CRP在颈动脉斑块染色在蛋白质水平尽管几乎无法觉察的mRNA水平。Intraplaque CRP与参数直接相关的漏洞(例如巨噬细胞M1子集)。高c反应蛋白水平(> 2.9%)在动脉粥样硬化斑块的上游部分可以预测钉头槌在18个月的随访。相反,血清hs-CRP水平与intraplaque相关参数的脆弱性和关联的狼牙棒。我们的结果,即使初步,表明intraplaque而不是系统性CRP可能proatherosclerotic因素可能有助于更好地评估心血管危险因素的病人患有严重的颈动脉动脉粥样硬化。还需要进一步的研究来验证intraplaque CRP作为亚临床动脉粥样硬化疾病的可靠标志。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是由欧洲委员会的资助(FP7-INNOVATION我健康- f2 - 2013 - 602114;Athero-B-Cell:针对和利用B细胞功能治疗心血管疾病)和瑞士国家科学基金会的资助博士f . Montecucco(没有。310030 _152639/1)和n . Vuilleumier博士(没有。310030 _140736)。特别感激表达Aliki Buhayer(棱镜科学Sarl)医学写作的支持。