文摘
槲寄生桑寄生被用作传统医学复合东北亚地区很长一段时间,具有神经保护作用。尽管如此,的影响桑寄生在过敏反应仍然是未知的。在目前的研究中,我们评估是否的水提取物桑寄生(简述)可以抑制ige过敏反应RBL-2H3细胞。简述抑制释放β己糖胺酶(集成电路50,184.5μg / mL)和肿瘤坏死因子的形成α(集成电路50,84.27μg / mL), interleukin-4 (IC50,93.43μg / mL),前列腺素E2(集成电路50,84.10μg / mL),前列腺素D2和白三烯C4(集成电路50,43.27μg / mL)浓度的方式。此外,麦克米兰LPE抑制磷酸化,PLCγ1/2,PKCδ物,ERK p38和Akt。在后期阶段,简述5-lipoxygenase磷酸化和cox - 2表达但不是cPLA下降2磷酸化。另外,液相外延包括总酚类化合物(10.72毫克/克干重)和总类黄酮(56.20毫克/克干重)。这些结果表明,酚类化合物和黄酮类化合物中包含LPE可能与抗过敏药有关的活动。LPE的酚类化合物和黄酮类抗过敏药植物化学物质能够抑制Fc的激活ε国际扶轮在肥大细胞信号级联。这种效应可能为植物学期刊的发展提供进一步的信息过敏性疾病。
1。介绍
槲寄生,半寄生植物,广泛分布在世界各地,并被用作组成的传统医学东北亚地区几个世纪以来[1]。五种槲寄生在韩国广泛分布。槲寄生专辑l,known as European mistletoe, and桑寄生被称为桑槲寄生,主要用于传统医学在大韩民国(2]。槲寄生拥有各种有利影响,如抗癌、典型药物、神经保护、抗氧化和抗炎活动(3]。的提取槲寄生专辑l,known as Iscador, has been used in anticancer therapy in Europe because it possesses strong anticancer action [4]。这种槲寄生的影响与各种生物活性化合物,包括凝集素、viscotoxins、三萜、倍半萜烯内酯,黄酮类化合物,酚类化合物(5]。尽管如此,生物的影响桑寄生还不知道除了其神经保护作用[6]。
过敏性休克是我过敏,一种是与急性炎症密切相关7]。脱粒的炎症反应与免疫球蛋白E - (IgE)敏化肥大细胞或嗜碱细胞(8]。这些细胞表达足球俱乐部ε国际扶轮的高亲和性IgE受体称为受体位于质膜(8]。IgE-sensitized肥大细胞是由抗原刺激时,细胞释放多种炎症介质,包括肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-4 (il - 4)、前列腺素E2(铂族元素2)、前列腺素D2(PGD2),白三烯C4(LTC4),β己糖胺酶,脱粒的生物标志物,通过激活的Fcε国际扶轮信号级联(8- - - - - -10]。此外,PGD2和LTC4参与慢性炎症在哮喘或过敏性鼻炎11,12]。因此,过敏性休克临床是很重要的。
在这项研究中,我们发现提取的桑寄生(简述)具有抗过敏药活动ige过敏反应在肥大细胞和演示LPE抑制过敏反应在上面的细胞。总之,结果可能会提供进一步的信息发展的变应性疾病的植物学期刊。
2。材料和方法
2.1。试剂
MEM -α中,1 x DPBS,胎牛血清的边后卫,青霉素,链霉素从通用电气医疗集团生命科学(Hyclone购买™美国洛根,UT)。从DAEILLAB EZ-Cytox细胞生存能力分析工具得到服务有限公司(韩国首尔)。特定的抗体phospho-protein激酶B(一种蛋白激酶;# 9271),phospho-cytosolic磷脂酶A2(cPLA2;# 2831),phospho-extracellular signal-regulated激酶1/2 (ERK;# 9101),phospho-c-JunN终端激酶1/2(物;# 9251),phospho-Src家族蛋白激酶(Lyn;# 2731),phospho-p38 (# 9211), phospho-protein激酶Cδ(PKCδ;# 2055),phospho-phospholipase Cγ1/2 (PLC)γ1/2;# 2821,# 3871,职责),和phospho-spleen酪氨酸激酶(麦克米兰;# 2710)和cyclooxygenase-2 (cox - 2;# 4842)从细胞信号技术,获得公司(美国贝弗利,MA)。特定的抗体phospho-feline yes-related蛋白质(菲英岛;orb128087)和β肌动蛋白(sc - 47778)获得Biorbyt有限公司(英国剑桥)和圣克鲁斯生物技术有限公司(美国达拉斯,TX),分别。一个特定的抗体5-lipoxygenase (5-LO;10007820)和LTC EIA试剂盒4,PGD2和铂族元素2从开曼群岛获得化工有限公司(安阿伯市,美国)。对il - 4和TNF - ELISA试剂盒α从e-Bioscience购买,Inc .(美国圣地亚哥科学中心驱动)。Dinitrophenyl-human血清白蛋白(DNP-HSA)、DNP-IgE Folin-Ciocalteu试剂、咖啡酸、二甘醇,槲皮素,4-nitrophenylN乙酰-β- - - - - -D-glucosaminide (p-NAG)从Sigma-Aldrich有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。所有其他的化学物质在这项研究中均为分析纯。
2.2。的制备桑寄生提取
简述了根据此前报告的修改过程13];桑寄生从Yeongcheon获得东方草药市场(Yeongcheon、韩国),然后被Ki-Hwan Bae博士名誉教授药学院,忠南国立大学(大田、韩国)。桑寄生(1公斤)在蒸馏水(10升)煮大约3 h 115°C。通过测试筛过滤过的水提物(孔径500μ米和150μ米),过滤提取过滤是60μ米尼龙网过滤器(美国微孔,MA)和沉积过夜。上层清液冻干,然后干颗粒是储存在−20°C到使用。LPE的粉末溶解在10%二甲基亚砜(DMSO)解决方案的实验。
2.3。测定总酚和类黄酮化合物
总酚类化合物和黄酮类化合物含量的液相外延进行评估后之前报道的方法(14]。简述粉末溶解使用20毫米PBS缓冲(pH值7.4)最后一个100毫克/毫升的浓度。(0.33毫升)的解决方案是混合2.5毫升蒸馏水,然后孵化为0.16毫升Folin-Ciocalteu试剂5分钟。上面的解决方案是进一步孵化30分钟在黑暗中治疗后10%碳酸氢钠溶液(0.3毫升)。760纳米的吸光度测量使用标(SpectraMax i3、分子器件、钙、美国)。一个标准曲线准备表达结果咖啡酸的等价物。另外,确定数量的总类黄酮LPE, 0.4毫升的LPE添加到4毫升90%二甘醇含0.4毫升1 N氢氧化钠,然后混合孵化1 h。在420纳米溶液的吸光度测量使用标。一个标准曲线准备结果表示为槲皮素的等价物。
2.4。细胞培养
RBL-2H3细胞,肥大细胞线来自老鼠嗜碱性的白血病(15),在MEM -培养α中包括10%的边后卫和抗生素青霉素(100 U /毫升和100年µg / mL链霉素)在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。包含所有的实验对照组作为车辆包含0.1% DMSO组。
2.5。细胞生存能力分析
细胞生存能力评估通过测量从WST-1 mitochondrial-dependent转换到水溶性四唑盐(16]。总之,RBL-2H3细胞被播种在96孔板(1×104细胞/ MEM) - - -α中含有10%的边后卫在一夜之间37°C。上述细胞被洗1 x DPBS然后用50 ng / mL DNP-IgE孵化。24小时后,IgE-sensitized细胞preincubated LPE(0到400μ在MEM - g / mL)α中有1%的边后卫1 h,同时混合着0.1μ克/毫升DNP-HSA和10μL EZ-Cytox试剂,然后进一步孵化4 h。以上细胞的细胞生存能力是由一个微型板块读者(450海里)。
2.6。β己糖胺酶活力测定
β己糖胺酶活力测定后进行之前报道的方法(17]。上层清液(25μL)添加到50μ在0.1 L p-NAG(10毫米)柠檬酸钠缓冲(pH值4.5),然后孵化1 h在37°C。反应完成了0.1碳酸钠缓冲区(pH值10.0)。吸光度测量在使用标405海里。
2.7。酶联免疫吸附试验对il - 4和TNF -α
确定数量的TNF -α或在媒体培养il - 4, IgE-sensitized细胞preincubated LPE MEM -α中有1%的边后卫1 h,然后刺激DNP-HSA 4 h。所有的媒体是离心机(17000×g) 10分钟在4°C,然后样本存储在−80°C到使用。il - 4和肿瘤坏死因子-α被评估ELISA包根据制造商的指示。
2.8。LTC的酶免疫分析法分析4,PGD2和铂族元素2
测量PGD的水平2,铂族元素2,或者LTC4在培养媒体,所有样本离心机和储存在−80°C到使用。LTC4,PGD2和铂族元素2和测量环境影响评价工具根据制造商的指示。
2.9。免疫印迹分析
免疫印迹分析确定使用前面的方法(17]。涂抹膜使用ECL +可视化工具包作为化学发光试剂(Bio-Rad、大力神、钙、美国),一个成像系统(ChemiDoc触摸成像系统,Bio-Rad,大力神,CA,美国)。密度水平的目标蛋白质由蛋白质标准尺寸标记(BIOFACT、大田、韩国)相比的加载控制(β肌动蛋白)。靶蛋白带的密度测量使用ImageJ软件(版本1.49 v为Windows,国家卫生研究院,美国)。
2.10。统计分析
所有的实验结果被报道为±SD方法。单向方差分析(方差分析)是用于多重比较(GraphPad Prism 5.03版Windows,圣地亚哥,美国)。如果治疗组之间有显著差异,Dunnett测试应用。差异和被认为具有统计显著性水平。
3所示。结果
3.1。总酚类化合物和黄酮类的概要简述
首先,我们调查了液相外延是否包括酚类化合物和黄酮类化合物,因为这些化合物从各种榭寄生是具有各种有益的作用,如抗氧化剂,神经保护,和抗癌效果3]。简述中总酚类化合物(10.72±0.06毫克/克干重,三重决定)的平均数±标准差值和总类黄酮(56.20±0.40毫克/克干重,三重的平均数±标准差值决定)。这些结果表明,液相外延含有酚类化合物和黄酮类化合物可能的有益的行为密切相关桑寄生。
3.2。RBL-2H3细胞抑制作用的LPE ige脱粒
因为我们发现,液相外延包括总酚类化合物和黄酮类化合物,我们调查是否LPE可以抑制IgE-activated肥大细胞脱粒。当IgE-sensitized RBL-2H3细胞与不同浓度的LPE preincubated(0到400μg / mL)前(0.1抗原的挑战μg / mL DNP-HSA),简述抑制释放β己糖胺酶、脱粒的常见生物标志物浓度的方式集成电路50值为184.5μ克/毫升(图1(一))。此外,400年μg / mL LPE显著抑制ige脱粒类似级别的控制没有明显的细胞毒性(图1 (b))。因此,这些结果表明,液相外延具有抗过敏药活动noncytotoxic浓度通过抑制IgE-activated肥大细胞脱粒。
(一)
(b)
3.3。抑制促炎介质LPE对生产的影响
促炎介质被释放从颗粒IgE-activated肥大细胞与抗原刺激后9,18]。此外,介质与变应性疾病的进展密切相关,如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎(8- - - - - -10,18]。因此,我们调查的影响LPE的促炎细胞因子的生产,如肿瘤坏死因子-α和il - 4、二十烷类,如铂族元素2,PGD2和LTC4。当IgE-sensitized RBL-2H3细胞与LPE preincubated抗原挑战之前,简述显著抑制肿瘤坏死因子-的形成α(集成电路50,84.27μg / mL,图2(一个))、il - 4 (IC50,93.43μg / mL,图2 (b))和LTC4(集成电路50,43.27μg / mL,图3 (b))。此外,简述抑制铂族元素的生物合成2(集成电路50,84.10μg / mL,图3(一个))和PGD2(图3 (c))剂量依赖性的方式到200μ400克/毫升,而μg / mL LPE逐渐增加了铂族元素的水平2和PGD2。看来LPE的影响在400年μg / mL可能导致激活活动或/和铂族元素的表达2和PGD2合成酶。因此,还需要进一步的研究来开发LPE的植物学期刊过敏治疗。总的来说,这些发现表明,简述抑制过敏性炎症介质的形成,包括促炎细胞因子和二十烷类,但展品轻微副作用PGD的形成2和铂族元素2在高浓度(400μg / mL)。因此,简述可能阻止急性或慢性炎症引起的过敏性炎症介质在过敏性疾病。
(一)
(b)
(一)
(b)
(c)
3.4。监管LPE类二十烷酸酶的生物合成的影响
接下来,我们评估的影响,简述酶负责类花生酸的生物合成,如铂族元素2,PGD2和LTC4在变应性疾病[诱导慢性炎症10,19,20.]。为了解决这个问题,我们检查了LPE cPLA的磷酸化的影响2花生四烯酸的病原反应酶级联,5-LO,白三烯生物合成的速率决定酶和cox - 2的表达,速率控制前列腺素生物合成的酶。如图4,当IgE-sensitized RBL-2H3细胞与不同浓度的LPE preincubated 4 h抗原暴露之前,简述抑制磷酸化5-LO和cox - 2的表达,但不是cPLA的磷酸化2。这些结果表明,液相外延抑制类花生酸的生物合成,包括铂族元素2,PGD2和LTC4通过5-LO的规定和cox - 2激活在前列腺素和白三烯生物合成,分别。
3.5。监管LPE的激活Fc的效果ε国际扶轮信号级联
最后,因为LPE抑制病原反应酶参与前列腺素和白三烯生物合成后期阶段(4小时),我们进一步研究了病原和中间蛋白质与Fcε国际扶轮信号级联的早期阶段(10分钟),因为类二十烷酸生物合成的激活与Fcε国际扶轮在IgE-activated肥大细胞信号级联17,21]。如图5(一个),当IgE-sensitized RBL-2H3细胞preincubated LPE被抗原激活10分钟,简述麦克米兰的磷酸化水平降低而不是菲英岛和林恩,最初的蛋白质在Fcε国际扶轮信号级联。此外,简述显著抑制磷酸化水平的PLCγ1/2和PKCδ相关,脱粒过程(图5 (b)),ERK的磷酸化水平降低,物,p38和Akt相关的促炎细胞因子的表达(图5 (c))。这些结果表明,液相外延可以阻止Fc的激活ε国际扶轮信号级联通过抑制麦克米兰在IgE-activated肥大细胞的活性。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
的作用桑寄生过敏反应是未知的,尽管它有一些好处(3]。因此,目前的研究表明桑寄生有抗过敏药IgE-activated肥大细胞基于属性在体外测试。此外,这样的影响桑寄生是由总酚类化合物或/和类黄酮,因为三萜、倍半萜烯内酯,或类黄酮来源于桑寄生与许多有益的影响(3]。酚类化合物和黄酮类减弱过敏反应IgE-activated肥大细胞(14,17]。然而,组件的影响桑寄生在过敏反应尚未报道。
LPE的抗过敏药活动一个可能的机制可能与直接抑制活化的Fcε国际扶轮信号级联IgE-activated肥大细胞由于IgE-activated肥大细胞的脱颗粒起始与Fc的激活密切相关ε国际扶轮受体位于细胞的质膜(7,8]。因此,IgE-activated肥大细胞释放多种炎症介质,如il - 4、TNF -α、组胺、前列腺素和白细胞三烯(9,10,18,19]。支持这一点,在我们的研究中,当IgE-sensitized肥大细胞与LPE preincubated抗原挑战之前,简述降低il - 4, TNF -α,PGD2,铂族元素2和LTC4生产。此外,麦克米兰的LPE抑制激活病原中间Fc的蛋白质ε国际扶轮信号级联(8]。此外,简述也抑制活化的PLCγ1/2-PKCδ相关通路,脱粒过程(8),和一种蛋白激酶,p38、ERK和物与细胞因子表达(8),在IgE-activated肥大细胞。因此,激活的PLCγ1/2-PKCδ途径和中间蛋白质直接与Fc的激活有关ε国际扶轮信号级联。综上所述,LPE的抗过敏药作用与抑制麦克米兰激活密切相关的俱乐部ε国际扶轮信号级联。因此,简述可能直接调节激活Fcε国际扶轮信号级联通过抑制麦克米兰在IgE-activated肥大细胞激活。
LPE的抗过敏药活动的另一个可能的机制可能与抑制花生四烯酸在IgE-activated级联激活肥大细胞因为上述细胞可以产生多种促炎脂质介质,如LTC4,PGD2和铂族元素2(8- - - - - -10),并释放他们从众多的颗粒11,12]。此外,这些脂质介质导致过敏性慢性炎症疾病,如哮喘和过敏性鼻炎7,10]。因此,类二十烷酸形成的监管是LPE的抗过敏药性能的另一个重要因素。一致,简述减少铂族元素的生物合成2,PGD2和LTC4病原反应酶和抑制cox - 2的表达,前列腺素生物合成(17),和初始酶激活5-LO白三烯生物合成(17),在IgE-activated肥大细胞。这些发现表明,简述抑制病原反应酶通过监管类花生酸的形成,cox - 2和5-LO等。此外,简述可能调节其他与类二十烷酸生物合成相关的酶cPLA除外2。这样LPE的影响可能导致过敏反应的增强其抗过敏药的属性。
5。结论
在这项研究中,我们发现,第一次,一本小说角色LPE的ige过敏反应。我们发现,简述在IgE-activated肥大细胞有抗过敏药功效,含有大量的总酚类化合物和黄酮类化合物可能为抗过敏药的行为负责。其抗过敏药属性包括各种目标的机制,比如麦克米兰,Akt,兵,物,p38、PLCγ1/2,PKCδ、5-LO和cox - 2。简述可用于开发功能性食品或植物学期刊减轻过敏性疾病。此外,有必要确定的活性化合物桑寄生具有抗过敏药行动。
缩写
| 5-LO: | 5-Lipoxygenase |
| 一种蛋白激酶: | 蛋白激酶B |
| cox - 2: | Cyclooxygenase-2 |
| cPLA2: | 胞质磷脂酶一2 |
| 兵: | 细胞外signal-regulated激酶1/2 |
| 菲英岛: | 猫yes-related蛋白质 |
| 保险公司: | 人血清白蛋白 |
| IgE: | 免疫球蛋白E |
| il - 4: | Interleukin-4 |
| 物: | c-JunN终端激酶1/2 |
| 简述: | 提取的桑寄生 |
| LTC4: | 白三烯C4 |
| 林恩: | Src家族蛋白激酶 |
| 铂族元素2: | 前列腺素E2 |
| PGD2: | 前列腺素D2 |
| PKCδ: | 蛋白激酶Cδ |
| PLC)γ: | 磷脂酶Cγ |
| 麦克米兰: | 脾酪氨酸激酶 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子-α。 |
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是由格兰特K16281从东方医学研究所、教育部、科学技术(最高明的),韩国。