文摘

2型糖尿病(T2DM)病人体内和冠状动脉疾病(CAD)都具有慢性低度炎症。Th17及其相关细胞因子的作用在2型糖尿病和CAD尚不清楚。在这里,我们调查的血清水平五Th17-related细胞因子(il - 22生成,IL-17 MIP-3α、IL-9 IL-27)在2型糖尿病,CAD, T2DM-CAD合并症的病人。il - 22生成时被发现在所有三个条件升高。升高血清il - 22生成是独立与二型糖尿病的发病率和CAD。相反,il - 22生成时被发现保护内皮细胞葡萄糖和lysophosphatidylcholine (LPC)诱导损伤,内皮细胞和IL-22R1表达是治疗高葡萄糖和LPC的增加。阻塞的IL-22R1 IL-22R1抗体减少il - 22生成的保护作用。我们的研究结果表明,il - 22生成函数作为一把双刃剑在2型糖尿病和CAD和il - 22生成可用于治疗慢性炎症性疾病,如2型糖尿病和CAD。

1。介绍

2型糖尿病(T2DM)病人体内和冠状动脉疾病(CAD)是全球发病率的主要原因。2型糖尿病和CAD代谢疾病和共同危险因素如肥胖、高血压和血脂异常(1]。除了传统的风险因素,慢性低度炎症现在已经成为一个主要的触发这两个条件(2]。积累的证据表明,多种类型的免疫细胞参与2型糖尿病和CAD发病机理3]。近年来,CAD和适应性免疫参与2型糖尿病问题受到越来越多的重视。激活适应性免疫主管细胞在动脉粥样硬化病变(4,5]。激活CD4的存在⁺在脂肪组织也表明T细胞免疫参与2型糖尿病(6]。

作为一个新CD4特点⁺t细胞亚型,Th17细胞也被证明参与动脉粥样硬化和2型糖尿病的发病机制。Th17细胞积聚在小鼠和人类没有观察到动脉粥样硬化病变,也暗示导致炎症和高血糖的2型糖尿病患者(7- - - - - -9]。Th17细胞产生一系列细胞因子如IL-17和il - 22生成并受多种细胞因子。IL-17,签名Th17细胞因子,据报道与稳定斑块表型和斑块不稳定性在不同试验(10,11]。il - 22生成时,另一个由Th17细胞因子分泌,减轻代谢紊乱在一项研究中被发现。相反的,在其他的研究中,发现il - 22生成加重2型糖尿病条件(12,13]。MIP-3α(也称为CCL20)配体CCR6,扮演着一个重要的角色在迁移Th17细胞发炎的网站(14]。IL-9诱发Th17细胞分化和提高IL-17A生产人工培养的外周血单核细胞或CD4细胞⁺T细胞(15]。IL-27诱发p-STAT3促进Th17分化没有STAT1 [16]。这些Th17监管机构也发挥他们的角色在2型糖尿病和CAD,尽管相关临床研究很少(14,17- - - - - -19]。

在目前的研究中,我们评估的血清水平Th17-related细胞因子(il - 22生成,IL-17 MIP-3α,在immunogenesis IL-9和IL-27)。在这些细胞因子,il - 22生成时被发现在CAD升高,通络,T2DM-CAD合并症的病人。此外,il - 22生成了与2型糖尿病和CAD的发病率。有趣的是,我们进一步建立IL-22-IL-22R1在内皮细胞的保护作用lysophosphatidylcholine (LPC)和高葡萄糖条件。我们的研究表明,il - 22生成可能扮演不同的角色在不同的上下文,表明il - 22生成可用于免疫治疗慢性炎症性疾病,如2型糖尿病和CAD。

2。材料和方法

2.1。研究人群

机构审查委员会批准的这项研究是南京医科大学。从每个病人得到书面同意。五百和15个患者招募了来自南京医科大学第二附属医院从2012年到2015年。最初,我们全面分析包括78人五Th17-related细胞因子(批1)。然后,437人il - 22生成分析包括(批处理2)。在每一批患者分成四组:(1)正常健康志愿者(批1;批处理2,);(2)患者2型糖尿病(批1;批处理2,);(3)CAD患者(批1;批处理2,);(4)CAD和2型糖尿病患者合并症(批1;批处理2,)。

CAD-group病人被诊断的基础上,冠状动脉造影的结果,和至少一个患者冠状动脉狭窄> 50%的腔的直径是包括在内。此外,稳定心绞痛(SA)小组包括典型努力心绞痛患者,是伴随着一个向下或水平st段萧条> 1毫米在锻炼测试;不稳定性心绞痛(UA)小组包括胸痛患者表现出静止,与明确的st段变化和/或让反演;急性心肌梗死(AMI)组包括患者表现出明显的肌酸激酶MB和心肌肌钙蛋白水平升高我以及典型的临床心电图表现。CAD组包括患者的空腹血糖水平正常,没有历史的降糖治疗。二型糖尿病的诊断结果是基于口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和医疗历史;冠状动脉血管造影检查是正常的。对照组招募按照下列标准:无糖尿病史,正常糖耐量的OGTT,正常的冠状动脉血管造影检查。

周围性血管疾病患者,血栓性中风,肾病,视网膜病变,炎性疾病的原因,其他系统性和代谢疾病、哮喘、恶性肿瘤、肝脏疾病、肾脏疾病、怀孕妇女被排除在研究之外。

2.2。细胞因子定量分析

血清是通过离心分离和储存在−80°C细胞因子水平的测定。蛋白表达(IL-17 il - 22生成时,MIP-3α、IL-9 IL-27)测量使用磁珠工具包基于Luminex®技术。短暂,捕获抗体(微孔)共轭Luminex珠子。检测抗体(微孔)共轭微孔提供的生物素通过定制服务。血清稀释了同等体积的MILLIPLEX®地图细胞分析缓冲区(微孔)。捕获抗体珠子被稀释在25μL MILLIPLEX地图细胞分析缓冲区和添加到磁板(微孔)。然后,25μL的稀释血清被转移到每个的固定板和孵化2 h在室温下用颤抖的。孵化后,珠子是洗两次洗缓冲区,和25μL检测抗体被添加到每个和孵化1 h在室温下用颤抖的。然后,25μL MILLIPLEX地图streptavidin-phycoerythrin(微孔)添加和孵化30分钟在室温下用颤抖的。最后,鞘液添加洗后,信号读取使用Luminex FLEXMAP 3 d™。

2.3。血清il - 22生成酶联免疫吸附试验(ELISA)

包含heparin-anticoagulant外周血收集成管状。血清是通过离心分离和储存在−80°C细胞因子水平的测定。血清il - 22生成水平测定和定量夹心酶免疫测定技术按照制造商的建议(Joyee生物技术,中国)。

2.4。细胞培养

人类脐静脉内皮细胞从美国获得(通过传代形成细胞类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。HUVECs在内皮细胞培养介质(ECM)补充5%胎牛血清,100 U /毫升青霉素和链霉素0.1毫克/毫升(美国从Sciencell)和孵化公司37°C的5%₂/ 95%空气环境。当细胞达到70% - -80%融合,药物治疗之前添加了新媒体。

2.5。细胞刺激与高浓度的葡萄糖,LPC的,或两者的结合

最初的血清和glucose-containing媒体从盘子,和细胞被洗了三次磷酸盐。不同浓度的葡萄糖(5、15、30、60和90毫米)(美国σ)或LPC(5、10、20和40μ美国g / mL)(σ)被添加到培养基表示时报(24或48小时)。调查的影响刺激相结合,细胞被孵化与葡萄糖(30毫米)和LPC (10μg / mL) 48 h。

2.6。细胞生存能力分析

细胞生存能力评估使用CCK-8根据制造商的建议(Kaiji,中国)。CCK-8解决方案(10μL)被添加到每个好,文化是孕育在37°C 1 h。结果表示为可行的细胞的比例相对于对照组后测量吸光度在450海里。每组实验包含6个数据对于每个实验条件,实验重复三次。

2.7。细胞凋亡检测

细胞与依地使胰蛋白酶化无酸的在媒体血清胰蛋白酶然后洗。细胞(1×10⁵100年)被离心收集,resuspendedμ包含5 L 1 x绑定缓冲μL的膜联蛋白V-FITC和5μL (propidium碘(BD生物科学,美国),和孵化在黑暗中在室温下15分钟。细胞凋亡在FACSCanto数据获得™II系统(BD生物科学,美国)并使用FlowJo软件进行了分析。结果从三个独立的实验。

2.8。IL-22R1表达分析

分析IL-22R1的表达,HUVECs沾反IL-22R1 (FAB2770P;研发系统,美国)。非特异性染色是评估使用phycoerythrin-conjugated老鼠免疫球蛋白作为同形像控制(BD生物科学,美国)。数据获得FACSCanto II系统(美国BD生物科学)和使用FlowJo软件进行了分析。结果从三个独立的实验。

2.9。封锁IL-22R1信号

阻止IL-22R1 HUVECs,细胞被孵化与人类IL-22R1抗体(AF2770;研发系统,我们在一个集中的8μg / mL 1 h之前的il - 22生成细胞培养(PeproTech,美国)。

2.10。统计分析

正态分布变量表示为平均值±标准偏差(SD)、非正态的分布变量表示为中位数(25日,第75百分位数),和分类变量表示为数字(%)。正态分布的变量,单向方差分析或Dunnett以及(用于比较两组)被用来比较的情况下。对于非正态的分布的变量,Mann-Whitney测试是用来比较的情况下,克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用来比较的子组。斯皮尔曼相关系数计算为细胞因子水平和不同实验室之间的关联标记。联系临床参数和CAD和2型糖尿病的发病率是首先分析了简单的逻辑回归分析,然后通过多变量分析。优势比(ORs)为这些变量反映每增加一个单位衡量的变化。被认为是显示统计学意义。所有使用SPSS 21.0分析窗口。

3所示。结果

3.1。基线特征

批1患者的临床特点是概述了在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/8254797(文本和表S1)。表1列出的特征批2例。患者2型糖尿病、CAD和T2DM-CAD组比对照组。CAD和T2DM-CAD患者出现高血压和中风的发病率高于个人的控制。更高的空腹血糖、糖化血红蛋白和尿素的水平,并降低HDL水平在2型糖尿病和T2DM-CAD患者观察到相对于对照组。

3.2。il - 22生成水平增加2型糖尿病、CAD和T2DM-CAD合并症的病人

第一批病人,五Th17-related细胞因子进行了分析,和更高水平的il - 22生成观察通络,CAD, T2DM-CAD合并症病人比在控制个体(图1 (b))。然而,没有IL-17差异,IL-9, MIP-3α水平观察在不同群体(数字1(一),1 (c),1 (e))。T2DM-CAD IL-27水平较高的共病组比对照组(图1 (d))。

进一步扩张的样本量进行更全面的分析。在分析第2批,血清il - 22生成水平显著增加了2型糖尿病,CAD, T2DM-CAD合并症组与对照组相比(图2(一个))。没有差别的il - 22生成水平在2型糖尿病和CAD患者之间。T2DM-CAD病人表现出更高水平的il - 22生成与2型糖尿病和CAD组(图2(一个))。

我们的研究结果还表明,il - 22生成水平明显高于AMI患者和UA比控制个人(AMI患者,与控制,,;UA患者,与控制,,;图2 (b))。没有差别的il - 22生成SA)患者和健康人之间的水平()。

表S2显示了斯皮尔曼的il - 22生成与二型糖尿病的风险因素之间的相关性和CAD。il - 22生成与身体质量指数(负相关;)和血清总胆固醇水平(;)与血尿素氮呈正相关(;)。

表2展示了各种临床参数之间的关系(包括il - 22生成水平)和二型糖尿病的发病率,CAD, T2DM-CAD。简单的逻辑回归分析显示年龄(或1.062,95%可信区间1.039到1.086;)、高血压(或1.750,95%可信区间1.122到2.728;)、中风(或2.978,95%可信区间1.591到5.574;)、高密度脂蛋白(HDL);或0.381,95%可信区间0.183到0.790;)、空腹血糖(的边后卫;或1.690,95%可信区间1.372到2.082;)、糖化血红蛋白(或3.505,95%可信区间2.243到5.478;)、尿素(或1.198,95%可信区间1.058到1.355,)、肌酐(或1.018,95%可信区间1.007到1.028,)和il - 22生成(或1.042,95%可信区间1.023到1.062;)与CAD和2型糖尿病的发病率有关。或值与对照组相比。

多元回归分析显示,年龄(或1.082,95% CI 1.048, 1.111;)和的边后卫(或1.637,95%可信区间1.316到2.035;)与CAD和2型糖尿病的发病率显著相关。值得注意的是,il - 22生成仍然显著,独立与CAD和2型糖尿病的发病率(或1.027,95%可信区间1.004到1.050;)。或值与对照组相比。

3.3。LPC和葡萄糖浓度的方式减少HUVECs的细胞生存能力

首先,建立一个合适的实验模型HUVEC损伤诱导的LPC和高浓度的葡萄糖,我们与不同浓度的对待HUVECs LPC(5、10、20和40μg / mL)和葡萄糖(5、15、30、60和90毫米)在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) 24 h和评估细胞利用CCK-8可行性分析。如图3(一个),相对光密度值(OD)的细胞处理5、10、20和40μg / mL LPC的90.25%±5.75%,58.63%±6.86%,31.09%±9.07%,分别和17.75%±4.88%。细胞的可行性HUVECs处理10μg / mL LPC的相对下降到59%的对照组。细胞治疗的相对OD值5、15、30、60和90毫米葡萄糖93.11%±7.84%,92.39%±4.35%,90.22%±4.64%,85.38%±4.17%和75.9%±10.19%,其中HUVECs 30 mM葡萄糖处理显示显著降低细胞生存能力。这些结果表明,10μg / mL LPC的和30 mM葡萄糖是适当浓度建立HUVEC损伤模型(图3 (b))。我们也用10μg / mL LPC的和30 mM葡萄糖刺激相结合。

3.4。对LPC - il - 22生成保护HUVECs和高Glucose-Induced受伤

确定il - 22生成对HUVEC细胞生存能力有着直接的影响,我们对DMEM培养HUVECs不同浓度il - 22生成;然而,没有观察到变化在细胞生存能力的团体(图4 (c))。接下来,我们对待HUVECs LPC (10μg / mL)和葡萄糖(30毫米)12 h,接着用不同浓度的il - 22生成(20 ng / mL, 40 ng / mL,和80 ng / mL) 24 h。细胞被CCK-8评估可行性分析。细胞的可行性HUVECs 10治疗后下降μg / mL LPC。相比之下,与il - 22生成废除了LPC-induced补充损失的细胞生存能力(图4 (c))。40 ng / mL il - 22生成的细胞生存能力+ LPC的组和80 ng / mL il - 22生成+ LPC的组显著高于LPC-treated组。这些结果清楚地表明,il - 22生成可以保护HUVECs LPC的浓度的方式。同样,在存在il - 22生成(40 - 80 ng / mL) + 30 mM的葡萄糖,细胞生存能力高于glucose-treatment组(图5 (c))。

此外,探讨il - 22生成对HUVEC细胞凋亡的影响在不同的处理条件下,细胞与DMEM培养,LPC,高浓度的葡萄糖,伴随着添加不同浓度的il - 22生成(20、40和80 ng / mL)。没有观察到凋亡率的变化在DMEM组il - 22生成的不同浓度处理(图4 (b))。然而,il - 22生成有效的减毒LPC-induced细胞凋亡在HUVECs剂量依赖性的方式(图4 (b))。细胞发生凋亡细胞死亡的百分比从62.07%下降LPC的±3.9%组49.2%±8.6%,45.18%±8.5%和39.83%±10.1%后暴露于20日,40岁,并且80 ng / mL il - 22生成时,分别为24小时。与此同时,凋亡细胞死亡减少18.47%±2.8%的高葡萄糖组10.4%±1.5%,8.4%±0.3%和8.33%±1.7%后暴露于20日40岁,并且80 ng / mL il - 22生成时,分别为24小时(图5 (b))。

3.5。IL-22R1表情HUVECs是增强与LPC的刺激和高浓度的葡萄糖

il - 22生成受体是一个异质二聚体由两个亚基组成,IL-22R1 IL-10R2。我们试图发现IL-22R1表情HUVECs治疗后与高浓度的葡萄糖和LPC的流式细胞术。如图6 (b),HUVECs LPC(10、20和40μ24 h g / mL)表现出剂量依赖性增加IL-22R1表达式(13.13%±2.77%、16.68%±6.15%和18.45%±4.19%,resp)。相比之下,DMEM-treated组(4.87%±1.57%)。HUVECs处理高浓度的葡萄糖(30、60和90毫米)也表现出增加IL-22R1表达式(12.83%±2.97%、14.83%±3.67%和14.45%±4.41%,resp)。相比之下,DMEM-treated组(图6 (c))。

3.6。阻塞IL-22R1消除对LPC - il - 22生成的保护作用,高葡萄糖,并结合Stimuli-Induced HUVECs受伤

因为IL-22-targeting细胞仅限于多发地细胞表达IL-22R1,我们假设通过IL-22R1 il - 22生成时对其保护作用。因此,我们进行了IL-22R1阻断实验。il - 22生成(40 ng / mL) LPC -相对细胞生存能力的增加,高葡萄糖,和LPC的+高glucose-treated HUVECs从64.88%±3.42%,86.09%±2.85%和41.7%±4.66%到78.14%±3.23%,97.21%±4.3%,分别和53.83%±5.21%。然而,在il - 22生成+ IL-22R1 antibody-treated组,细胞的可行性HUVECs±70.68%下降到2.67%,78.46%±8.57%,分别为和42.6%±5.73%(图7 (c))。

此外,40 ng / mL il - 22生成LPC的凋亡率降低,高葡萄糖,和LPC的+高glucose-treated HUVECs从56.37%±1.44%,18.47%±2.84%和69.9%±2.85%到44.5%±4.71%,8.4%±0.26%,分别和44.87%±3.32%。然而,在il - 22生成+ IL-22R1 antibody-treated集团HUVECs的凋亡率增加到49.27%±1.05%,13.37%±2.21%,分别为和55.6%±1.73%(图7 (b))。

4所示。讨论

我们的研究结果清楚地表明,2型糖尿病和CAD患者表现出增强的血清il - 22生成时的水平。升高血清il - 22生成与CAD和2型糖尿病的发病率有关。然而,进一步在体外研究建立il - 22生成时对内皮功能障碍的保护作用,一个重要的过程参与动脉粥样硬化的早期发展和血管并发症的2型糖尿病(20.,21]。潜在的刺激出现在2型糖尿病和CAD条件,如高葡萄糖和LPC分析,导致IL-22R1表达内皮细胞。我们所知,这是第一次报告的影响这些刺激IL-22R1表达式。与IL-22R1抗体中和IL-22R1减少il - 22生成的保护作用。在一起,我们的研究结果表明,il - 22生成可能发挥不同的功能在不同的上下文。当使用适当,il - 22生成可以应用于治疗慢性炎症性疾病,如2型糖尿病和CAD。

在我们的研究以及在一些先前的研究,增加il - 22生成时被发现在UA, AMI, T2DM病人。然而,之前没有进一步mechanism-related研究报告(22- - - - - -24]。我们的临床研究表明il - 22生成的病理效应。我们的在体外然而,研究建立了il - 22生成的内皮保护作用。il - 22生成报告的有益作用是符合先前的一些发现关于其在糖尿病和动脉粥样硬化中的作用。Islet-endogenous并且islet-exogenous il - 22生成能够抑制氧化和内质网应激引起的细胞因子或glucolipotoxicity在老鼠和人类β细胞(25]。此外,il - 22生成治疗改善角化细胞prohealing函数在糖尿病患者中,表明il - 22生成的潜在治疗糖尿病溃疡管理(26]。在动脉粥样硬化的情况下,il - 22生成 Apoe 老鼠表现出减少斑块大小和斑块胶原蛋白水平下降,在斑块稳定性的维护是很重要的。il - 22生成中可能促进斑块的增长和促进斑块稳定病灶形成(27]。

在这项研究中,我们发现一个有趣的悖论。“我们的临床研究表明,升高血清il - 22生成与二型糖尿病的发病率和CAD独立于其他临床参数。然而,我们细胞的研究表明,il - 22生成可能导致内皮再生。结果并不是相互排斥的。据Dudakov et al .,在急性组织损伤(如我们的细胞模型),il - 22生成大概能够迁移到局部病变,促进内皮细胞生存和增殖。然而,长期的慢性il - 22生成超表达(如在临床背景下)可能会导致生产的趋化因子和其他炎症的病理效应细胞信号和后续招聘组织发炎,导致疾病病情的恶化(28]。在慢性肝炎,IL-22-related病理学是依赖于招聘Th17细胞(29日]。il - 22生成的促炎作用也被报道在2型糖尿病(12]。il - 22生成放大il - 1β驱动人类脂肪组织炎症,从而扰乱体内葡萄糖稳态肥胖和2型糖尿病。是否il - 22生成调节生理反应或可能有助于病理生理的炎症和/或细胞因子环境取决于上下文。

IL-22R由两个heterodimeric子单元,IL-22R1 IL-10R2 [28]。il - 22生成具有高度的亲和力IL-22R1 IL-10R2但没有亲和力。最初的il - 22生成绑定IL-22R1 IL-10R2单元的单元使二次绑定,从而使下游信号。IL-22-IL-22R1通路报道能够导致高血糖的迁移和扩散角化细胞在体外和在活的有机体内通过诱导STAT3磷酸化(26]。角化细胞的激活proproliferative和prosurvival ERK1/2通路通过il - 22生成也被观察到糖尿病患者高血糖的和(30.]。因此,IL-22-IL-22R1信号通路在我们的环境需要进一步研究。

针对IL-22-IL-22R1系统可能受益有关皮肤慢性炎性疾病,慢性感染,胰腺炎,等等,虽然治疗灯应该是个性化的(31日]。对于牛皮癣、抑制IL-22-IL-22R1建议因为il - 22生成的持续再生的作用是致病的32]。另一方面,胰腺炎可能受益于补充il - 22生成时因为对胰腺腺泡细胞和胰岛细胞的保护作用[33,34]。因此,IL-22-IL-22R1系统可以保护或病理取决于上下文。有关il - 22生成可能功能像一把双刃剑在2型糖尿病和CAD发病机理、IL-22-IL-22R1的时机应用在治疗2型糖尿病和CAD是至关重要的。适当的增加或减少IL-22-IL-22R1根据上下文可能会有潜在的治疗慢性炎症性疾病,如2型糖尿病和CAD全面。

在我们的研究有一定的局限性。因为il - 22生成各种t细胞产生子集,比如Th17 Th22,γδT细胞,进一步分析需要跟踪il - 22生成的起源和探索有关免疫细胞的功能。此外,横断面研究内在的局限性。的表达il - 22生成具有动态效果是否需要进一步调查。深入分析正在进行中,以确定il - 22生成能够转化为治疗2型糖尿病和CAD。

5。结论

总之,我们的结果表明,血清il - 22生成水平高在2型糖尿病,CAD, T2DM-CAD合并症患者比控制。升高血清il - 22生成与2型糖尿病和CAD的发病率。il - 22生成能保护内皮细胞免受LPC -和高glucose-induced受伤。IL-22R1 il - 22生成的这种益处。我们的研究结果表明il - 22生成CAD和2型糖尿病是一把双刃剑。当使用适当,il - 22生成可以应用于治疗慢性炎症性疾病,如2型糖尿病和CAD。

缩写

计算机辅助设计:	冠状动脉疾病
LPC的:	Lysophosphatidylcholine
2型糖尿病:	2型糖尿病。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由美国国家科学基金会支持中国。81270428,没有。81300999,没有。81470501)。作者欣然承认说谎博士临床样本收集阳光。

补充材料