文摘

Periploca forrestiiSchltr。已被用来作为中国民间医学由于其通用的药理作用,如促进伤口和风湿性关节炎。然而,的抗关节炎药活动Periploca forrestii皂苷(PFS)及其活性化合物Periplocin依然没有被证实。这里,我们评估的抗关节炎的影响在adjuvant-induced PFS关节炎(AIA)大鼠胃内的政府的剂量50毫克/公斤。的抗炎活动Periplocin LPS-induced友邦脾细胞和synoviocytes也检查。PFS显著改善关节肿胀;抑制骨侵蚀关节;降低水平的il - 6和TGF -β1在友邦鼠脾细胞;和减少联合phospho-STAT3和IKK的蛋白表达水平 。使用LPS-induced友邦脾细胞,我们证明Periplocin抑制促炎细胞因子il - 6的水平,关键干扰素-γTGF -β1,IL-13 T-bet il - 22生成和转录因子水平,GATA3, C-Jun基因。从synoviocytes Periplocin也抑制LPS-induced细胞因子分泌。我们的研究强调了PFS的抗关节炎的活动及其派生Periplocin和底层机制。这些结果为进一步测试和验证提供了一个有利的理由使用Periploca forrestiiSchltr。作为替代治疗RA的形态。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA),影响大约1%的世界人口,是一个系统性的,慢性自身免疫性炎症性疾病,优先攻击关节的滑膜衬里,破坏当地的关节结构,并进一步影响相关组织和器官系统(1,2]。治疗类风湿性关节炎会导致畸形和残疾(3]。因此,治疗关节炎症和软骨破坏是一个逻辑策略预防风湿性关节炎的进展(4,5]。

一个主要因素在RA关节炎症和antigen-induced关节炎(AIA)是促炎细胞因子。干扰素-γ、il - 6和il - 22生成时被发现在关节炎的发展,提升和抑制TNF和il - 6代表成功的治疗类风湿性关节炎的6,7]。相反,抗炎细胞因子(例如,il - 10, TGF -β和IL-13)可能抑制关节炎(3]。

尽管如此明显的炎症和骨代谢增加之间的关系在RA和几个治疗选项的存在,其功效在炎症和骨治疗似乎非耦合,用一些药物抑制炎症但未能保护骨(8,9)和其他人停止骨破坏但不影响控制炎症(10]。

干燥根或整个的葡萄树Periploca forrestiiSchltr。萝摩科的临床处方中有效促进血液循环,消除风心脏抗肿瘤和抗炎效果,广泛用于治疗风湿性疾病(11,12]。Periploca forrestii主要包含心脏苷、黄酮类化合物,C21甾体皂苷和其他三萜成分。皂苷是特征组件的主要活性成分Periploca forrestii。Periplocin是心脏苷提取之一Periploca forrestii,几项研究已经解决各种心脏病(11- - - - - -14]。最近的研究还表明,Periplocin提取五加皮可以抑制细胞生长在结肠癌细胞中,肺癌细胞、肝癌细胞(15- - - - - -17]。

我们的目标在本研究测试的影响PFS治疗炎性细胞因子的基因表达和对整个关节滑膜组织结构在老鼠友邦保险模型,进一步论证其可能在治疗RA疗效。在这个工作我们也报告,Periplocin显著降低细胞因子在友邦脾细胞和正常synoviocytes。

2。材料和方法

2.1。试剂和动物

Periplocin购买国家总局的中华人民共和国质量监督检验检疫总局。p-Stat3、IKK ,导出κB 从圣Clauz购买。女性雄性sd大鼠中(6 - 8周大)的平均重量150 - 180克从桂林医科大学实验动物中心,获得中国。老鼠被安置在一个适当的环境,有一个空气过滤系统。实验过程都是桂林医科大学的研究伦理委员会批准,中国。

2.2。的集合Periploca forrestii和皂素提取过程

Periploca forrestii收集来自广西,中国,被太阳从桂林医科大学博士。装腔作势的干燥根提取得到的粉末与70%乙醇2 h。提取两次reextracted遵循同样的步骤,然后过滤。滤液与石油醚(1:1)分区然后丁醇。丁醇溶剂在真空蒸发器蒸发产生丁醇分数。

最后提取集中和干获得PFS。研究PFS的抗关节炎药活动,丁醇提取物溶解在水中,关节炎的雄性sd大鼠中,一些喂食的剂量50毫克/公斤体重(归一化的人类剂量)通过使用下面描述的方法。

2.3。诱导的关节炎

女性雄性sd大鼠中被随机分为以下三组:正常组=正常老鼠;友邦保险对照组= CFA-induced关节炎大鼠;FPS组= PFS 50毫克/公斤友邦治疗大鼠。引起的慢性关节炎是五点注入总额的0.5毫升的弗氏完全佐剂(CFA,西格玛奥德里奇)含有1毫克的热死结核分枝杆菌1毫升的矿物油的背部皮肤的雄性sd大鼠中皮内。两周后,关节炎是由subplantar政府0.1毫升的CFA到后所有老鼠的爪子,分别。在爪子佐剂注射7天之前,免疫组口服给予50毫克/公斤/天直到前一天组织收割,28天。对照组有水。爪子的厚度测量感应使用前拨测厚仪(孔雀日本)和治疗后。

2.4。组织学和免疫组织化学

后爪子都是从老鼠CFA免疫后28天。每个爪子在一夜之间在4%多聚甲醛固定,然后软化10%乙二胺四乙酸(EDTA)一个月前在石蜡包埋。石蜡包埋组织连续切片在5µ米距离连续使用切片机和安装在显微镜幻灯片。然后部分或者给予甲苯胺蓝染色和快速绿色或safranin-O (safranin-O污点被完整的软骨),抗酒石酸酸性磷酸酶(陷阱),11 (MMP-11)和基质金属蛋白酶。组织病理学变化的关节滑膜增生,血管翳形成,软骨流失和骨质侵蚀在显微镜下观察到使用现场成像软件,和代表照片奥林巴斯显微镜放大100倍。

2.5。西方墨点法

冰冻的滑膜组织(整个关节包括滑膜、邻近组织和骨骼)在干冰重和破碎成碎片。爪子溶解产物均质在无线电免疫沉淀反应试验(里帕)裂解缓冲(50 mM Tris-HCl, 150毫米氯化钠,1% Triton x - 100和1%脱氧胆酸盐)补充氟化钠15毫米,1毫米钒酸钠、焦磷酸钠2毫米,1毫米甘油磷酸酯钠,2毫米咪唑,100毫克/毫升phenylmethylsulfonyl氟化物和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(西格玛奥德里奇),和用裂解缓冲区,通过在12000 g离心10分钟4°C。蛋白质样本孤立使用布拉德福德从爪子发炎组织和量化分析并将其保持在−80°C到使用。蛋白质样品(25μg /)电泳用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -)(页面)和转移到聚偏二氟乙烯膜。免疫印迹分析使用兔子anti-rat多克隆抗体(1:1000)作为主要抗体和辣根过氧化物酶(合)共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 5000)作为二级抗体,分别。蛋白质被发现使用增强化学发光(ECL)。乐队强度测量densitometrically使用图像软件。β肌动蛋白用于规范化目标和相对表达式表示为褶皱比率。

2.6。制备脾细胞与有限合伙人及其引发刺激细胞因子检测

雄性sd大鼠中注入了100人μl CFA (1μg / ml)在适当的足底皮内炎症;两周后,脾细胞被孤立。从脾细胞悬浊液红细胞被移除后使用0.16 Tris-NH红细胞清除缓冲区4Cl解决方案,脾细胞悬浮液中调整到2×10的细胞密度6细胞/毫升。这些脾细胞被放置在一个96孔板在37°C杜尔贝科最低基本培养基(DMEM)补充5%胎牛血清的边后卫,2毫米谷酰胺,100单位/毫升青霉素G钠,和100年μ克/毫升硫酸链霉素。脾细胞(100μl)被添加到每个井的96孔板在100年的存在与否μl的最终浓度为2μ克/毫升periplogenin和脂多糖(LPS) (1μg / ml)。细胞被孵化的37°C在湿润的气氛中5%的有限公司23、6、12和24小时。

2.7。Synoviocyte文化

从膝关节滑膜组织得到正常的雄性sd大鼠中。滑膜组织被剁碎,搅拌和IV型胶原酶(西格玛奥德里奇有限公司、美国)血清DMEM / F12培养基在37°C的孵化器瓶2 h。滑膜组织溶解产物过滤一个40μ米尼龙网、洗广泛,播种12-well微型板块。细胞在DMEM / F12培养补充10%的边后卫和青霉素g钾(100单位/毫升)37°C / 5%的股份有限公司2。

2.8。目标基因的定量表达式

脾脏或细胞总RNA分离使用试剂盒试剂根据生产指令(试剂盒,英杰公司)。核糖核酸的纯度和产量评估通过测量RNA溶液的吸光度在260 nm和280 nm。RNA产品大小估计相对于100个基点DNA梯。1的互补脱氧核糖核酸合成μg 2 x达克的RNA PCR主RT混合混合(Aidlab生物技术)的最后一卷20μL根据制造商的指导方针。具体的正向和反向引物被用于目标基因表达(表1)。Beta-actin规范化使用不同的RNA隔离,RNA降解,和反转录的效率。目标基因的相对表达被声明为褶皱比使用智能视图的方法。

表1
目标基因的引物。
2.9。统计分析

所有的实验结果都表示为(SD)的几个独立的实验。多重比较的数据是由方差分析(方差分析)与Dunnett测试。 不到5%的值被认为是重要的。

3所示。结果

在目前的研究中,我们调查了友邦保险老鼠的体内PFS的功效。每组雄性sd大鼠中每天喂了PFS CFA免疫前开始,然后持续了35天。控制老鼠收到水口服。与100年大鼠免疫μg CFA在第一周开始患上关节炎。的初始表现关节炎红斑和肿胀的脚踝关节,其次是跖骨的炎症和指间关节。可以评估疾病进展测量爪肿胀厚度,这是炎症的程度的一个指标。为了评估PFS的抗关节炎的功效,爪子厚度变化量化使用孔雀测厚仪。PFS显著改善爪肿胀。在实验的最后,更重要的爪子厚度的减少观察治疗组与PFS(50毫克/公斤)(数据1(一)和1 (b))。

(一)
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(c)
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图1
PFS预防性抑制炎症在老鼠CFA-induced关节炎。友邦保险是诱导的详细方法。老鼠被随机分为3组:正常,控制和PFS。PFS的口服药物,直到前一天组织收获28天。(一)代表天的照片- 3治疗组的爪子。(b)脚踝厚度的变化。爪厚度的变化测量每四天。结果表示为平均值±标准错误( = 7 - 9)。统计值进行天0-28爪厚度的变化而控制如下: 与对照组相比,Dunnett的测试。((c) - (f))代表的照片膝关节组织沾safranin-O-fast绿色,甲苯胺blue-fast绿色,陷阱,或MMP-11(放大100倍)。注意,激烈的滑膜炎症浸润(c)(黑色箭头),血管翳形成((c)箭头),软骨破坏,大量蛋白聚糖损耗(d)(黑色箭头),和MMP-11渗透((f)箭头)显著降低关节PFS-treated老鼠相比各自控制的老鼠。答:关节软骨;G:生长板;J:关节空间;M:滑膜;P:血管翳形成。

PFS对联合组织病理学变化的影响实验动物被safranin-O检查,甲苯胺蓝,陷阱,MMP-11染色。故事代表了正常、控制和PFS-treated组。正常的动物显示没有检测到异常;为控制关节炎大鼠;关节软骨损伤的膝关节有适度的证据与血管翳形成。血管翳的形成是由于synoviocytes增生和炎症细胞的观察积累,导致软骨和骨骼畸形。滑膜和胶囊都显著增厚由于血管翳形成和炎性细胞浸润(图1 (c))。在对照组中,慢性炎症破坏联合衬里,包括广泛的软骨蛋白聚糖损耗和其他附近的支撑结构,如骨(图1 (d))。在一些地方友邦关节破骨细胞再吸收软骨下骨板noncalcified软骨(图1 (e))。MMP-11被发现的渗透增生的滑膜衬里脱落的synoviocytes到关节空间(图1 (f))。此外,这些变化在PFS-treated改善动物。这些结果表明,PFS抗关节炎药活动。

我们进行体内试验鼠脾细胞CFA-induced细胞因子生产的澄清是否PFS治疗调节细胞因子的产生。细胞因子水平测定脾脏组织中获得洞察有益PFS-mediated效应的机制。在图2逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)结果显示相对少量的il - 6和TGF -β1 mRNA的健康大鼠的脾脏。然而,这些记录的浓度表现出大幅提高大鼠的关节与友邦保险。有明显降低( TGF -)的表达式β1和il - 6 mRNA在PFS-treated老鼠与各自的控制。然而,PFS-treated老鼠T-bet mRNA水平下降不显著。这些结果表明,PFS监管系统的同时降低il - 6和TGF -免疫反应β1生产和转录因子在大鼠的脾脏与RA。

(一)
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(b)
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图2
PFS抑制炎性细胞因子的表达。友邦保险是诱导的详细方法。关节炎大鼠服用50毫克/公斤PFS 35天。28天:脾细胞被定量rt - pcr测量细胞因子表达的收获。(一)rt - pcr分析相关的炎性细胞因子的基因和转录因子和(b)相对大量的细胞因子基因水平测定光密度分析。Dunnett的测试。N:正常;C:控制;M:标记。ns:无显著差异。

随着STAT3炎症的关键角色,PFS的监管影响炎症反应的友邦老鼠。p-STAT3蛋白表达升高的友邦的老鼠比正常组(图3)。值得注意的是,PFS管理50毫克/公斤显著降低p-STAT3 IKK 蛋白质类风湿性关节炎大鼠模型中的表达。


图3
PFS治疗对蛋白表达的影响p-STAT3、IKK 导出, B 蛋白质表达水平在友邦鼠模型中。友邦保险是诱导中描述的方法。关节炎大鼠服用50毫克/公斤PFS 35天。在28天的非标靶器官的爪子被加工和蛋白质溶解产物表达的探索p-STAT3和相关NF - 家庭成员(IKK 和导出 B 通过免疫印迹)。N:正常;C:控制。

有限合伙人是一种革兰氏阴性细菌的细胞壁的重要组成部分,是一个著名的诱导的炎症和炎性骨质流失18]。我们准备从弗氏完全佐剂的雄性sd大鼠中脾细胞。LPS-induced生产促炎因子il - 6, Th1 (IFN -γ),Th2 (TGF -β1和IL-13), Th17 (il - 22生成)和转录因子T-bet, GATA3, C-Jun mRNA在脾细胞收获增加。然而,时间依赖方式的mRNA水平相对较低Periplocin-treated脾细胞(图4)。



图4
Periplocin对脾细胞的促炎细胞因子表达的影响弗氏完全佐剂的雄性sd大鼠中。脾细胞准备下所描述的方法。脾细胞培养在Periplocin的存在与否或有限合伙人表示时间。总信使rna是准备rt - pcr分析。Periplocin (a)化学结构,(b) rt - pcr分析相关的炎性细胞因子的基因和转录因子,和相对大量的细胞因子基因水平测定光密度分析。L:有限合伙人;P: Periplocin;●:有限合伙人;○:有限合伙人+ P;▲:P。

有限合伙人可以刺激FLS的分泌基质金属蛋白酶,这种感应调控在转录和翻译水平(19]。不同浓度的mRNA的表达il - 6的影响,TGF -β1,C-Jun LPS-induced synoviocytes检查。空白组,有弱的mRNA表达il - 6和TGF -β1,细胞因子的表达在LPS组显著增加。从0.5 Periplocin的剂量逐渐增加μ2 g / mlμg / ml, mRNA的表达il - 6和TGF -β1浓度的方式降低了。虽然C-Jun水平降低LPS-induced synoviocytes,然而,增加C-Jun水平浓度的方式被发现(图5)。

(一)
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(b)
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图5
在synoviocytes Periplocin对促炎细胞因子表达的影响正常的雄性sd大鼠中。Synoviocytes准备详细的方法。Synoviocytes孵化了Periplocin 24 h浓度表示的有限合伙人(1的存在与否μg / mL)刺激。24小时后,信使rna被rt - pcr和测量β肌动蛋白是用作内部控制。代表凝胶染色的il - 6和TGF - rt - pcr产品β信使rna的表达synoviocytes与Periplocin AA模型大鼠治疗。(一)rt - pcr分析相关的炎性细胞因子的基因和转录因子和(b)相对大量的细胞因子基因水平测定光密度分析。稳态的表达β肌动蛋白是用来控制相同加载的PCR产物凝胶。柱状图显示了mRNA水平。B:空白;L:有限合伙人;P: Periplocin。

4所示。讨论

友邦保险的特点是一个快速的出现和发展为关节炎症。通常疾病是严重的,会导致永久性的关节畸形,包括关节僵硬。对称的共同参与,淋巴细胞浸润、软骨退化、滑膜增生和T细胞依赖共享特性与人类风湿性关节炎(20.,21]。皮下注射FCA在tibiotarsal联合多个站点的女性的雄性sd大鼠中造成局部的炎症反应发展在24 h。显著特征是滑膜增厚的疫源地的软骨侵蚀和著名的踝关节周围骨质破坏。

许多强大的抗关节炎的药物可用于关节炎的管理。然而,他们长期使用与严重不良反应和他们在比例的患者是无效的。此外,他们是昂贵的。然而,他们长期使用与严重的负面影响。因此,越来越多的RA患者和其他疾病在发达国家使用的是天然产物和其他补充和替代医学(CAM)方法为他们的医疗保健需求22- - - - - -26]。

各种草本植物属于中医在中国几个世纪以来一直用于治疗风湿性疾病,包括类风湿性关节炎。很多研究表明传统草药资源效益的管理类风湿性关节炎,可能因此RA中获益。许多中药有效地分析了风湿性关节炎的治疗记录和相关机制进一步检测(27]。

Periploca forrestii展示了几个药用预防效果在中国民间传统医学;因为最近几个植物皂甙被发现在不同模型的自身免疫性疾病,治疗效果,如关节炎(28,29日),我们建议PFS可能对自身免疫性疾病的临床有益影响诱导免疫抑制长期执政期间。因此,本研究进行了评估PFS的抗炎和抗关节炎药活动基于实验模型的自身免疫性关节炎(友邦保险模型)。

在这项研究中,PFS缓解临床结果,滑膜增生炎性细胞浸润,在CFA和软骨破坏老鼠。它揭示了PFS抑制炎性细胞因子和转录活动通过抑制STAT3信号。的脾细胞CFA-immunized雄性sd大鼠中对待TGF - PFS显示显著降低表达式β1、il - 6和进一步GATA3,但对T-bet略有影响。影响的相对缺乏T-bet建议PFS的活动产生了重大影响幼稚T细胞成Th2细胞的分化,但不是Th1细胞。地址是否PFS调制NF -κB信号通路,我们试图分析NF -的表达κB信号转导蛋白缺失或PFS的存在。我们表明,CFA的磷酸化STAT3和PFS抑制效果。此外,它已经表明,il - 6可以诱导的磷酸化STAT3在特定细胞系(30.]。在这方面,很可能减少爪子p-STAT3观察到西方墨点法在我们的研究可能是由于在STAT3 PFS的直接效应和通过降低il - 6表达产生影响。这些数据表明,PFS可能通过调节提高友邦STAT3-regulated基因,从而影响各种生物事件。的确切机制仍有待考验。

没有进行研究,评估PFS治疗RA的功效,很难执行先进的机械和特异性的行动研究使用天然植物提取物,具有多个组件。这是理由检查Periplocin来源于植物的作用机制Periploca forrestiiSchltr。,which then could be extrapolated to that of the natural PFS. Therefore, the present study was conducted to evaluate the anti-inflammatory and antiarthritic activities of PFS active ingredient Periplocin on LPS-induced AIA splenocytes and on LPS-induced synoviocytes. Most of the studies on Periplocin are based on its activity on circulatory system and tumor disease. Our study has unraveled the immunological basis of the antiarthritic property of this naturally occurring plant compound and most of the mechanistic attributes of Periplocin are similar to those of PFS.

因为许多TGF - LPS刺激β1,通过脾细胞il - 6生产(图5),我们考虑是否TGF -β1和IL-6-inhibiting PFS的活性可能与免疫调节活动。我们发现Periplocin来自PFS相对较高的免疫调节活性。事实上,它已经表明,Periplocin减少RA因子il - 6的水平,Th2细胞因子(TGF -β1和IL-13), Th1 (IFN -γ和IL-33), Th17 (il - 22生成)和抑制GATA3的表达,T-bet, C-Jun LPS-induced脾细胞。类似的结果还发现LPS-induced synoviocytes通过抑制il - 6和TGF -β1的表达;Periplocin因此广泛的目标,不仅调节免疫细胞因子也相对转录因子。

细胞因子是免疫过程的直接涉及许多与类风湿性关节炎的发病机制有关。有几项研究比较循环细胞因子的水平;他们经常在他们的研究结果显示差异。类似于我们的友邦,血清il - 6水平大幅增加RA与明显的昼夜变化对应于RA症状的昼夜节律31日]。研究解决TGF -的作用β和il - 10在实验性关节炎显示变量的结果。显著升高TGF -β1水平已报告在RA患者的血清32]。Anti-TGF -β和anti-TGF -β国际扶轮抗体注射抑制慢性滑膜炎与链球菌细胞wall-induced关节炎大鼠(33和在抗原-和胶原诱导关节炎小鼠34]。在这项研究中,脾细胞的CFA-immunized雄性sd大鼠中导致TGF -β1水平体内和LPS诱导更高层次TGF -β1 CFA-immunized雄性sd大鼠中脾细胞体外,有限合伙人加入正常synoviocytes导致更高的TGF -β1。水平的提高IL10 RA患者血清中被发现(35]。除了失去抗炎功能,il - 10可以获得促炎的功能。证据存在,白介素- 10 (IL)家族细胞因子可能参与了RA的发病机制(36]。增加血清水平的许多细胞因子确实发现在其他风湿性疾病:尤其是银屑病关节炎(il - 6, IL-7、il - 10和干扰素-γTGF -β或肿瘤坏死因子- )表明这样的上涨可能反映炎症而不是特定疾病(37- - - - - -40]。

综上所述,CFA-immunized雄性sd大鼠中迅速出现炎症的特征和更高的常见RA值参数,如图所示,脾细胞细胞因子分析,最准确的人类风湿性关节炎预后的标志。这个模型是非常有用的评估各种关节炎治疗方案的疗效。因此,PFS和Periplocin预防性治疗自身免疫性关节炎不仅通过控制系统性自身免疫反应,也通过控制炎症和关节的骨破坏。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(授予号。81260462和81260462)和中国广西自然科学基金(批准号AA139104)。Guangchen太阳是格兰特的接收者。