文摘
的TSC1/2异质二聚体,一个关键的上游mTOR的调节器,可以抑制mTOR的激活,在细菌感染后免疫反应中起着至关重要的作用。单核细胞是一个先天免疫细胞类型,已被证明参与菌血症。然而,mTOR通路是如何参与调节单核细胞在很大程度上是未知的。在我们的研究中,TSC1 KO小鼠和WT老鼠感染大肠杆菌。WT老鼠相比,我们发现高死亡率,更多的细菌,表达式的辅活化因子单核细胞减少,亚群的数量增加和减少的数量效应在TSC1 KO小鼠T细胞。单核细胞从TSC1 KO小鼠产生更多的活性氧,il - 6、il - 10, TGF -β以及更少的il - 1, IFN -γ和肿瘤坏死因子-α。综上所述,我们的研究结果表明,TSC1 KO小鼠的免疫功能抑制受mTORC1激活单核细胞的影响。辅活化因子导致的表达抑制效应T细胞增殖。mTORC1-activated单核细胞中有害细菌感染。因此,抑制mTORC1信号通过雷帕霉素的管理可以挽救的有害方面过于活跃的免疫反应,这知识为临床治疗提供了新的方向。
1。介绍
结节性硬化症(TSC)是一种常染色体显性遗传疾病,TSC基因突变的结果,TSC1和TSC2。异质二聚体,由TSC1和TSC2编码TSC1和TSC2分别是一个关键的上游调控哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)途径1]。TSC1/2基因的突变可能损害的抑制功能TSC1/2复杂,导致mTOR信号激活和下游效应器磷酸化,如p70 S6激酶(S6K)和4 e结合蛋白1 (4 ebp1),最终影响细胞过程。最近,mTORC1被发现在免疫反应中发挥重要作用的细菌感染(2,3]。对脂多糖(LPS) toll样受体(TLR)刺激蛋白质合成正在迅速增强小鼠巨噬细胞和树突细胞,这在很大程度上是由磷脂酰肌醇3-kinase——(PI3K) mTORC1通路(4,5]。在小鼠macrophage-like细胞系和细菌感染的小鼠模型,免疫激活也与雷帕霉素(拉伯),观察治疗后mTORC1通路抑制剂(5,6]。PI3K信号现在可以有针对性的确定对风湿性和银屑病关节炎管制增殖异常激活免疫细胞的生存、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞和滑膜成纤维细胞明显重叠癌症细胞的异常生长(7]。
菌血症,常见的细菌性疾病,涉及多个免疫过程,如免疫细胞激活和无序细胞因子表达(8]。当宿主免疫机制消除血液中的细菌,通常是短暂的,临床诊断良性的。然而,当主机机制失败,菌血症,甚至败血症,可结果(9]。单核细胞,一种先天免疫细胞(10),已被证明参与菌血症(11]。虽然单核细胞活动的监管机制还没有完全理解,单核细胞的先天免疫反应已经在一些研究报告(11]。炎症性单核细胞被观察到出口从骨髓血液trypanotoxic分子(即发布。,肿瘤坏死因子,也没有)12]。单核细胞也被证明参与T细胞启动和极化13,14]。炎症性单核细胞也影响Th1和Th17细胞分化诱导T-bet表达式(14]。在THP-1-derived巨噬细胞和人类单核细胞,抑制mTOR雷帕霉素逆转l . donovani全身的il - 12、il - 10调制。l . donovani的磷酸化P70S6K, mTOR的相关活动,在TLR-stimulated THP-1派生的巨噬细胞(15]。在人类的树突细胞,mTOR调节白介素p40-mediatied Th1 (IFN -γ)和Th17 (IL-17)反应在自身免疫性疾病16]。然而,如何mTORC1通路调节单核细胞在细菌感染在很大程度上是未知的。在这项研究中,我们的目标是探讨如何mTORC1通路调节外周血单核细胞的功能菌血症的早期阶段。
2。材料和方法
2.1。动物和治疗
Tsc1 老鼠和老鼠表达Cre重组酶(一种酪氨酸重组酶的酶)购买从杰克逊实验室(美国巴尔港)。纯合子小鼠Tsc1在骨髓细胞(LysMCre删除Tsc1 ;TSC1 KO)得到跨越两只老鼠表达Cre溶菌酶启动子的控制下(LysMCre)。LysMCre-negative,Tsc1 小鼠作为控制(WT老鼠)。Rosa26R-EYFP老鼠从杰克逊实验室购买(美国巴尔港)和培育LysMCreTsc1 老鼠监控Cre表达式使用增强的黄色荧光蛋白(EYFP)表达式。观察EYFP Cre-expressing组织的双突变体后代(Rosa-LysMCreTsc1 )。所有老鼠都保持在一个特定的无菌设施和使用按照协议批准动物保健和血液学研究所的用户委员会,北京协和医学院。
雷帕霉素(拉伯)(开曼化工、国家)包含5% DMSO溶液是溶解在PBS。年龄在6 - 8周小鼠腹腔注射拉伯(1.5毫克/公斤)每天四天。
2.2。流式细胞术
淋巴结和脾脏细胞被隔绝KO和WT老鼠。简单,6 - 8-week-old雄性和雌性老鼠牺牲,和周边淋巴结(pln),肠系膜LNs (mln)和脾脏被切除,转移到包含2%的边后卫PBS。淋巴结(LNs)和脾细胞通过过滤LNs和脾细胞通过48-micron尼龙网。大约一百万个白细胞和抗体孵化(anti-CD4-FITC)在黑暗中30分钟,然后用染色缓冲区。与anti-CD4-FITC染色后,anti-Ki67-APC、anti-IL-17-PE anti-Foxp3-PE / Cy7, anti-IFN -γ-PerCP / Cy5.5,细胞内染色进行了使用鼠标调节性T细胞染色工具包(eBioscience)。
2.3。大肠杆菌感染
五千万年大肠杆菌美国细胞(写明ATCC)通过尾静脉注射感染的老鼠。postinfection八小时,外周血通过retroorbital穿刺收集并放在EDTA-containing集合管。血样处理红细胞裂解缓冲和PBS含有2%的边后卫洗一次。细胞溶解产物然后在3000转离心10分钟。
评估残留细菌的数量。细胞上清液稀释20倍和LB培养基生长在37°C在200 rpm 14个小时。增长是由吸光度(OD600)监控,OD = 1对应于109细胞/毫升。大约一百万白细胞和抗体孵化(anti-CD11b-PE / Cy7 anti-Ly6G-APC / Cy7 anti-Ly6C-PerCP / Cy5.5 anti-CD80-PE / Cy7 CD40-PE / Cy7 anti-CD86-PE, anti-CD14-FITC, anti-MHC-II-APC,和anti-TLR4-PE)在黑暗中30分钟,然后用染色缓冲区。细胞用流式细胞分析仪测定(美国BD FACSCanto II)。数据分析使用FlowJo软件(美国Treestar)。
评估各种细胞因子的血浆浓度。其余的细胞上清液储存在−80°C。肿瘤坏死因子的浓度α,il - 1β、il - 6、il - 10,干扰素-γ,TGF -β是衡量QuantiCyto®酶联免疫试剂盒(NeoBioscience、深圳、中国)根据制造商的指示。
流式细胞术。雄性和雌性老鼠牺牲,pln mln,脾脏被切除,转移到包含2%的边后卫PBS。LNs和脾脏细胞是通过通过48-micron尼龙网过滤LNs和脾脏。大约一百万细胞孵化了抗体(anti-CD4-APC、anti-CD62L-FITC anti-CD44-PerCP / Cy5.5)在黑暗中30分钟,然后用染色缓冲区。细胞用流式细胞分析仪测定(美国BD FACSCanto II)。数据分析使用FlowJo软件(美国Treestar)。
2.4。细胞Coculture实验
扩散实验。淋巴结细胞被隔绝WT老鼠在6 - 8周的年龄。牺牲后,pln和mln切除转移到包含2%的边后卫PBS。淋巴结细胞通过过滤pln和mln 48-micron尼龙网。调节性T细胞亚群,CD4细胞+CD25+)和天真的CD4+T细胞(CD4+CD4CD62L+)从淋巴结分类和孵化的浓度为107细胞/毫升与2μM carboxyfluorescein succinimidyl酯(美国英杰公司)在室温下10分钟,洗两次与PBS包含5%的边后卫。然后,2×105亚群或天真的CD4+T细胞是cocultured 1×105单核细胞(CD11b排序+ Ly6C+)从包含2 WT或TSC1 KO小鼠在DMEM (100 ng / mL)或anti-mouse CD3e (10μg / mL,美国BD生物科学)和CD28抗体(10μg / mL, BD生物科学,96年美国)平底的盘子。6天后,细胞治疗或CD3e和CD28 - 2被用来估计亚群,CD4细胞+T, Th17细胞流式细胞仪(美国BD FACSCanto II)。
il - 10治疗实验。二十万年排序天真CD4+T细胞(CD4+CD4CD62L+)cocultured 1×105单核细胞(CD11b排序+ Ly6C+)从WT老鼠DMEM包含anti-mouse CD3e和CD28抗体在96 -平底的盘子。细胞治疗与il - 10(英国20 ng / mL, Peprotech)或PBS。6天后,IL-17A CD4分泌物+化验了T细胞流式细胞仪(美国BD FACSCanto II)。
2.5。活性氧(ROS)测量
外周血样本WT或TSC1 KO小鼠红细胞裂解处理缓冲区。大约一百万白细胞和抗体孵化(anti-mCD11b-PE / Cy7、anti-mLy6C-PerCP-Cy5.5 anti-mLy6G-APC / Cy7)在黑暗中30分钟,然后用染色缓冲区。孵化后10μM CM-H2DCFDA(美国英杰公司)为30分钟37°C, ROS用流式细胞仪测量(美国BD FACSCanto II)。数据分析使用FlowJo软件(美国Treestar)。
2.6。rt - pcr
CD11b+ Ly6c+细胞被BD FACSAria三世排序。总RNA分离使用试剂盒试剂(美国表达载体)。逆转录和执行M-MLV逆转录酶(TransGen生物技术)根据制造商的指示。rt - pcr确定使用SYBR绿色主人混合(生命科技™)。GAPDH的循环阈值减去从循环阈值(ΔCt)。使用比较相关基因进行了量化GAPDH方法和规范化。使用的引物PCR如下:向前5′-CTTTGTCAAGCTCATTTCCTGG-3′和反向5′-TCTTGCTCAGTGTCCTTGC-3′(GAPDH);向前5′-CAAAGCCAGAGTCCTTCAGAG-3′和反向5′-GTCCTTAGCCACTCCTTCTG-3′(IFN -γ);向前5′-ACGGACCCCAAAAGATGAAG-3′和反向5′-TTCTCCACAGCCACAATGAG-3′(il - 1β);向前5′-GAGTGACAAGCCTGTAGCC-3′和反向5′-CTCCTGGTATGAGATAGCAAA-3′(TNF -α);向前5′-GAGACGGAATACAGGGCTTTC-3′和反向5′-TCTCTGTGGAGCTGAAGCAAT-3′(TGF -β);向前5′-AGCCGGGAAGACAATAACTG-3′和反向5′-GGAGTCGGTTAGCAGTATGTTG-3′(il - 10);向前5′-CAAAGCCAGAGTCCTTCAGAG-3′和反向5′-GTCCTTAGCCACTCCTTCTG-3′(il - 6)。
2.7。统计分析
数据给出平均值±标准平均误差(SEM)。未配对学生的以及用于评估两组之间的差异。小动物——一张长有值小于0.05被认为是统计学意义(,,)。
3所示。结果
3.1。大肠杆菌感染mTORC1 / S6k通路激活单核细胞,和感染TSC1 KO小鼠部分模拟大肠杆菌感染
我们使用LysMCreTsc1/ f罗莎老鼠探测的比率Tsc1单核细胞。YFP代表的百分比的比值Tsc1淘汰赛单核细胞(图1(一))。S6K mTORC1通路的下游效应,其磷酸化(pS6K)代表mTORC1通路的激活。pS6K在单核细胞的表达获得WT, TSC1 KO, TSC1 KO小鼠接受拉伯(KO +拉伯)表示的缺失Tsc1可以激活mTORC1, mTORC1通路的激活可以拯救拉伯(图1 (b))。当老鼠被感染大肠杆菌,pS6K的表达也增加了WT (WT +小鼠的单核细胞大肠杆菌),这表明大肠杆菌激活mTORC1通路在单核细胞和mTORC1-activated单核细胞在感染细菌感染可以模拟部分TSC1 KO小鼠(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.2。TSC1 KO小鼠血液中显示更多的细菌和更高的死亡率大肠杆菌感染
比较抗细菌感染在WT TSC1 KO小鼠,我们感染了WT TSC1 KO小鼠大肠杆菌(05细胞/鼠标)。在八小时postinfection,我们收集外周血和测量残留细菌的数量。我们发现明显更多的细菌TSC1 KO小鼠比WT老鼠(图2(一个))。此外,我们记录了细菌感染后小鼠的存活时间,绘制生存曲线。结果显示更高的死亡率TSC1 KO小鼠相比WT老鼠(图2 (b))。我们也测量了各种细胞因子水平的血清WT, ELISA TSC1 KO小鼠感染细菌(图2 (c)),发现il - 6、il - 10和TGF -β增加和干扰素-γ,il - 1β和肿瘤坏死因子-α减少TSC1 KO小鼠。WT老鼠相比,这些结果表明TSC1 KO小鼠表现出细菌感染后免疫反应减弱。
(一)
(b)
(c)
3.3。il - 6的表达,TGF -β和il - 10增加,而干扰素的表达γ,il - 1β和肿瘤坏死因子-α在单核细胞减少TSC1 KO小鼠感染的细菌
了解TSC1 KO单核细胞因子反应,我们从单核细胞在小鼠体内评价细胞因子的表达与细菌和发现单核细胞(CD11b+Ly6C+ )获得TSC1 KO小鼠il - 6的分泌增加,il - 10, TGF -β。这与炎性细胞因子,包括干扰素-γ,il - 1β和肿瘤坏死因子-α相比,表明降低了表达式WT老鼠(图3)。拉伯治疗,il - 6、il - 10和TGF -β下降,而干扰素-γ,il - 1β和肿瘤坏死因子-α增加TSC1 KO小鼠。这些结果显示,细胞因子表达式是由mTORC1信号在细菌感染单核细胞。
3.4。亚群增加而Th17减少淋巴结和脾脏的TSC1 KO小鼠
因为大量的细菌,促炎细胞因子的浓度较低,和更大的TSC1 KO小鼠死亡率,我们认为TSC1 KO小鼠受损抗菌免疫反应,导致弱TSC1 KO小鼠免疫反应。因此,我们发现亚群的数量和扩散,其功能是抑制免疫反应(17]。我们发现淋巴结的数量和比例的亚群(LNs)和脾(图4(一)TSC1 KO小鼠)明显高于在WT老鼠,Ki67-positive treg(图的比例更高4 (b))。此外,我们还研究了Th17细胞的数量,平衡免疫反应对亚(18),发现的数量和百分比Th17细胞减少LNs和脾脏TSC1 KO小鼠比WT老鼠(图4 (c))。Th1提供有效防止细菌感染。我们还检测到的人口Th1效应细胞,发现的数量和比例在LNs Th1细胞减少,脾脏TSC1 KO小鼠相比WT老鼠(图4 (d))。确定增加直接诱导单核细胞亚群的TSC1 KO小鼠单核细胞(CD11b排序+Ly6C+Ly6)从WT, TSC1 KO小鼠和cocultured亚(CD4细胞+CD25+)或CD4+幼稚T细胞(CD4细胞+CD62L+CD4从WT小鼠获得的)。无显著差异在扩散treg cocultured与单核细胞从TSC1 KO获得或WT老鼠(图4 (e))。然而,当与WT老鼠相比,有较低的百分比Th17细胞和CD4细胞的亚群比例更高+幼稚T细胞与单核细胞从TSC1 cocultured KO小鼠(图4 (f))。这些发现表明,间接引起单核细胞亚群的增加,它可能参与Th17细胞亚群之间的平衡。当考虑TSC1 KO单核细胞细胞因子表达的变化,我们推测,Th17细胞的减少可能与细胞因子的变化。我们对待WT单核细胞与天真的CD4 cocultured+有或没有il - 10 T细胞治疗和发现,il - 10可能减少的百分比Th17细胞(图4 (g))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.5。大量的单核细胞产生的活性氧TSC1 KO相比WT老鼠
之前有研究表明,活性氧(ROS)参与亚群之间的不平衡和Th17细胞(19,20.];因此,我们评估由单核细胞ROS的产生。在CD11b+Ly6c+ 单核细胞从TSC1 KO小鼠,活性氧产量高于WT老鼠。这种差异是当单核细胞(CD11b消除+Ly6C+ )获得TSC1 KO小鼠被拉伯(图5)。因此,ROS的生产力mTORC1活化的单核细胞有关。
3.6。在一次大肠杆菌感染,单核细胞的抗原呈递功能削弱。此外,激活T细胞和炎性细胞因子的拒绝TSC1 KO小鼠
在细菌感染,我们发现TSC1 KO小鼠免疫反应受损,这点可以从更多的细菌在血液中,促炎细胞因子的浓度较低,和更大的TSC1 KO小鼠的死亡率。因此,我们计算百分比和CD4的数量+LNs效应T细胞和脾脏WT TSC1 KO小鼠。我们发现百分比和激活CD4的数量+效应T细胞减少TSC1 KO小鼠相比WT老鼠(图6(一))。更少的LNs效应T细胞和脾脏TSC1 KO小鼠可以解释为抗原呈递功能受损TSC1 KO小鼠的单核细胞。考试后的辅活化因子单核细胞细菌感染后,我们发现表达辅活化因子(即减少。CD40、CD86 mhc ii和CD14)从TSC1 KO小鼠和WT老鼠。然而,CD80和TLR4表达无显著差异(图6 (b))。为了证明如果辅活化因子的表达较低导致TSC1 KO小鼠CD4激活越少+效应T细胞,我们进一步确定天真的CD4细胞的扩散+从WT或获得的T细胞与单核细胞cocultured TSC1 KO小鼠的体外系统。天真的CD4细胞的扩散+T细胞减少TSC1 KO小鼠相比WT老鼠(图6 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
在这项研究中,我们使用了一个新颖的myeloid-specific模式Tsc1删除和本构mTORC1活动阐明mTORC1单核细胞功能,这在一定程度上模拟在单核细胞的行为大肠杆菌感染。在细菌感染,我们发现更多的细菌在血液中,低浓度的促炎细胞因子和高死亡率TSC1 KO小鼠相比WT老鼠。这些数据表明,TSC1 KO小鼠的免疫反应受损。探索之间的关系mTORC1单核细胞的激活和抑制免疫反应,我们进一步确定亚群的比例和数量,抑制免疫反应,发现亚群的数量明显高于TSC1 KO小鼠相比WT老鼠。同时,Th1的数量显著降低TSC1 KO小鼠相比WT老鼠。在单核细胞扩展mTORC1函数的分析,我们发现单核细胞从TSC1 KO小鼠受损Th17细胞分化,在减少的数量和比例Th17细胞体内和体外。TSC1 KO单核细胞产生il - 6、il - 10, TGF -β少,ROS和干扰素-γ,il - 1β和肿瘤坏死因子-α相比WT老鼠。考虑由TSC1 KO单核细胞细胞因子表达的变化,我们对待WT单核细胞与天真的CD4 cocultured+与il - 10 T细胞,发现Th17细胞减少的百分比。对Th17和亚群之间的平衡18),这可能导致更多的亚群LNs TSC1 KO小鼠和细胞和脾脏coculture实验。因为Treg数字增加,CD4细胞+效应T细胞减少,细菌感染的免疫反应似乎削弱了TSC1 KO小鼠。有趣的是,我们发现低表达CD40、CD86, mhc ii,和单核细胞CD14获得TSC1 KO小鼠和WT老鼠,这表明TSC1 KO单核细胞的抗原呈递功能受损。因此,我们cocultured单核细胞从TSC1 KO和CD4 WT老鼠+天真天真的CD4 T细胞,发现扩散+T细胞减少TSC1 KO小鼠相比WT老鼠。
单核细胞是一种免疫细胞有许多功能,如对抗感染,将抗原,抑制免疫力。当感染细菌,单核细胞可以吞噬病原微生物或毒素,然后呈现抗原T细胞启动免疫反应(21]。在我们的研究中,我们发现更多的血液中的细菌和更高的死亡率TSC1 KO小鼠WT老鼠相比,表明mTORC1的国防能力受损后激活单核细胞。在没有感染的情况下,比例和TSC1 KO小鼠的亚群数量高于WT老鼠,表明本构mTORC1活动可能引发更多的亚群。在细菌感染,比例和激活效应CD4的数量+在TSC1 KO小鼠T细胞减少。这些结果表明,mTORC1-mediated能力受损抵御细菌可能是部分受免疫抑制和免疫过程的开始。
TSC1 KO小鼠的单核细胞,我们发现水平的提高TGF -β、il - 10、il - 6的分泌。il - 6可能提高生产IL-1ra和il - 10,从而抑制炎症反应(22,23]。先前的研究已经表明,超表达的il - 10和TGF -β可以诱导亚(24- - - - - -26]。然而,亚cocultured TSC1 KO单核细胞不显著增多。解释的减少Th17细胞体内和体外,我们假设Th17细胞亚群的平衡可能是由mTORC1通过上述细胞因子激活。先前的研究表明,il - 6可促进Th17细胞分化[27]。然而,il - 10可以促进Treg增殖和抑制Th17细胞分化[28),这与我们的数据是一致的。这些结果表明,mTORC1激活单核细胞可以调节平衡Th17细胞亚群的il - 10但不是il - 6。此外,抗原stimulation-dependent Th17细胞分化是由增加的表达CD40L在T细胞,导致增加DC活化和il - 6生产(29日,30.]。在我们的研究中,减少单核细胞表达CD40和陪同CD40L在T细胞的表达下降可能导致Th17细胞分化和减少treg归纳。这可能是另一种机制,通过这种机制mTORC1单核细胞控制Th17细胞亚群之间的平衡。
在低氧培养条件下,亚代被证明是抑制拉伯(31日]。巨噬细胞可以调节T细胞反应产生活性氧和亚群ROS-dependent的方式(21]。这样的活性氧产量的变化并不与拉伯TSC1 KO小鼠,观察表明亚群是ROS-dependent的生产。有趣的是,ROS生产TSC1 KO单核细胞增多,但在KO小鼠减少细菌杀死。这可能是因为显著降低效应CD4的数量+T细胞和Th1 TSC1 KO, CD4的杀菌效果+T细胞比ROS和Th1更强大。在未来这将需要进一步澄清。
菌血症期间,当单核细胞作为抗原呈递细胞,单核细胞可以诱导一些辅活化因子的表达来增强其抗原呈递功能。例如,CD40和mhc ii,所需抗原表示幼稚T细胞,诱导B细胞和T细胞激活(32]。的超表达CD40在装甲运兵车,CD80和CD86可以诱导和激活T细胞,导致增强免疫反应(33,34]。在我们的研究中,辅活化因子(即。,CD40,CD86, and MHC-II) were decreased in monocytes from TSC1 KO mice when compared to WT mice, suggesting that APC function in monocytes is impaired and results in a lowered ability to induce proliferation of naïve CD4+T细胞。虽然单核细胞在抗原呈递细胞的作用是非常有限的树突细胞相比,它可以部分解释效应CD4的减少+T细胞在TSC1 KO小鼠和天真的CD4细胞的增殖能力较低+T细胞cocultured TSC1 KO单核细胞。众所周知,toll样受体4 (TLR4)被激活的脂多糖(LPS),革兰氏阴性细菌外膜的一个组件,如大肠杆菌,与TLR4的接触可能会导致生产的促炎介质(35]。绑定的有限合伙人CD14在质膜启动TLR4信号(36)和有限合伙人转让TLR4 / MD-2复杂诱因促炎细胞因子的生产(37]。在我们的研究中,我们观察到在CD14表达减少,不变的TLR4的表达,从单核细胞和炎症细胞因子水平下降TSC1 KO小鼠,表明细胞因子生产CD14-dependent。
在几个辅活化因子,CD40是一个关键的表面活化剂表示不同的免疫细胞,如内皮细胞、单核细胞、B细胞、DCs和角化细胞(33,38]。为了应对炎症,CD40增加绑定CD40L的表达,一个分子而不是表达基底条件下调节特别是在T细胞和血小板刺激后(39]。CD40L-CD40交互导致增加粘附分子的表达和释放炎症介质从内皮细胞和白细胞40]。从TSC1 KO小鼠单核细胞CD40的表达低于WT老鼠后大肠杆菌感染,这表明CD40表达降低可能导致,至少部分,无效激活的T细胞。的表达CD40是由一些细胞因子,如肿瘤坏死因子-α干扰素-γ和il - 141,42]。肿瘤坏死因子-的低表达α干扰素-γ、il - 1和CD40 TSC1 KO小鼠单核细胞的牵连,CD40的表达可能是由激活mTORC1通过降低TNF的表达α干扰素-γ和il - 1。
有趣的是,炎性细胞因子的变化和costimulatory分子TSC1 KO小鼠的单核细胞与先前的研究结果不一致(43- - - - - -45]。这些研究的结论与我们的相冲突的结果,如巨噬细胞来源于单核细胞。TSC1/2复杂被发现是一个重要的抑制因子对巨噬细胞活化,M1极化和组织炎症44]。当前知识的角色TSC1/2-mTOR关系在天生的炎症是矛盾的46,47]。组织环境本身就是一个巨噬细胞表型的主要控制器,可以影响很多基因的表达无论原产地(48]。巨噬细胞存在于炎症病变,但在外周血单核细胞循环。不同的组织环境中可能的一个原因来解释不同的结果。此外,我们使用大肠杆菌感染而不是TLR刺激(LPS);大肠杆菌有许多毒力因素,包括有限合伙人,胶囊,1型菌毛,和P菌毛(49]。LPS刺激的结果并不能完全代表炎症的事件的结果大肠杆菌感染(50];因此,改变TSC1KO与单核细胞巨噬细胞可能是不一致的。
总之,mTORC1激活单核细胞导致间接增加亚群和免疫反应减弱,这在细菌感染起着有害的作用。拉伯mTORC1信号的抑制剂,可以挽救的有害影响,为临床治疗提供一个新的方向。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
一派方和Huaijun你设计的研究和实验。一派方,郭魏,范Ting雪,杨小燕,Yazhi杨,钱广域网进行实验。一派方、施Zhexin Xulong詹分析数据。一派方和诗绚王写的手稿。
确认
本研究通过免疫组(π:小明冯教授)在实验血液学国家重点实验室。作者要感谢小明冯教授(实验血液学国家重点实验室,中国医学科学院)LysMCreTsc1,Tsc1,Rosa-LysMCreTsc1老鼠和徐教授Yuanfu(实验血液学国家重点实验室,中国医学科学院)提供大肠杆菌。这项工作是由江西省主要学科和技术领袖培训计划(2014 bcb22009)和中国国家自然科学基金(81260231)。
补充材料
LNs和脾脏细胞与抗体孵化(anti-CD4-APC, anti-CD8-PE / Cy7、anti-CD62L-FITC anti-CD44-PerCP / Cy5.5)在黑暗中30分钟,然后用染色缓冲区。血样处理红细胞裂解缓冲和PBS含有2%的边后卫洗一次。大约一百万白细胞和抗体孵化(anti-CD11b-PE / Cy7 anti-Ly6G-APC / Cy7 anti-Ly6C-PerCP / Cy5.5 anti-CD80-PE / Cy7 CD40-PE / Cy7 anti-CD86-PE, anti-CD14-FITC, anti-MHC-II-APC,和anti-TLR4-PE)在黑暗中30分钟,然后用染色缓冲区。细胞用流式细胞分析仪测定(美国BD FACSCanto II)。数据分析使用FlowJo软件(美国Treestar)。