文摘

牙周炎是一种慢性炎症性疾病,影响牙周组织。最近的研究表明牙周和心血管疾病之间的联系。然而,详细的分子机制尚不清楚。之前的研究已经表明实验性牙周炎引起血清淀粉样蛋白A (SAA)的肝脏和外周血ApoE-deficient作为动脉粥样硬化小鼠模型。SAA是一种影响系统性炎症急性期蛋白。本研究的目的是调查atherosclerosis-onset机制使用人类主动脉内皮细胞(HAECs) SAA的刺激在体外。动脉粥样硬化PCR数组和qPCR分析显示upregulation粘附分子,如细胞间粘附molecule-1血管细胞粘附molecule-1, E-selectin HAECs SAA刺激。此外,结果表明,toll样受体,TLR2,可以作为一个重要的受体HAECs SAA的。此外,小核RNA) TLR2抑制粘附分子的upregulation HAECs SAA的刺激。我们的研究结果表明,通过TLR2 SAA刺激粘附分子的表达。SAA可能是牙周病引起的动脉粥样硬化的重要分子。

1。介绍

牙周炎,在人类最常见的疾病之一,是一种传染性的疾病,会导致炎症牙周组织的破坏(牙槽骨、牙骨质、牙周韧带和齿龈)(1]。牙周疾病是公认的风险或系统性疾病的因素包括动脉粥样硬化血管疾病、糖尿病、风湿性关节炎、阿尔茨海默氏症和癌症(2- - - - - -9]。

冠心病的患病率和发病率在牙周炎患者显著增加,表明牙周病独立预测冠心病(10]。最近的观察性研究支持的系统回顾和荟萃分析牙周和动脉粥样硬化血管疾病之间的关联,这是独立于已知的混杂因素,但因果关系还没有建立11,12]。

血清淀粉样蛋白A (SAA),急性期蛋白,明显调节在应对感染和慢性炎症(13- - - - - -15]。SAA刺激血管细胞表达细胞因子、趋化因子、粘附分子和基质金属蛋白酶(16),与动脉粥样硬化的发展。此外,高水平的SAA外周血与牙周炎显著相关,和SAA含量减少牙周炎患者牙周治疗后(17,18]。

最近,证据可能的牙周炎和动脉粥样硬化之间的联系增加了,和可能的协会和因果关系是被调查19,20.]。Hujoel等人报道的一个重要的一般趋势牙周treatment-induced抑制全身炎症和动脉粥样硬化和血管内皮功能的改善非侵入性标记物(19]。然而,详细的periodontitis-induced动脉粥样硬化的分子机制尚不清楚。

本研究的目的是调查atherosclerosis-onset机制使用人类主动脉内皮细胞(HAECs) SAA的刺激在体外。在这里,我们表明,刺激的HAECs SAA导致粘附分子的感应,这可能是导致通过toll样受体、TLR2。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和SAA的治疗

HAECs买来Lonza (cc - 2535;日本东京)和用于所有实验。HAECs是内皮细胞培养基上培养2 (EBM-2)中提供的EBM-2子弹工具包(Lonza、Tokyu、日本)37°C公司为5%₂。Subconfluent通道6细胞用于实验。HAECs镀在1.5×10⁵细胞/在6-well subconfluence盘子和培养。1.5细胞被处理μg / mL重组人类SAA (PeproTech落基山,NJ)为0、1、3和6 h。

2.2。PCR阵列分析

从使用NucleoSpin HAECs RNA提取的总RNA II (Macherey-Nagel Diiren,德国)。合成第一链cDNA使用RT执行²第一缕工具包(试剂盒、东京、日本)后,制造商的指示。人类动脉粥样硬化RT²分析器™PCR阵列(多环芳烃- 038 z)(试剂盒、东京、日本)应用于ABI 7000实时PCR系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。RT²分析器™PCR数组为人类动脉粥样硬化包含应对压力的84个基因,细胞凋亡,血液凝固和循环,粘附分子,分子细胞外,脂质运输和代谢,细胞生长和增殖。此外,该数组包含五井各种看家基因,基因组DNA污染控制,三个复制反转录控制,和三个复制PCR正值控制。数据分析使用网络分析软件》(http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php)。

2.3。qPCR分析

互补脱氧核糖核酸合成了1μg总RNA使用Revetra Ace qPCR大师混合(Toyobo,大阪,日本)。qPCR执行与雷鸟SYBR qPCR混合(Toyobo、大阪、日本)和TaqMan普遍掌握混合二世(应用生物系统公司,培育城市,CA)使用ABI 7000实时PCR系统。SYBR绿色引物(SELS, ABCA1、ABCA7 SCARB1, CD36, TLR2 TLR4 CST3, FPR2,蒸机,和GAPDH)被Primer3设计软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)(表1)。每个基因的表达是规范化GAPDH级别(SYBR绿色)。TaqMan引物(TLR2 Hs01872448_s1;MYD88 Hs01573837_g1;NFKB1m Hs00765730_m1;肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),Hs01113624_g1;E-selectin(希利),Hs00950401_m1)从生活购买技术(日本东京)。每个基因的表达是规范化18 s rRNA (4319413 e,应用生物系统公司,促进城市,CA)水平(TaqMan)。信使rna表达水平之间的褶皱变化确定如下:褶皱变化=,在那里对照组(Ct,循环阈值)。

2.4。RNA干扰

HAECs转染了TLR2消音器选择预先设计小干扰RNA (siRNA ASO0ZS41;生命技术、日本东京)使用Lipofectamine 2000转染试剂(生命技术、东京、日本)根据制造商的指示。HAECs (1.5×10⁵细胞/)被播种在6-well板块在转染前24小时。然后,细胞转染核对抗TLR2在最后10 nM的浓度。细胞培养用siRNA EBM-2中24小时。然后,介质被新的取代介质和细胞培养48 h。HAECs与SAA之前收获那么刺激。TLR2可拆卸的被qPCR验证。控制核从生活购买技术。

2.5。西方墨点法

HAECs细胞溶解了30分钟在冰上裂解缓冲(Bio-Rad,里士满,CA) 1μ克/毫升蛋白酶抑制剂。细胞碎片被离心(14000×g 4°C, 15分钟),和上层的收集和储存在−80°C到使用。总蛋白样品(30μ每g)煮5分钟,解决10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳三羟甲基氨基甲烷/甘氨酸/ SDS缓冲液(25毫米三、250毫米甘氨酸和0.1% SDS),并涂抹到转移膜(Bio-Rad,里士满,CA) (100 V, 1.5 h, 4°C)。在TBST阻塞2 h后(20毫米Tris-HCl、150毫米氯化钠和0.1%渐变20)含5%干脱脂牛奶、膜清洗三次在TBST和探测18 h在4°C anti-TLR2单克隆抗体TL2.1(最终浓度:1μg / mL;Abcam, Cambridge, MA)和反β肌动蛋白单克隆抗体(1:1000稀释;细胞信号技术,贝弗利,TBST MA)。在TBST三洗后,细胞膜是孵化horseradish-peroxidase-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 2000稀释;细胞信号技术,贝弗利,MA)然后在TBST洗五次。发现了蛋白质乐队使用ECL试剂(通用电气医疗集团,沃基肖,WI)根据制造商的指示。

2.6。统计分析

使用SPSS软件统计分析v . 15.0 J为Windows (SPSS Inc .,芝加哥,IL)。数据表示为平均值±标准偏差。学生的t以及用于比较。意义是接受。

3所示。结果

3.1。SAA诱发HAECs粘附分子

探索atherosclerosis-related基因SAA-stimulated HAECs,我们使用一个人类动脉粥样硬化RT²分析器™PCR数组(图1)。HAECs 0 h和6 h之间的比较与SAA表示特定刺激后上调(> 5倍)的13个基因包括BIRC3 (baculoviral IAP重复包含3)CCL2(趋化因子(碳碳主题)配体2),CCL5[趋化因子(碳碳主题)配体5],CCR2(趋化因子(碳碳主题)受体2)CSF2[集落刺激因子2 (granulocyte-macrophage)], FGA(纤维蛋白原α链),ICAM1(细胞间粘附molecule-1) IL1A(白介素1α)、生活(白血病抑制因子(胆碱能分化因子)],NFKB1(核因子k光多肽基因增强剂b细胞1),希利,TNFAIP3(肿瘤坏死因子,alpha-induced蛋白质3),和VCAM1(血管细胞粘附molecule-1)(图1和表2)。因此,粘附分子,如ICAM1 VCAM1,希利可能在HAECs调节炎症条件下。在这些分子,希利基因的表达显著(232倍)。因此,南非航空公司可能有一个重要的角色在白细胞粘附级联。

3.2。TLR2由SAA在HAECs受体分子调节

识别基因相关的白细胞粘附级联,我们筛选SAA受体高表达在HAECs SAA刺激(图2)。SAA受体,如SELS(葡萄糖稳态和ER应激),ABCA1, ABCA7, SCARB1(胆固醇流出),CD36, TLR2 TLR4 CST3(炎症信号),FPR2(趋化性和免疫细胞的激活),和蒸机(淀粉样变),已报告之前(21]。在候选人受体,TLR2 mRNA表达显著诱导HAECs SAA,表明SAA TLR2可作为一个重要的受体。因此,SAA可能刺激通过TLR2粘附分子的表达。

3.3。SAA诱发TLR2白细胞粘附级联后及其相关基因

探讨白细胞粘附引起的级联SAA, mRNA表达检查(0,1,3,6 h在HAECs SAA刺激后(图3)。TLR2 mRNA表达调节时间的方式。此外,NFKB1的mRNA表达,TNF -α后,希利明显调节3 h SAA刺激。这些基因的mRNA表达明显高于在SAA-stimulated HAECs相比之下,如果HAECs。然而,只有MYD88的mRNA表达低SAA-stimulated HAECs相比之下,如果HAECs。这些结果表明,SAA影响下游TLR信号和诱发白细胞粘附cascade-related基因。

3.4。击倒TLR2的影响通过白细胞粘附级联希利的表达

确定TLR2的贡献作为希利SAA受体表达,TLR2撞倒了转染核。我们确认具体击倒的TLR2 qPCR和免疫印迹(数字4(一)和4 (b))。没有发现差异在细胞形态在HAECs转染TLR2 siRNA(图4 (c))。沉默的TLR2用siRNA导致显著减少希利mRNA的表达与细胞转染与控制siRNA SAA刺激下(图5)。此外,NFKB1的mRNA表达和肿瘤坏死因子-α在SAA刺激被沉默TLR2废除。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现,SAA诱导粘附分子,特别是希利,TLR2可能是这个过程的一个关键受体HAECs。据我们所知,这是第一个报告表明TLR2扮演了一个角色在HAECs SAA受体诱导粘附分子,可能参与动脉粥样硬化的发病。

的mRNA表达粘附分子,包括ICAM1 VCAM1,和希利显著调节(> 5倍),SAA刺激在HAECs(图1)。E-selectin对初始轧制的相互作用是重要的中性粒细胞,单核细胞、自然杀伤细胞和记忆T细胞发炎内皮的子集(22,23]。白细胞滚动期间被捕被绑定的白细胞整合蛋白介导的免疫球蛋白超家族成员,如VCAM-1 ICAM-1,由内皮细胞表达(24]。

动脉粥样硬化的初始步骤包括外周血白细胞的粘附激活内皮单层,直接绑定白细胞迁移到内膜,单核细胞向巨噬细胞和成熟及其脂类物质的吸收,产生泡沫细胞(25]。多个成员selectin、整合素和免疫球蛋白基因家族的过程中最初的依恋(滚动),稳定的附着力(逮捕)传播,最终血球渗出顺序参与动脉粥样硬化的发病(25]。基于PCR结果数组,SAA诱发粘附分子,从而可能引发动脉硬化发病。

几位SAA受体已报告之前21]。其中,TLR2的表达显著增加(约30倍)在SAA刺激(图2)。我们确认upregulation SAA TLR2在mRNA和蛋白水平的刺激,和SAA希利的表达增加与白细胞粘附在HAECs级联。正常内皮细胞表达TLR2在一个非常低的水平(26]。因此,我们的研究结果表明,TLR2可能是一个重要受体HAECs SAA诱导粘附分子。

基于qPCR TLR2下游分子信号(图的分析3),SAA刺激对他们表达有显著的影响。特别是,白细胞级联(即的表达式。、NFKB1和TNF -α)是调节后感应SAA TLR2的刺激。此外,分析HAECs转染核反对TLR2的表达差别显示对这些白细胞(NFKB1和TNF -α时间的方式)和希利(图5)。

在信号通过TLR2 MyD88有着至关重要的作用。刺激后,TLR新兵IL-1R-associated激酶通过适配器MyD88和诱导活化增殖作用的蛋白激酶和核因子-κB (NF -κB) (27]。NF -κB激活诱导促炎细胞因子,包括TNF -α和趋化因子(28]。此外,在人类内皮细胞粘附分子,如E-selectin由NF -诱导κB和肿瘤坏死因子-α(29日]。然而,在当前的研究中,mRNA的表达MYD88是减少SAA-stimulated HAECs, NFKB1 mRNA表达,TNF -α和希利是调节。我们推测,SAA可能诱发NF -κB,肿瘤坏死因子-α部分,E-selectin通过通过TLR2 MyD88-independent通路。事实上,流行病学等人最近报道的小说功能电车/ TRIF TLR2-mediated信号转导(30.]。然而,还需要进一步的研究来调查的详细机制MyD88-dependent或MyD88-independent信号通路与SAA HAECs治疗。

5。结论

我们的研究结果表明,TLR2后可能会有关键作用诱导粘附分子TLR2信号和白细胞级联SAA-stimulated HAECs(图6)。和SAA可能预测牙周炎患者动脉粥样硬化发病的危险标志。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持科研补助金从教育部(25862065),日本的文化、体育、科学和技术。作者感谢教授n Yoshinari和k博士Kubokawa松本牙科大学的建议和讨论的过程中这项工作。