文摘

目前的研究是测量程序的表达死亡1 (PD-1)和程序性死亡ligand-1 (PD-L1),以及它的子宫颈癌患者的临床意义。我们的结果表明,不同患者T细胞亚群PD-1宫颈癌有很高的表达,和DCs PD-L1的高表达。Treg细胞上高表达PD-1宫颈癌患者促进生产的TGF -β和il - 10,但抑制干扰素的生产γ。宫颈癌高架PD-1和PD-L1 mRNA的表达水平。PD-1表达式在宫颈癌患者外周血与肿瘤分化、淋巴结转移和侵袭性。PD-1 / PD-L1通路抑制淋巴细胞增殖,但增强的分泌il - 10和TGF -β体外。总之,我们的研究结果表明,高浓度的PD-1 / PD-L1 TGF -β,子宫颈癌患者的外周血il - 10可能会消极地对宫颈癌细胞和调节免疫反应导致宫颈癌的进展。因此,PD-1 / PD-L1途径可能在未来成为一个免疫治疗的目标。

1。介绍

宫颈癌的发病率和死亡率居全球第二位,在所有女性生殖道恶性肿瘤(1]。手术、放疗和/或介入化疗是最常用的治疗宫颈癌的治疗方法,但其影响仍然有限。肿瘤免疫学和分子生物学的发展,生物治疗已成为恶性肿瘤(第四处理方法2]。在新疆维吾尔族妇女宫颈癌的发病率明显高于其他民族的女性,平均发病年龄在43岁3]。在新疆自治区,宫颈癌严重威胁维吾尔妇女的健康和生活质量,已成为一个重要的公共卫生问题4]。

编程death-l (PD-1)是最近发现costimulatory T细胞表面的分子结合PD-ligand进行抑制第二信号。程序性死亡ligand-1 (PD-L1) costimulatory信号B7家族中的一员和肿瘤免疫反应中起着重要的作用5]。PD-L1广泛表达于各种免疫细胞、上皮细胞和人类肿瘤细胞(5]。PD-1,免疫抑制性受体表达在淋巴细胞激活过程中,是PD-L1的受体。没有找到存在PD-1分子在静止T细胞和B细胞(6]。已经证明PD-L1高度表达在人类肿瘤细胞和抗原递呈细胞在肿瘤微环境。PD-L1与表面PD-1 T细胞,抑制肿瘤抗原T细胞的活化,诱导T细胞对肿瘤细胞的免疫耐受。这可能是一种重要的肿瘤细胞逃避免疫监视的机制(5- - - - - -7]。在目前的研究中,我们检测PD-1 PD-L1,以及相关细胞因子在宫颈病变发展过程,并分析变化之间的相关性PD-1 / PD-L1和CD4 + T细胞、CD8 + T细胞,Treg细胞来评估是否可以用作PD-1 / PD-L1宫颈癌的早期临床预警指标。

2。材料和方法

2.1。病人

共有78名患者(年龄范围,36-60年;平均年龄, 年)第一次被诊断为宫颈癌阴道镜病理检查在我们医院2010年1月至2014年10月被包括在本研究(宫颈癌组)(表1)。另一组53名患者治疗宫颈上皮内瘤(CIN)阴道镜病理检查26-58岁(平均水平, 年)被包括为CIN组(表2)。此外,40名健康志愿受试者24 - 66岁(平均水平, 年)作为正常对照组。没有统计上的显著差异在三组之间的年龄。排除标准包括(i)糖尿病史,(2)高血压、心血管疾病(3),(iv)怀孕,(v)急性或慢性传染病或转移性肿瘤。组织学及临床分期的宫颈癌患者进行根据FIGO分期标准于2000年出版。所有程序都是新疆医科大学伦理委员会批准。书面通知同意了所有的病人或他们的家庭。

表1
宫颈癌患者的临床特征。
表2
临床特征的患者宫颈上皮内瘤(CIN)。
2.2。流式细胞术

外周血单核细胞(PBMCs)分开5毫升静脉血使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法。检测PD-1,两整除PBMCs (20μL)与APC-CD4混合、PECy7-CD25 PE-PD-1, FITC-CD8抗体(20μL)和APC-CD4、PECy7-CD25 PE-IgG, FITC-CD8抗体(20μ分别每L)。然后,孵化前的混合物都摇动了在黑暗中在室温下15分钟。后来,磷酸盐(PBS)的混合物被洗前增加400的两倍μL PBS resuspend细胞。PD-L1的检测,一个整除PBMCs (20μL)混合PERCP-CD11c和PE-PD-L1抗体(20μL),和其他PBMCs整除(20μL)混合PERCP-CD11c和PE-IgG (20μL)。摇晃后,混合物在室温下是孵化前15分钟在黑暗中与PBS洗两次。然后,400年μPBS是添加到resuspend细胞。样本准备后,他们受到流式细胞术使用流式细胞仪咏叹调II(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)的检测PD-1表情CD4 +和CD8 + T细胞表面和PD-L1表情树突状细胞(DC)表面。

2.3。酶联免疫吸附试验(ELISA)

转化生长因子-的内容(TGF)β白介素- 10 (IL)和干扰素(IFN)γ在血清测定使用ELISA试剂盒(Bender MedSystems,维也纳,奥地利)根据制造商的手册。450纳米的光密度是衡量使用读者(ELx800;美国BioTek Winooski, VT)。

2.4。定量实时聚合酶链反应(存在)

外周血(5毫升)收集从早上空腹健康受试者和病人和血浆中提取。三组的总RNA提取PBMC使用试剂盒(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。互补脱氧核糖核酸的合成第一链进行使用Fermentas工具包(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)根据制造商的协议。引物的序列PD-1(289个基点)TGCAGCTTCTCCAACACATC(上游)和CTGCCCTTCTCTCTGTCACC(下游)。引物的序列PD-L1(101个基点)CCTGGAGGTTTCGAGATTCA(上游)和GGCAAAGCCAAGGTACTCC(下游)。引物的序列β肌动蛋白(233个基点)TAGGCGGACTGTTACTGAGC(上游)和TGCTCCAACCAACTGCTGTC(下游)。PCR反应体系(20μL)使用SYBR-Premix TaqTM II交货根据制造商的手册(豆类、东京、日本)。PCR反应条件在95°C变性30年代,紧随其后的是40个周期95°C的5 s和60°C 30年代。数据分析使用iQ520标准版光学系统软件V2.0 (Bio-Rad、大力神、钙、美国)。β肌动蛋白是作为内部控制。的 方法被用来确定周期数Ct值对应于一个特定的荧光阈值和量化目标基因。实验至少重复3次。信使rna表达水平的比率对目标基因β肌动蛋白。

2.5。MTT实验和仪珠阵列(CBA)测定

淋巴细胞和DCs分开宫颈组织与anti-CD3标记抗体(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)和anti-CD11c抗体(表达载体,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)。淋巴细胞(CD3 +)和DCs (CD11c +)分离使用mac系统(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)。细胞的密度是1×10的调整6使用rpmi - 1640细胞/毫升的媒介。然后,100年μL细胞悬液加入96 -文化板块(1×105细胞/ 72 h)种植。阻止PD-1 / PD-L1通路,anti-PD-L1抗体(最终浓度为2μg / mL)添加在孵化前72 h。细胞分为正常对照组、控制+ anti-PD-L1抗体群,CIN组,CIN + anti-PD-L1抗体群,宫颈癌组和子宫颈癌+ anti-PD-L1抗体组。刺激器加入一定量ConA介质(最终浓度的3μg / mL),其次是孵化有限公司37°C的5%272 h。MTT试验进行分析淋巴细胞增殖。文化上层清液从每组受到CBA试验测定il - 10和TGF -β的水平。

2.6。统计分析

所有结果分析了使用SPSS 16.0统计软件(美国、IBM、纽约Armonk)。数据被表示为±标准差。组间比较年龄进行使用 以及。组间差异比较用方差分析。比较组间进行使用 测试。

3所示。结果

3.1。不同的宫颈癌患者T细胞亚群有高表达PD-1和DCs PD-L1的高表达

测量PD-1表达式在DCs的T细胞和PD-L1表达,流式细胞仪采用。数据表明,CD4 + T细胞的比例没有显著不同的正常对照组、CIN组和子宫颈癌组( )(数据1(一)和1 (b))。CD4 + PD-1 + T细胞的百分比,CD8 + PD-1 + T细胞,或CD4 + CD25 + PD-1 + Treg细胞在正常对照组明显不同,CIN组和子宫颈癌组( 对于所有)(数据1(一)- - - - - -1 (e))。此外,PD-L1 + DCs的百分比显著不同的三组中( )(数据1(一)和1 (f))。这些结果表明,不同的子宫颈癌患者T细胞亚群有高表达PD-1和DCs PD-L1的高表达。

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图1
PD-1表达式在DCs的T细胞和PD-L1表达。(一)代表流仪测量的情节的内容(b) CD4 + T, (c) CD4 + PD-1 + T, (d) CD8 + PD-1 + T, CD4 + CD25 + PD-1 + Treg (e),和(f) PD-L1 + CD11b + DC在正常控制,CIN和宫颈癌组。 与对照组相比, 相比之下,CIN组。
3.2。高表达PD-1 Treg细胞在宫颈癌患者促进生产TGF -β和il - 10,但抑制干扰素的生产γ

确定内容相关的细胞因子与PD-1 PD-L1, ELISA和相关性进行了分析。数据显示TGF -的水平β、il - 10和干扰素-γ宫颈癌组织中明显不同,CIN组和对照组( )。在宫颈癌患者中,TGF -的水平β和il - 10明显增强,干扰素-水平γ是显著降低(图2)。CD4 + CD25 + PD-1 + Treg之间的相关性分析和TGF -β干扰素-γ或il - 10表明,CD4 + CD25 + PD-1 + Treg呈正相关,TGF -β和il - 10 ( 和0.323,分别地)和与干扰素-负相关γ( )(图3)。这些结果表明,高表达PD-1 Treg细胞在宫颈癌患者促进生产TGF -β和il - 10,但抑制干扰素的生产γ。

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图2
内容与PD-1 PD-L1相关的细胞因子。ELISA进行测量TGF -的水平β、il - 10和干扰素-γ在正常控制、CIN和宫颈癌组。 与对照组相比, 相比之下,CIN组。
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图3
CD4 + CD25 + PD-1 + Treg之间的相关性分析,(一)TGF -β、(b) il - 10或(c)干扰素-γ。安装线(a)和(b)表示正相关,而线(c)显示负相关。
3.3。宫颈癌提升PD-1和PD-L1 mRNA的表达水平

测量的mRNA表达PD-1 PD-L1,使用中存在。数据显示的mRNA水平PD-1和PD-L1都增加疾病病情加重,与mRNA水平宫颈癌组显著高于对照组( )(图4)。结果表明,宫颈癌提升PD-1和PD-L1 mRNA的表达水平。

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图4
PD-1和PD-L1的信使rna表达水平。存在是用来测量(a) PD-1 mRNA水平和(b) PD-L1 mRNA水平在正常控制,CIN和宫颈癌组。 与对照组相比, 相比之下,CIN组。
3.4。PD-1表情CD8 + T的宫颈癌患者相关肿瘤分化、淋巴结转移和侵袭性

进一步测试PD-1表达外周血如何影响基于PD-1的表达的临床特点+CD8 + T细胞,我们研究临床特征如年龄、肿瘤分期、组织学类型、肿瘤分化、淋巴结转移、肿瘤直径、侵入深度和肿瘤转移。数据显示PD-1的表达与肿瘤分化CD8 + T有关,淋巴结转移、肿瘤转移( ),但不是年龄,肿瘤分期、组织学类型、肿瘤直径,或侵入深度( )(图5)。结果表明,PD-1表情CD8 + T与宫颈癌相关分化、淋巴结转移、肿瘤转移。

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图5
PD-1关系表达式的CD8 + T宫颈癌患者和(a)年龄、肿瘤分期(b), (c)组织学类型、肿瘤分化(d), (e)淋巴结转移、肿瘤直径(f), (g)侵入深度和(h)肿瘤转移。 而没有“ ”。
3.5。PD-1 / PD-L1通路抑制淋巴细胞增殖,但提高的分泌il - 10和TGF -β在体外

调查的影响PD-L1淋巴细胞增殖和分泌il - 10和TGF -β,PD-L1被ConA封锁使用anti-PD-L1和刺激。MTT试验表明,宫颈癌组淋巴细胞增殖和CIN组明显低于对照组( )。然而,封锁PD-L1宫颈癌组显著提高淋巴细胞增殖( )(图6(一))。CBA试验表明,il - 10的水平和TGF -β在淋巴细胞文化上层清液从宫颈癌组和CIN组显著高于控制( )。添加anti-PD-L1抗体后,il - 10的水平和TGF -β显著降低( ),但仍显著高于控制( )(数据6 (b)和6 (c))。这些结果表明,PD-1 / PD-L1通路抑制淋巴细胞增殖,但提高的分泌il - 10和TGF -β体外。

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图6
PD-L1对淋巴细胞增殖和分泌il - 10和TGF -β。Anti-PD-L1抗体被用来阻止PD-L1。(一)使用MTT测定淋巴细胞增殖测定。(b) il - 10和(c)的浓度TGF -β文化的上层清液使用CBA试验测量。 与对照组相比, 与宫颈癌+反PD-L1组; 相比之下,CIN + anti-PD-L1组。

4所示。讨论

PD-1是一个重要的免疫调节分子属于消极CD28 / CTLA-4家庭。PD-1包含了四个重要的细胞外IgV-like领域N-linked糖基化的网站可以用其配体PD-L1或PD-L2绑定。它在免疫反应中扮演监管角色进行抑制性信号通过immunoreceptor tyrosine-based抑制主题(8]。Konishi等人发现非小细胞肺癌的高表达PD-1 T淋巴细胞(9]。杨等人发现调节PD-1 / PD-L1表达呈正相关的过程和程度CIN HPV感染引起的(10]。在目前的研究中,我们发现PD-1 / PD-L1通路调节CIN患者,和TGF -的水平β和il - 10是高架,符合杨et al。进一步研究的结果表明,PD-1表面表达CD4 + T细胞和CD8 + T细胞,PD-L1表情DC表面,和mRNA表达PD-1 PD-L1在宫颈癌患者显著增强,在CIN组高于。随着宫颈病变的发展,PD-1水平升高,这表明PD-1 / PD-L1表达与宫颈病变的发展密切相关。PD-1 / PD-L1信号通路促进宫颈癌的发生可能通过抑制T细胞的免疫功能。

Hamanishi等人报告,PD-1表达和CD8 + T渗透学位卵巢癌病人的预后(呈低度负相关,11]。施等人发现PD-1的表达显著增强肿瘤及其邻近组织,促进细胞凋亡的CD8 + T细胞与肝癌细胞(12]。另一项研究表明,PD-1在CD8 + T细胞抑制抗肿瘤免疫效应阶段(13]。一项研究声称,激活PD-1 / PD-L1信号通路导致免疫抑制肿瘤微环境的形成,帮助肿瘤细胞逃避免疫监视和破坏,并阻止PD-1 / PD-L1信号通路逆转肿瘤免疫微环境(14]。另一项研究表明,肿瘤细胞逃避T细胞识别通过上调PD-L1表达式(15]。PD-1和PD-L1抑制TCR-mediated停止信号,导致T细胞耐受。

我们发现增加PD-1 + CD8 + T与肿瘤分化、淋巴结转移、肿瘤转移。高表达PD-1 CD8 + T细胞可以抑制清除CD8 + T细胞对肿瘤细胞的影响。因此,肿瘤扩散是促进和入侵和转移发生。Heeren等人宣称的宫颈癌淋巴结转移与PD-1的增加+T细胞和PD-L1+装甲运兵车,导致宫颈癌的发展和转移(16]。

我们先前的研究证明Treg细胞增加宫颈癌病变的加重。我们推测,Treg细胞肿瘤细胞的免疫逃避中扮演很重要的角色17,18]。另一份报告显示,激活Treg细胞表达PD-1和发挥效应机制通过PD-1 / PD-L1通路(19]。北泽俊美等人发现阻塞的PD-1 / PD-L1通路抑制抑制Treg细胞功能和恢复CD25-T CD4 +细胞的增殖(20.]。PD-1信号干扰的分泌多种细胞因子(21]。炎症介质如il - 1和- 2诱导的表达PD-L1产生反馈抑制作用(22]。TGF -β和il - 10表达也可以帮助抗原呈递细胞通过STAT-3 PD-L1施加负调控效应(23]。绑定后与PD-1 PD-L1激活T细胞,T细胞的抗肿瘤作用是抑制24]。目前的研究表明,TGF -的浓度β以及il - 10的升高而IFN -γ降低宫颈癌。相关分析表明,PD-1表达Treg细胞与TGF -呈正相关β并与干扰素- il - 10但负相关γ,这表明PD-1 / PD-L1参与通过TGF - Treg细胞的抑制机理β和il - 10。这是推测PD-1 / PD-L1信号通路在调节潜在影响Treg细胞的免疫抑制作用在宫颈癌患者中,导致疾病的恶性肿瘤。

研究还表明,PD-L1 DC细胞可以抑制T细胞的活化作用和溶解肿瘤细胞有时会导致肿瘤特异性T细胞的凋亡。阻塞的PD-L1增强免疫治疗的疗效。研究表明,PD-L1积极P815肿瘤细胞抵抗免疫疗法,但阻止PD-L1恢复anti-CD137单克隆抗体疗法的效果(25]。PD-L1也表达了对肿瘤抗原递呈细胞,调节T细胞介导抗肿瘤效应通过PD-1 / PD-L1信号通路(26]。通过阻断PD-1 / PD-L1信号通路,CD8 + T细胞增殖的肿瘤微环境可以恢复,和更多的效应可以产生细胞因子和细胞毒性的酶。此外,肿瘤抗原CD8 + T细胞可以分泌更多的干扰素-γ。这些事实支持猜测PD-1 / PD-L1途径阻断疗法可用于增强抗肿瘤免疫(27,28]。使用PD-L1抗体阻止PD-1 / PD-L1途径,本研究发现淋巴细胞增殖和分泌il - 10和提升TGF -β减少后PD-L1阻塞。杨等人的报告,PD-1 / PD-L1途径抑制细胞免疫,导致CIN(的发生和发展10]。我们的结果表明,PD-1 / PD-L通路抑制T淋巴细胞增殖,促进分泌的TGF -β和il - 10,导致宫颈癌的亚群增殖分化的微环境,最终导致的肿瘤细胞逃避免疫系统。PD-L1表达在肿瘤细胞增强抗原T细胞的凋亡。因此,阻断PD-L1降低T细胞凋亡。最近的研究表明,肿瘤微环境与肿瘤浸润淋巴细胞的损耗PD-L1由肿瘤细胞分泌或tumor-derived骨髓细胞。阻塞PD-1 / PD-L1信号通路增强效应CD8 + T细胞功能,抑制Treg细胞和myeloid-derived抑制细胞的功能,并增加了抗肿瘤免疫效应(29日- - - - - -31日]。因此,阻断PD-1 / PD-L1途径治疗宫颈癌可能有助于恢复T细胞增殖能力在肿瘤微环境中,产生更多的效应细胞因子,对宫颈癌和增强免疫作用。

总之,目前的研究发现,upregulation PD-1 T细胞和PD-L1 DCs在宫颈癌可以抑制T细胞增殖和功能在肿瘤微环境中,导致免疫抑制,促进肿瘤的生长和转移。结果之间的相关性变化PD-1 / PD-L1和Treg细胞表明PD-1 / PD-L1信号通路可能发挥其免疫抑制TGF -通过Treg细胞及其影响因素β和il - 10,导致子宫颈癌的发生。目前的研究提供了一个新的想法,阻断PD-1 / PD-L1信号通路使用PD-1或PD-L1抗体可能会提供一个免疫治疗宫颈癌的治疗方法。

相互竞争的利益

所有作者声明没有金融或非金融相互竞争的利益。

作者的贡献

陈参会,楠楠彭日成和荣Du贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了新疆重大疾病重点实验室开放项目(没有。sklib - xjmdr - 2014 - 12),乌鲁木齐城市重点实验室开放项目(无感染和肿瘤。智慧- 2013 - 02),中国博士后科学基金会项目(没有。2014 m562486)。