文摘

背景。我们的研究旨在观察钠葡萄糖的影响cotransporter-2 (SGLT2抑制剂dapagliflozin)在糖尿病动脉粥样硬化和随后的调查机制。方法。主动脉粥样硬化在链脲霉素诱导糖尿病ApoE诱导^−−/通过与高脂肪饮食喂养老鼠,dapagliflozin管理intragastrically为12周治疗。dapagliflozin对指数的影响葡萄糖和脂肪的代谢,il - 1β地震,NLRP3蛋白质含量和活性氧(ROS)测量。评估了动脉粥样硬化油红O和hematoxylin-eosin染色。dapagliflozin在il - 1的影响β在培养生产主要的野生型和NLRP3巨噬细胞^−−/基因敲除小鼠机制进行了调查分析。结果。Dapagliflozin治疗显示良好的对葡萄糖和脂肪代谢的影响,部分逆转动脉粥样硬化的形成,抑制巨噬细胞浸润和增强病变的稳定性。同时,降低il - 1的生产β、地震、NLRP3蛋白、线粒体ROS在主动脉组织中检测到与dapagliflozin治疗。在体外,NLRP3 inflammasome被hyperglucose和hyperlipid ROS途径激活。结论。Dapagliflozin可能是治疗糖尿病动脉粥样硬化引起的潜力高脂肪饮食,这些好处可能取决于il - 1的分泌的抑制作用β巨噬细胞通过ROS-NLRP3-caspase-1通路。

1。介绍

先前的证据从流行病学研究表明,心血管疾病(心血管病)已成为最严重的并发症糖尿病(DM),即为DM患者死亡率和发病率的主要原因。很好理解,DM患者病理生理的变化,主要是高血糖毒性的血管的内皮细胞和其他细胞,可能会导致动脉粥样硬化的发病机制和后续心血管病。尽管所谓的糖尿病动脉粥样硬化的关键病理生理机制并不完全确定,慢性炎症反应,和相关的脂质沉积,巨噬细胞浸润和平滑肌细胞增殖在DM建议扮演重要角色(1- - - - - -3]。

最近,interleukin-1β(il - 1β)和interleukin-18(地震)被认为是两种炎性细胞因子导致糖尿病动脉粥样硬化的发展(4),这些细胞因子的潜在机制下游被评估。固有免疫与炎症反应的激活身体的。固有免疫识别有关的分子模式(抑制)和其分子模式(pamp)通过模式识别受体(PRRs),从而激发炎症反应并启动防御机制(5]。NLRP3, nod样受体和胞内PRR,已建议上述病理生理过程中起着关键的作用。NLRP3可以由几种不同的激活外源性和内源性刺激信号形成multiprotein复杂称为NLRP3 inflammasome。先前的研究表明,配体结合NLRP3能促进inflammasome并激活caspase-1的形成,最终促进pro-IL-1的成熟和分泌β和pro-IL-186,7]。最近的研究证实,NLRP3 inflammasome参与炎症反应在动脉粥样硬化的发病机制。事实上,激活NLRP3 inflammasome在巨噬细胞参与胆固醇晶体形成动脉粥样硬化的发病机制8]。此外,NLRP3基因的沉默已经发现老鼠延缓动脉粥样硬化的进展(9]。虽然il - 1β(10,11和地震12proatherosclerosis)已经提出,是否通过的监管功能NLRP3 inflammasome仍有待确定。

钠葡萄糖cotransporters-2 (SGLT-2)抑制剂是一类新的抗糖尿病的药物目标对肾葡萄糖重吸收。Dapagliflozin SGLT-2抑制剂,于2012年上市。dapagliflozin血糖降低的效果已被证实在许多随机对照临床试验显示尊贵的降低影响dapagliflozin糖化血红蛋白(HbA1c),空腹血糖和餐后血糖(13,14]。此外,除了糖尿病作用,dapagliflozin似乎也护心,通过降低血压(15[],减少体重16),甘油三酯和尿酸17,18],以及改善胰岛素抵抗[19]。最近,一些研究表明,SGLT-2抑制剂可能通过抗炎作用发挥他们的代谢疾病的好处20.,21]。然而,整个dapagliflozin对动脉粥样硬化的影响在DM和涉及的潜在益处,例如,对il - 1的影响β地震-细胞因子和NLRP3 inflammasome系统,没有评估。随机对照临床试验证明,dapagliflozin可以单独用于治疗2型糖尿病患者和具有良好的效果在降低糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹血糖、餐后血糖(13,14]。有趣的是,dapagliflozin可以改善心血管疾病的糖尿病稍微降低血压(15[],减少体重16),甘油三酯和尿酸17,18],以及改善胰岛素抵抗[19]。此外,还有试验表明SGLT-2抑制剂能降低血清和器官的炎症标记物,从而降低动脉硬化的程度的糖尿病动物模型20.,21]。然而,在炎症标记物SGLT-2抑制剂的影响,包括NLRP3 inflammasome和il - 1β地震-细胞因子尚未完全阐明。目前尚不清楚是否SGLT-2抑制剂可以影响动脉粥样硬化进展。积累知识dapagliflozin对动脉粥样硬化的影响和它的底层机制能给我们带来更多的信息对其安全性和实用性在诊所。

本研究的目的是探索的影响dapagliflozin在糖尿病和非糖尿病患者ApoE主动脉动脉粥样硬化^−−/老鼠和检测可能的潜在机制,尤其是对ROS-NLRP3-caspase-1通路的影响。

2。方法

2.1。老鼠

自发的载脂蛋白E基因敲除(ApoE粥样硬化病变^−−/)后小鼠血胆脂醇过多被广泛使用作为动脉粥样硬化小鼠模型在先前的研究22]。,我们在研究中使用该动脉粥样硬化小鼠模型。简单地说,男性ApoE 40^−−/老鼠(6周大,北京HFK生物科学有限公司有限公司)和6雄性C57BL / 6 j小鼠(6周大,第三军医大学实验动物中心)都是饲养的动物房间第三军医大学第一附属医院。具体情况如下:SPF环境温度(18-26°C)、相对湿度(55%),和12 h光/ 12 h暗周期。动物笼子和饮料瓶定期消毒,舍是高压蒸汽消毒,和动物间定期与紫外线灯消毒。经过一周的住宿,载脂蛋白e^−−/老鼠被喂食高脂肪饮食(HFD,一般饮食+脂肪(油)15% + 79.85%吉士粉+ 5%胆固醇0.15%)诱导动脉粥样硬化的动脉,而C57BL / 6 j小鼠喂食普通饮食。动物食物购买实验动物中心的第三军医大学第三附属医院。男性ApoE^−−/老鼠(12周大,20到24 g)是腹腔注射STZ (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)的剂量130毫克/公斤溶解在100毫米柠檬酸缓冲(pH4.5)诱发糖尿病,而控制仅接受缓冲盐水。一个星期后,我们测量了所有小鼠的血糖水平使用一个(Abbott糖尿病保健公司。本研究Xceed)通过尾静脉穿刺取血样。4周后,小鼠血糖> 16.7更易与l作为糖尿病组根据先前的研究[23),和non-STZ-injected ApoE^−−/小鼠作为非糖尿病患者组。糖尿病和非糖尿病的小鼠被随机分配到治疗组()和对照组(分别)。治疗组的小鼠intragastrically dapagliflozin(阿斯利康)1.0毫克/公斤/天12周的治疗,而C57BL / 6 j小鼠和对照组的小鼠intragastrically车辆1.0毫克/公斤/天。所有动物收到人类保健和研究协议被批准的机构动物保健和使用委员会第三军医大学前的性能。

2.2。代谢测量

腹腔内注射STZ后,小鼠的血糖和体重每周测量。在28周的时代,所有老鼠8 - 12小时禁食,然后由腹腔内注射10%水合氯醛麻醉。此后,通过轨道静脉血液收集然后离心机(4°C, 3000 r×15分钟)分离血清。血清的一部分被用来检测血清总胆固醇浓度(总胆固醇)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl - C)、低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)和游离脂肪酸(FFA)在临床实验室的第三军医大学第一附属医院,其余的被保存在−80°C的测量血清水平的NLRP3, il - 1β和地震- ELISA试剂盒(上海Jinglai生物科技、上海、中国)根据试剂厂家提供的方法和程序。

2.3。量化的动脉粥样硬化病变区域

通过轨道静脉采血后,小鼠的主动脉与脂肪切除手术显微镜下解剖。主动脉根与10月然后做成5嵌入μ冰冻切片。此后,部分干,浸泡在60%异丙醇10分钟,沾油红O(美国O0625 Sigma-Aldrich)工作流体(3:2)10分钟,分化在异丙醇3 - 10年代到间质清晰,然后用水洗。获得的部分与梅尔counter-stained苏木精,分化在1% Hcl-alcohol 30年代,法蓝与自来水,小心翼翼地干过滤文件,并与glycogelatin安装。上段主动脉在4%多聚甲醛溶液固定,嵌入在石蜡,分段5μm。脱水后,部分是沾hematoxylin-eosin (Beyotime,中国上海)。相邻脂肪去除后,上段胸主动脉和腹主动脉断然放置在幻灯片,分化在60%异丙醇10分钟,油红O染色工作流体(3:2)3 h,分化在60%异丙醇6 - 7次到背景色变成了白色,然后拍照。损伤的面积部分的主动脉和主动脉根计算使用Image-pro + 6.0 (MediaCybernetics, Inc .)。

2.4。Immunofluorescent染色

主动脉根的冻结部分是固定ice-acetone 10分钟,添加0.3%的x - 100使细胞膜permeabilized Triton,阻塞和5% BSA在室温下1 h。然后他们在一夜之间被封锁在4°C与初级抗体(MOMA-2抗体1:50,Abcam;sma抗体1:400年,σ),在室温下孵化3 h使用二次抗体(1:200和1:400)保护抗原抗体结合光的颜色。最后他们复染色细胞核与DAPI荧光增白剂的安装。巨噬细胞和平滑肌肌动蛋白共焦荧光显微镜下观察(780年蔡司LSM)和积极的彩色巨噬细胞和平滑肌细胞自动分析和量化Image-pro + 6.0。

2.5。ROS化验

探讨主动脉粥样硬化病变ROS水平,孤立的动脉都满载着她(1μmol / L) 30分钟37°C。ROS是共焦荧光显微镜下观察(780年蔡司LSM),和她对氧化变红荧光。

2.6。隔离和文化从骨髓巨噬细胞

WT和NLRP3^−−/KO雄性老鼠骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)是通过区分骨髓。短暂,骨髓细胞被刷新的股骨和胫骨,剩下的细胞保持在不同的媒介。BMDMs被维护在巨噬细胞分化培养基(DMEM和csf (40 ng / mL,σ))为5天。中补充了10%的边后卫(Hyclone实验室),2毫米谷酰胺,青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100μg / mL)。对巨噬细胞测试dapagliflozin的直接行动,WT巨噬细胞被镀到无菌96孔板,与LPS刺激(100 ng / mL,σ)对3 h,然后,分别培养拥有0.2棕榈酸酯(PA,σ),高葡萄糖(HG, 33更易/ L)和PA + HG DMEM培养基24 h。最后与dapagliflozin中添加(12.5米)和new-prepared ATP(5毫米)30分钟。然后我们收集细胞培养的上清液测定il - 1的内容β用ELISA试剂盒(上海Jinglai生物科技、上海、中国)。测试PA或HG il - 1的行动路径β生产、WT NLRP3^−−/KO巨噬细胞被镀成6-well板,与LPS刺激3 h,然后,分别培养拥有0.2 PA, HG(33更易/ L)和PA + HG DMEM培养基24 h和收集细胞溶解产物测试NLRP3 caspase-1表达和免疫印迹。

2.7。免疫印迹

总主动脉组织均质。组织和细胞溶解产物被分离的蛋白质sds - page和进一步使用特定的抗体后涂抹:(anti-NLRP3抗体1:1000年,anti-ASC抗体1:1000年,anti-caspase-1抗体1:400年,anti-IL-1β抗体1:1000年,anti-IL-18抗体1:500)(罗福斯生物、利特尔顿有限公司,美国)。台风的膜进行扫描(法玛西亚、美国)和量化使用质量。实验重复3次。

2.8。统计分析

所有数据被当作手段标准偏差(MSD)。非参数秩和检验和方差分析(方差分析)应用于评估群体之间的差异。一个表明一个统计上的显著差异。所有统计分析进行SPSS (20.0, Inc .,芝加哥,美国)。

3所示。结果

3.1。代谢参数Dapagliflozin治疗后的变化

空腹体重、血糖和血脂水平的老鼠在每组测量研究表所示1。未发现重大改变体重在DM或non-DM ApoE^−−/老鼠收到dapagliflozin。然而,血糖的水平,总胆固醇,TG、FFA糖尿病的载脂蛋白e^−−/与非糖尿病患者相比ApoE老鼠明显增加^−−/老鼠。更重要的是,与dapagliflozin治疗后,空腹血糖下降了43% (DM ApoE)^−−/老鼠(TC),而高密度脂蛋白胆固醇,低密度脂蛋白水平仅仅是影响(图1)。

3.2。改变血清NLRP3 Inflammasome, il - 1β,地震后Dapagliflozin治疗

如表所示2与non-DM老鼠相比,DM小鼠血清水平有了显著提高NLRP3 (),il - 1β()和地震()。此外,血清il - 1β和地震水平在非糖尿病的对照组相比也明显增加与C57BL / 6 j组()。更重要的是,在12周的治疗后与dapagliflozin DM小鼠的血清水平NLRP3 (),il - 1β()和地震()蛋白质都显著降低,而NLRP3和地震水平没有显著影响(图2)。

3.3。ApoE Dapagliflozin减弱动脉粥样硬化病变的形成^−−/老鼠

主动脉的病理图像沾油红O的老鼠从每组如图3(一个)1 - 5。动脉粥样硬化病变的STZ-induced DM小鼠大60% non-DM ApoE的相比^−−/老鼠()。与正常C57BL / 6 j小鼠相比,non-DM载脂蛋白e^−−/小鼠动脉粥样硬化病变(262%的增量)。重要的是,dapagliflozin治疗与DM小鼠主动脉病变面积减少了34% ()。此外,dapagliflozin治疗也稍微减少non-DM组主动脉病变的形成。同样,病理分析主动脉根(图3 (b))也表明dapagliflozin治疗减少损伤的面积64% (在DM小鼠和21% ()在non-DM老鼠与控制。他染色石蜡切片显示,正常C57BL / 6 j小鼠的主动脉壁厚度均匀,观察动脉粥样硬化病变。在其他四组,主动脉壁,伴随着一系列的变化,包括动脉内皮增厚和主动脉壁不同区段,新形成的纤维帽和明显的动脉粥样硬化病变。胆固醇晶体的形成被发现在糖尿病组,和dapagliflozin治疗显著降低胆固醇晶体在糖尿病治疗组(图3 (c))。在一起,这些结果支持dapagliflozin治疗带来antiatherosclerotic DM小鼠的影响。

3.4。Dapagliflozin改变巨噬细胞和smc在动脉粥样硬化病变的内容

染色与特定标记的MOMA-2和主动脉组织αsma进一步确定dapagliflozin对细胞的影响在DM小鼠动脉粥样硬化病变的形成。我们发现巨噬细胞浸润增加动脉粥样硬化病变在DM ApoE dapagliflozin后正好相反^−−/老鼠(图4)。此外,dapagliflozin治疗也恢复平滑肌细胞的减少内容在DM ApoE病变^−−/老鼠(图4)。这些结果可能强调dapagliflozin改善动脉粥样硬化病变的漏洞,监管DM ApoE的细胞病变的形成^−−/老鼠。

3.5。Dapagliflozin对活性氧的影响生产和主动脉粥样硬化组织的炎性细胞因子水平

我们进行了ROS的测量来确定dapagliflozin对ROS的生成的影响在主动脉粥样硬化病变与她,发现糖尿病的载脂蛋白e^−−/小鼠血管ROS生产中演示了海拔和减毒dapagliflozin治疗(图5(一个))。与non-DM对照组相比,DM小鼠与NLRP3(增加有关),ASC (),caspase-1 (),il - 1β()和地震(在腹主动脉)的蛋白质,而dapagliflozin治疗在一定程度上抑制上述蛋白的表达在主动脉组织(图5 (b))。这些结果表明,dapagliflozin可以减少ROS生产和NLRP3 inflammasome激活在DM小鼠主动脉根。

3.6。Dapagliflozin对NLRP3 Inflammasome体外

调查dapagliflozin在巨噬细胞的直接影响,WT主要巨噬细胞治疗有限合伙人,然后PA或HG最后孵化dapagliflozin (12.5μ米)30米。Dapagliflozin不能直接激活或抑制NLRP3 inflammasome激活巨噬细胞(数字6(一)和6(b))。PA和HG刺激增加NLRP3和生产的il - 1的表达β在WT巨噬细胞,特别结合在一起。然而,在NLRP^−−/巨噬细胞的刺激作用有限合伙人+ PA + HG NLRP3的表达和il - 1的生产β几乎消失了(图6(c)和6(d))。

4所示。讨论

先前发现的临床研究已经表明,一些抗糖尿病药和降脂药物(如吡格列酮,他汀类药物,一类)与降低心血管事件有关2型DM患者(24- - - - - -26]。Dapagliflozin称为葡萄糖降低药物通过抑制SGLT-2功能,从而抑制肾葡萄糖重吸收。然而,代谢疾病的影响dapagliflozin它的好处和潜在的机制在糖尿病动脉粥样硬化的衰减尚未全面评估。在这项研究中,通过使用一个模型治疗的高脂肪饮食STZ ApoE−−老鼠,我们发现dapagliflozin治疗与脂质和糖代谢的重要指标的改善。此外,dapagliflozin部分逆转DM小鼠主动脉粥样硬化病变的形成,这些好处可能涉及抑制NLRP3 inflammasome。我们的研究结果强调的好处dapagliflozin衰减的糖尿病动脉粥样硬化和为在DM患者中的应用提供进一步的证据。

我们发现dapagliflozin在DM小鼠血糖降低效果显著,这与以前的研究结果是一致的(13,14]。有趣的是,它还减少了non-DM ApoE的血糖^−−/老鼠。治疗12周后,dapagliflozin显著降低TG、FFA水平,但不总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度DM的载脂蛋白e^−−/老鼠,这表明dapagliflozin在DM ApoE有利的脂质调节效应^−−/老鼠。寺崎的研究等。27]也评估dapagliflozin对血脂的影响,尽管这项研究的结果表明,dapagliflozin并没有显着影响的TG、FFA是不同于我们的。这可以解释为不同持续时间的dapagliflozin治疗2之间的研究,和四周dapagliflozin太短,以减少治疗糖尿病小鼠的TG、FFA水平。FFA扮演着一个重要的角色在刺激NLRP3 inflammasome激活和il - 1β和地震-炎症细胞因子释放28]。

我们随后的病理分析表明dapagliflozin显著抑制主动脉病变的形成和发展糖尿病的载脂蛋白e^−−/老鼠,这表明dapagliflozin会推迟糖尿病动脉粥样硬化的形成。底层机制的好处dapagliflozin在糖尿病动脉粥样硬化可能是多个,和长期改善葡萄糖和脂质代谢可能扮演重要角色。此外,抑制炎症反应在动脉粥样硬化的发病机制也可能参与进来。慢性炎症反应在糖尿病动脉粥样硬化中发挥着关键作用和巨噬细胞被认为是主要的细胞炎症反应。一方面,可以转化为泡沫细胞和巨噬细胞坏死泡沫细胞形成的脂质核心动脉粥样硬化病变的主要成分;另一方面,巨噬细胞是动脉粥样硬化病变的细胞构成的重要组成部分,和一些细胞因子分泌的细胞可能会改变当地的环境,导致不稳定的损伤和疾病的发展1,29日]。平滑肌细胞(smc)迁移到损伤是能产生胶原纤维损伤的纤维帽的主要来源。降低smc的纤维帽或增加巨噬细胞可以使纤维帽薄,容易断裂30.]。因此,抑制巨噬细胞浸润病变以及预防减少的smc已被视为治疗的目标来减少损伤破裂的脆弱性。在我们的研究中,发现dapagliflozin阻止巨噬细胞的浸润DM小鼠动脉病变的病灶,防止smc的损失,建议其有利于病变稳定。

在动脉粥样硬化病变的局部慢性炎症反应,NLRP3 inflammasome通过活性氧的生产被激活,这是有关释放il - 1β并从巨噬细胞的地震。我们的研究结果表明,DM小鼠血清NLRP3升高,il - 1β和地震-蛋白质与非糖尿病的老鼠相比,这可能与高葡萄糖和FFA的状态。周等人提出,高血糖的接触是一个重要的诱导物对il - 1的生产β的激活NLRP3 inflammasome在胰腺31日]。温家宝等人发现,高脂饮食引起的增加远期运费协议可以激活NLRP3 inflammasome在巨噬细胞32]。我们的研究发现,dapagliflozin可以降低血清NLRP3, il - 1β,地震-蛋白在糖尿病的载脂蛋白e^−−/老鼠和il - 1β在非糖尿病患者ApoE^−−/老鼠,这表明dapagliflozin的好处在糖尿病动脉粥样硬化可能涉及系统和地区抗炎作用,可能通过抑制NLRP3 inflammasome系统。此外,dapagliflozin抑制NLRP3的表达,ASC, caspase-1, il - 1β,地震- DM小鼠等表达也减少在非糖尿病患者动脉粥样硬化模型(无统计学意义)。

我们都知道,三种模式的激活NLRP3 inflammasome提议:信道模型,溶酶体破裂模型,和ROS模型(33]。所有NLRP3受体激动剂引发活性氧的生成,激活NLRP3 inflammasome通过ROS-sensitive thioredoxin-interacting (TXNIP)的蛋白质。氧化应激与动脉粥样硬化的重要贡献是建立了;例如,迪马克等人证明diabetes-accelerated动脉粥样硬化与ROS升高(34]。所以我们进一步测试的ROS水平主动脉粥样硬化病变。我们的研究结果发现,糖尿病,加速动脉粥样硬化与il - 1的增加有关β通过激活和地震NLRP3炎症的过程,包括活性氧的生成,与dapagliflozin预防和治疗糖尿病危害增加il - 1β地震和活性氧产量衰减加速动脉粥样硬化的发展主动脉根。我们也调查了行动的dapagliflozin NLRP3 inflammasome主要在培养巨噬细胞。PA或汞引起的激活NLRP3 inflammasome和il - 1的一代β在WT巨噬细胞,但在NLRP3操作被取消了^−−/巨噬细胞。Dapagliflozin没有直接作用于巨噬细胞。我们的结果表明,dapagliflozin可能抑制ROS-NLRP3通路通过降低血糖和脂质,然后降低il - 1的生产β和地震。我们所知,本研究首次阐明dapagliflozin治疗与抑制il - 1的分泌有关β巨噬细胞通过ROS-NLRP3-caspase-1通路在糖尿病动脉粥样硬化(图7)。潜在的抑制作用的分子信号下属dapagliflozin在NLRP3 inflammasome系统值得进一步评估。

5。结论

我们的研究结果表明,SGLT2抑制剂dapagliflozin可以减弱动脉粥样硬化病变的形成和增加稳定性的病变抑制NLRP3 inflammasome在糖尿病动脉粥样硬化,这为其好处在DM患者提供进一步的证据

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

weil愣,Xinshou欧阳同样对本文亦有贡献

确认

作者感谢阿斯利康提供dapagliflozin粉。这个项目是由中国国家自然科学基金(批准号30670838和30670838)。