文摘

17β雌二醇(E2)的主要性在雌性激素,与先天免疫的调制响应(IIR),和其水平变化在分娩有关乳房内的感染,如乳腺炎。在牛乳腺上皮细胞(bMECs) E2调节分化和增殖,但其免疫调节功能尚未探索。金黄色葡萄球菌是主要的病原体引起乳腺炎,坚持在bMECs细胞。这项工作的目的是分析是否E2调节期间bMECs的信息检索金黄色葡萄球菌内化。bMECs对待E2 (50 pg / mL, 24 h)减少细菌内化(~ 50%)。宿主受体α5β1和TLR2不参与减少。然而,E2激活ERα和调节IIR减少金黄色葡萄球菌induced-mRNA TNF的表达α(~ 50%)和il - 1β(90%)。E2也减少了这些细胞因子的分泌以及il - 6生产;然而,在感染bMECs, E2诱导il - 1的分泌β。此外,E2上调表达抗菌肽DEFB1, BNBD5, psoriasin S100A7(~ 5 -, 3 -, 3年来,职责)。此外,E2 bMEC培养基中诱导抗菌化合物的生产,,加上IIR的调制,可以减少有关金黄色葡萄球菌内化。

1。介绍

雌激素发挥至关重要的作用在正常的性和生殖功能的开发和维护。17β雌二醇(E2)是主要的和最有效的性荷尔蒙在雌性生殖阶段(1]。它的主要功能是与生殖有关,虽然也涉及不同的疾病,比如癌症、自身免疫性疾病、感染过程,先天免疫反应起着关键的作用[2]。在分娩期间在牛,牛的经验增加易感性在乳腺和子宫炎症疾病,例如,乳腺炎[3]。这种易感性增加与减少的功能组件的先天免疫反应和突然的变化性类固醇的水平。分娩和哺乳的发病组成广泛的性类固醇激素的变化。E2水平升高在上周突然分娩之前,峰值在过去3天前交付,崩解之后迅速下降和恢复基础值(3,4]。这些变化可能与乳房内的感染,如乳房炎的发病率。因此,Lavon et al。5)报道,与亚临床乳腺炎奶牛(没有明显迹象)表现出循环E2水平低。此外,E2在奶牛乳房炎的免疫调节作用与减少中性粒细胞迁移(6]。

大多数雌激素的基因操作,包括E2,由两个雌激素受体(人),ERα和ERβ,牛乳腺上皮细胞表达(7]。然而,很少有信息关于E2的免疫调节效应从牛乳腺上皮细胞。众所周知,E2需要乳腺上皮细胞增殖和导管的发展越来越多的动物7]。牛乳腺上皮细胞(bMECs)扮演相关角色在乳房内的感染,因为他们是亲密接触病原体负责乳腺炎和目标细胞内细菌引起慢性和亚临床感染,如金黄色葡萄球菌(8,9]。这种病原体可以持续很长一段时间在牛和由拉链的内化机制取决于fibronectin-binding蛋白质的存在(FnBPs)在细菌表面,以及纤连蛋白与宿主细胞的相互作用α5β1整合素,整合素都是及其配体(9]。这种机制在内化过程中使用金黄色葡萄球菌由bMECs [10]。此外,bMECs参与先天免疫反应的牛乳腺生产支持和抗炎介质,以及抗菌肽,一氧化氮,等等11,12),但E2的角色在这个反应还没有探索。考虑E2的免疫调节作用在不同的组织,它的目标之一是乳腺上皮细胞,这项工作的目的是分析是否这种激素调节的先天免疫反应在bMECs及其影响金黄色葡萄球菌内化。

2。材料和方法

2.1。试剂和抗体

17β从σ雌二醇收购,和工作的解决方案是溶解在1%乙醇(1 - 500 pg / mL)。所有的实验中,1%乙醇(车辆)被用作控制。生活/死BacLight细菌生存工具包(热科学)是获得分子探针。单克隆抗体阻断反α5β1整合素(MAB2514)和anti-TLR2 (TLR2.1)是获得微孔和Abcam,分别。的anti-phospho-ERα(2511年代,Ser118)从细胞信号和anti-ER获得β(517700)从生活技术收购。FITC-conjugated二级抗体老鼠和老鼠免疫球蛋白是从英杰公司买来的,热科学,分别。

2.2。金黄色葡萄球菌应变

的金黄色葡萄球菌无性系种群。葡萄球菌(写明ATCC 27543)使用应变。这个压力是隔绝的牛临床乳腺炎和有能力入侵bMECs [13]。金黄色葡萄球菌种植在一夜之间37°C Luria-Bertani肉汤(磅Bioxon)和cfu调整通过测量光密度在600 nm (OD 0.2 = 9.2×10⁷CFU /毫升)。

2.3。牛乳腺上皮细胞的主要文化(bMECs)

bMECs被孤立的肺泡组织健康泌乳奶牛的乳房如前所述[13]。从段落2 - 8细胞被用于所有的实验。bMECs培养在生长介质(通用)组成的DMEM培养基/营养混合物F12火腿(DMEM / F12K,σ)补充10%胎牛血清(Equitech Bio) 10μg / mL胰岛素(σ),5μg / mL氢化可的松(σ),100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,1μg / mL两性霉素B(表达载体)。这些细胞被种植在5%的股份有限公司₂气氛在37°C。执行E2和/或金黄色葡萄球菌挑战,极化层的bMECs(菜满6 - 10μ克/厘米²尖尾I型胶原蛋白,σ)培养的无血清DMEM / F12K无酚红(σ)和抗生素(不完整的媒介)24 h,然后他们用激素治疗和/或感染了细菌。

2.4。入侵检测

入侵检测,bMEC极化层使用(~ 10000细胞培养到96孔的平底盘子(康宁)),这是孵化与不同浓度的E2(1、5、10、50、150、300和500 pg / mL)在DMEM / F12K(σ)没有抗生素,血清,酚红(不完整的媒介)24小时,然后被感染金黄色葡萄球菌(MOI 30: 1每细胞细菌)。为此,bMECs注射细菌悬浮液从9.2×10的肉汤⁷CFU /毫升和孵化2 h公司5%₂在37°C。然后,这些细胞被洗了三次与PBS (pH值7.4)和孵化不完整的媒介,是补充了80年μg / mL庆大霉素1 h在37°C,消除细菌细胞外。最后,bMEC单层膜分离与胰蛋白酶- EDTA(0.05%)(0.02%)与250年(σ)和细胞溶解μL无菌蒸馏水。的bMEC溶解产物稀释100倍,镀在磅琼脂一式三份,孵化一夜之间在37°C。菌落的数量是由标准的菌落计数技术。bMECs培养的数量在每个板计算为每个入侵分析使用一个自动细胞计数(BIO-RAD TC20)。并给出了数据每bMEC CFU恢复的比率。

入侵检测的阻碍抗体的存在,一个小时之前添加金黄色葡萄球菌bMECs,阻止抗体反α5β1整合素或anti-TLR2分别添加(10和图5μg / mL, resp)一式三份油井。鼠免疫球蛋白(从正常大鼠血清蛋白质纯化A-sepharose珠子(σ))或鼠标免疫球蛋白(从正常小鼠血清和纯化获得从皮尔斯)被用作消极的控制。入侵检测进行了使用庆大霉素保护化验如前所述[13]。

2.5。bMEC可行性和金黄色葡萄球菌增长分析

确定E2在bMEC生存能力的影响,10000个细胞与不同浓度的激素在孵化24小时不完整的媒介在37°C 96 -孔板。然后,10μL 5毫克/毫升的3 - (4 5-dimethyl-2-thiazolyl) 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT,σ)在PBS溶液添加到每个和孵化4 h在37°C。最后,100年μL酸异丙醇(95%盐酸异丙醇,5% 1 N)添加到溶解甲瓒晶体。光密度测量的微型板块读者(BIO-RAD) 595海里。

bMEC可行性也测试用台盼蓝排斥试验和细胞计数自动细胞计数(BIO-RAD TC20)。

分析E2的效果金黄色葡萄球菌增长,9.2×10⁷CFU /毫升在磅肉汤培养在37°C。细菌悬浮液与不同浓度的激素治疗(1、5、10、50、150、300和500 pg / mL)和增长是监控turbidimetrically(600海里)超过24小时(测量吸光度,2,4,6,8日,12日和24小时)。评估金黄色葡萄球菌可行性的E2、细菌生长(如前所述)在磅肉汤和E2治疗24 h在一夜之间37°C。后,细菌被镀上磅琼脂在一夜之间,一式三份,被孵化37°C。菌落的数量是由标准菌落计数。

细菌生存能力也感染上层清液的化验分析。要做到这一点,bMECs接受E2和感染金黄色葡萄球菌如上所述。感染2 h后,并将回收的媒体获得的细菌颗粒是在10000转离心10分钟在4°C和与PBS洗了三次。的金黄色葡萄球菌生存能力是衡量使用现场/死BacLight细菌生存工具包(热科学)。颗粒是孵化等于卷(1.5毫升)的组件(SYTO 9染料,住指标)和组件B (propidium碘,死亡指标)在黑暗中在室温下15分钟。染色后细菌、颗粒与PBS洗了三次。10000事件的荧光信号测量和评估使用BD Accuri™C6血细胞计数器。此外,金黄色葡萄球菌增长也分析了使用E2-treated bMEC条件媒体。要做到这一点,细菌生长在一夜之间37°C,和一个金黄色葡萄球菌包含9.2×10悬挂⁷CFU /毫升(0.2 OD在600海里)是在37°C的环境与条件媒体2 h。然后,细菌被镀在磅琼脂在一夜之间,一式三份,被孵化37°C。cfu决心如前所述的数量。

2.6。受体通过流式细胞术分析

bMEC偏振膜培养在24-well菜(康宁)和服用E2 (50 pg / mL) 24 h和/或金黄色葡萄球菌如上所述。这个浓度选择考虑到细菌内化成bMECs上最高的抑制作用。治疗后,PBS的细胞被洗了三次,分离胰蛋白酶- EDTA(0.05%)(0.02%)(σ),在2500转离心10分钟在4°C,并与PBS洗。bMEC颗粒被正常山羊血清(5% PBS,皮尔斯)30分钟在4°C,然后细胞离心和颗粒主要抗体孵育anti-TLR2或anti-integrin分开。分析人的存在(ERα或呃β),细胞核从bMECs获得使用ProteoJet工具包(Fermentas)和程序继续如上所述。测量TLR2膜丰富(MA)或核存在的人,这些细胞被稀释的抗体孵育1:50 (PBS含有0.1% BSA) 1 h在4°C。整合素测定的妈,入侵检测进行了使用不同感染时间:30、60、120分钟控制bMECs或E2-treated (50 pg / mL,在24 h) bMECs。入侵检测完成后如前所述。细胞与反孵化α5β1整合素的浓度为10μg / mL 2 h在4°C。在所有情况下,主要的抗体孵育后,bMECs洗了三次PBS和孵化与相应的二次抗体(稀释1:50)(FITC-conjugated anti-mouse免疫球蛋白TLR2和ERα和FITC-conjugated anti-rat ER免疫球蛋白β和α5β1整合素)1 h在4°C在黑暗中颤抖。颗粒被离心分离回收、清洗和固定与多聚甲醛(4%)在4°C为10分钟,最后用PBS洗了三次。细胞在100年被暂停μPBS的L。10000事件的荧光信号测量和评估使用BD Accuri C6血细胞计数器。

2.7。MAP激酶的作用金黄色葡萄球菌内化成bMECs

极化bMEC单层膜栽培在乘96孔板涂层(Corning-Costar)和6 - 10μ克/厘米²尖尾I型胶原蛋白(σ)。孵化了bMECs E2 (50 pg / mL 24 h)。前入侵检测(30分钟,1或2 h), p38药理抑制剂(5μ米,SB203580)、物(20μ2.5 M, SP600125)或ERK1/2 (μ米,U0126 bMECs)分别被添加。感染分析有庆大霉素的保障进行分析如上所述。细胞溶解产物被镀在磅琼脂一式三份和孵化一夜之间在37°C。CFU数据与标准的菌落计数技术或决定金黄色葡萄球菌生存能力是衡量使用现场/死BacLight细菌生存工具包如上所述。0.1% DMSO(车辆)被用作控制。

评估MAP激酶激活水平,流式细胞术,bMECs是对待E2 (50 pg / mL),金黄色葡萄球菌,或者两者都是,样品(30μg蛋白质)是根据制造商的协议准备贴壁细胞(Becton Dickinson,德国)。pp38 (T180 / Y182), pJNK1/2 (T183/185)和pERK1/2 (T202 / Y204),使用抗体从Flex集仪测定其珠阵列(Becton Dickinson)根据制造商的协议。流仪分析使用BD Accuri C6和CBA分析FCAP软件(正)。3000事件后获得供应协议。每个磷蛋白质的最低检测水平是0.38 U /毫升pJNK和0.64 U /毫升pp38和活跃。

2.8。RNA隔离和RT-qPCR分析

层的bMECs培养在6-well菜(~ 5×10⁵),然后是孵化50 pg / mL的E2(24小时)和(或)金黄色葡萄球菌(MOI 30: 1) 2 h,如上所述。RNA与试剂盒提取试剂(英杰公司)根据制造商的指示。DNA污染被逐出RNA样本DNase我治疗(表达载体)。RNA被用来合成cDNA如前所述[10]。RT-qPCR分析都使用了比较Ct方法(ΔΔCt) StepOne +实时PCR系统(应用生物系统公司)根据制造商的指示。SYBR绿色的反应进行了PCR反应混合液(应用生物系统公司)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)用作内部控制。特定的引物对来自表达载体;序列和PCR条件用于放大不同牛mrna详细表1。

2.9。酶联免疫吸附试验(ELISA)

测量的TNF -α,il - 1β、il - 6和牛β-defensin 1 (DEFB1)浓度的介质,从bMECs条件媒体对待E2 (50 pg / mL)和(或)金黄色葡萄球菌收集。肿瘤坏死因子-的浓度α测量使用Duoset ELISA开发工具包(研发系统)来量化牛TNF -α根据制造商的指示,水平和il - 1的浓度β使用牛il - 1和il - 6评估β分别和il - 6的筛选工具(热科学)。测量的牛DEFB1 bMECs培养基进行了分析使用的酶联免疫试剂盒DEFB1 (MyBiosource)。

2.10。一氧化氮产量分析

一氧化氮(NO)分泌bMECs培养基是评估通过测量亚硝酸盐(NO浓度²⁻在媒体使用格里斯反应[游离16]。入侵检测后,过滤介质是0.22μM膜(微孔)消除细菌。

2.11。数据分析

获得的数据从三个独立的实验中,每一个都进行了一式三份(除了DEFB1 ELISA,在重复执行)相比,方差分析(方差分析)。结果报告为手段±标准错误(SE)和设置在显著性水平,除了RT-qPCR分析标准差和叠化值大于2所示或小于0.5被认为是显著差异表达mrna根据莫雷et al。17]。内化的结果分析、基因表达分析、丰富和受体膜细胞实验显示规范化处理车辆(1%乙醇)。

3所示。结果

3.1。雌二醇不会影响细菌生长和bMEC可行性

对E2的效果进行评估金黄色葡萄球菌增长和bMEC可行性,我们培养细菌或bMECs在不同浓度的激素(1 - 500 pg / mL)。细菌可行性分析通过计算菌落和MTT测定。结果表明,E2没有影响bMEC可行性后24 h文化(数字1(一)和1 (b)),它是由一台盼蓝排斥分析和MTT检测。同样,我们表明,E2并不影响细菌生存和增长(数字1 (c)和1 (d))。

3.2。雌二醇降低金黄色葡萄球菌内化到bMECs

确定E2的效果金黄色葡萄球菌内化到bMECs,我们庆大霉素保护进行化验。为了达到这个目标,bMECs不同浓度的激素治疗(1 - 500 pg / mL) 24小时之前与细菌的挑战。根据菌落的数量恢复,50 pg / mL的E2浓度显著抑制金黄色葡萄球菌内化到bMECs 50%(图2)。1的浓度、10和300 pg / mL也减少了20%的内化。其他浓度没有影响内化的金黄色葡萄球菌bMECs。考虑这些结果,在接下来的实验相关的规定的先天免疫反应bMECs E2,我们只分析了50 pg / mL的浓度。

3.3。α5β1整合素膜不需要丰富的内化金黄色葡萄球菌被E2

因为α5β1整合素是一种主要的上皮细胞在胞外受体金黄色葡萄球菌内化,我们想知道具体的功能性阻塞α5β1整合素修改bMECs内化的细菌的数量。为了验证这一点,主要文化bMECs治疗24小时与E2孵化与特定的抗体α5β1整合素(图3(一个))。E2治疗(50 pg / mL)的数量降低cfu内化到bMECs,但封锁α5β1整合素略减少这个数字(~ 20%)。此外,bMECs处理车辆~ 60%的减少金黄色葡萄球菌内部化的时候α5β1整合素被挡住了。这一发现表明,在的内化金黄色葡萄球菌到E2-treated bMECs,整合素α5β1不参与。

来决定是否与这个效果α5β1整合素基因表达,我们评估由RT-qPCR两个亚基的基因表达。金黄色葡萄球菌诱导的表达α5亚基()~ 8倍,E2调节亚基的表达。然而,两种治疗方法的效果是类似的效果金黄色葡萄球菌(图3 (b))。分析这种影响是否与α5β1整合素bMECs马,我们进行了流式细胞术分析。的平均荧光强度作为一个指示器的每个细胞整合素的表达水平。这种分析如图3 (c)。E2水平大大降低α5β马1整合素(~ 40%);然而,2 h后的挑战金黄色葡萄球菌的水平α5β马1整合素在类似的方式减少E2-treated的细胞。类似的效应也观察到当E2-treated bMECs被感染,表明整合素与细菌一起了。典型的人口资料的流式细胞术分析也显示在图3 (c)。我们另外评估的水平α5β马1整合素在不同时间的挑战金黄色葡萄球菌在E2-treated bMECs。这个评估的结果如图所示3 (d)。的存在α5β1整合素的膜bMECs减少从30分钟金黄色葡萄球菌挑战,表现出类似的行为控制和E2-treated细胞。尽管数据显示,E2降低整合素马(24小时治疗),这些结果表明,细菌能够诱导整合素贩运。因此,α5β马1整合素并不有助于减少内化中发现E2-treated bMECs(图2)。

3.4。监管TLR2 bMECs E2的表达式

探索是否TLR2参与的减少金黄色葡萄球菌内化到bMECs E2引起的,我们调查是否这个受体的封锁与特定的抗体会修改细菌内吞作用。如图4(一)TLR2的封锁导致的数量显著减少金黄色葡萄球菌内化(~ 50%);然而,略有减少检测E2-treated细胞(~ 15%)。令人惊讶的是,E2诱发TLR2基因表达(~ 3)(图4 (b))。正如我们此前报道(10),金黄色葡萄球菌诱发TLR2 mRNA表达(~ 3重);然而,两种治疗方法的效果是类似的效果金黄色葡萄球菌一个人。平均荧光强度(图的分析4 (c))表明,只有金黄色葡萄球菌(~ 1.4倍)增加了马TLR2,但没有区别马TLR2的E2和细菌的存在而获得感染。因此,TLR2不能参与金黄色葡萄球菌内化,它可能是灭活E2-treated bMECs。

3.5。激活TLR2 E2和信号通路金黄色葡萄球菌

接下来,我们评估是否E2 (50 pg / mL)诱发的激活MAPKs (p38、物或ERK1/2),由TLR2激活。最初,我们调查是否这些激酶参与金黄色葡萄球菌内化成bMECs使用药理抑制剂之前细菌入侵。bMECs,孵化(30分钟或1或2 h)与药理抑制剂p38 (5μ米,SB203580)、物(20μ2.5 M, SP600125)或ERK1/2 (μM, U0126)显示出相当大的减少金黄色葡萄球菌内化(~减少50 - 60%),表明这些激酶参与这个过程(图5(一个))。金黄色葡萄球菌内化被CFU计数、流式细胞仪分析,获得了类似的结果(图5 (b))。有趣的是,这些激酶不参与减少细菌引起的内化E2因为在抑制剂减少持续的存在。

此外,我们评估p38、物和ERK1/2磷酸化与E2-mediated减少他们的激活状态金黄色葡萄球菌内化成bMECs。当bMECs金黄色葡萄球菌挑战(2 h),基底激活p38没有修改,磷酸化JNK1/2增强,ERK1/2激活降低(图5 (c)),如我们之前报道18]。MAPK的车辆使用稀释0.1% DMSO,没有影响内化化验(数据没有显示),就像之前报道(18]。有趣的是,对待E2的bMECs证明减少p38磷酸化(~ 5倍),和ERK1/2激活水平也减少了~ 1-fold,但JNK1/2保持不变与控制细胞。当E2-treated细胞金黄色葡萄球菌挑战,p38激活水平增强;然而,JNK1/2和ERK1/2激活水平基本上没有改变。MAPK结果表明E2,细菌入侵之前,可以抑制bMEC炎症反应通过p38和ERK1/2失活。

3.6。E2诱发ER的激活α在bMECs

雌激素通过雌激素受体ERα和ERβ属于核受体超家族的转录因子。确定这些受体被激活在bMECs对待E2和/或感染金黄色葡萄球菌我们进行了流式细胞术分析。我们使用了一个anti-ERα抗体,承认其磷酸化同种型,作为一个指示器的激活。执行这些分析,我们孤立bMEC细胞核。在图6(一),我们表明,E2稍微诱发ER的激活α(~ 20%),期间回到了基底的水平金黄色葡萄球菌感染。关于ER的表达α信使rna,我们也观察到E2诱发其基因的表达(~ 5倍),但感染后感应(~ 25倍)(图高6 (b))。

关于呃β激活,我们进行了流式细胞术分析bMEC细胞核。在图6 (c),我们只显示bMECs感染金黄色葡萄球菌引起这种受体的激活在车辆或E2-treated细胞。然而,E2治疗不会引起ERβ激活。此外,ER的表达β信使rna在E2-treated和诱导两种金黄色葡萄球菌挑战bMECs(~ 3.5倍(图)6 (d))。bMECs的感染治疗激素保持调节的ER水平β(~ 2.5倍)。根据这些结果,我们推测,50 pg / mL E2激活bMECs通过ERα。

3.7。E2保持抗炎bMECs概要文件

接下来,我们探讨是否E2修改bMECs的炎症反应之前和期间金黄色葡萄球菌感染。我们关注(我)促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β和il - 6;(2)抗炎细胞因子(il - 10);(3)趋化因子,引发(图7)。关于促炎细胞因子,我们执行RT-qPCR mRNA表达和细胞因子分泌的评价elisa。bMECs E2治疗(50 pg / mL, 24 h)显著增加TNF -α和il - 1β信使rna表达(~ 7岁和三倍,resp。)(图7(一))。金黄色葡萄球菌还单独感染诱导的表达细胞因子(TNF - ~ 5倍α并为il - 1 ~ 3重β)。的存在金黄色葡萄球菌,E2-treated bMECs降低TNF的表达α和il - 1β信使rna。il - 6的表达保持不变在所有的治疗方法。有趣的是,在E2-treated细胞这些促炎细胞因子的分泌减少与bMECs处理车辆(图7 (c))。此外,50 pg / mL E2也减少肿瘤坏死因子的分泌αbMECs和il - 6的感染。只有il - 1的分泌β时增加E2-treated细胞被感染了金黄色葡萄球菌。在图7 (b),我们还表明,E2诱导il - 10的表达,引发mrna(~ 2.5和4.5倍,分别地)。感染诱导il - 10的表达,但在激素增加了表达)(~ 8倍。引发的表达没有修改的感染在车辆-和E2-treated细胞。的抗炎作用,这些结果指向E2 bMECs感染金黄色葡萄球菌。

3.8。E2对bMECs表达和分泌的抗菌分子

探索如果一些抗菌素介质被E2监管,这就可以解释的金黄色葡萄球菌内化,我们测量的可行性金黄色葡萄球菌在感染化验。在图8(一个),我们显示的可行性金黄色葡萄球菌从入侵检测得到的上层清液(2 h)。金黄色葡萄球菌用于入侵检测的E2-treated bMEC文化显示出减少可行性率降低(60%)相比,细菌恢复的上层清液vehicle-treated bMECs。这一结果表明,抗菌成分的培养基中bMECs 50 pg / mL的E2治疗。加强这些数据的目的,我们孵化金黄色葡萄球菌2 h 1毫升的条件从车辆获得媒体或E2-treated bMECs。根据图8 (b)的条件培养基E2-treated bMECs降低CFU的数量金黄色葡萄球菌(减少60%)。这些结果表明,E2-treated bMECs分泌抗菌成分。接下来,我们探讨一些抗菌元素是诱导的基因表达是否在E2-treated bMECs。图8 (c)显示了RT-qPCR分析不同的抗菌肽,其中几个β-defensins和1 psoriasin (S100A7)。E2的表达上调β-defensins牛defensinβ1 (DEFB1 ~ 5倍)和牛嗜中性粒细胞βDefensin 5 (BNBD5, ~三倍)。此外,E2诱发的表达psoriasin S100A7(~ 6.5倍)。在感染的存在,只有psoriasin S100A7信使rna诱导(~ 13倍)。其他肽分析保持不变与控制细胞。类似的行为中观察到的细胞治疗与E2和感染金黄色葡萄球菌,调节了psoriasin ~ 9倍的表达。考虑这些结果,我们测量的积累DEFB1 bMEC介质的ELISA。在图8 (d),我们表明,E2不诱导的分泌DEFB1培养基,刺激的感染。金黄色葡萄球菌感染E2-treated细胞减少的浓度DEFB1分泌单独感染的关系。因此,这不是细菌的机制内化E2-treated细胞减少。此外,没有被修改的分泌E2在bMECs(图的存在8 (e)),因此不参与减少内化中发现E2-treated bMECs。

4所示。讨论

众所周知,在产后时期,奶牛乳腺传染病的发病率增加经验,如乳腺炎。这种扩充频率与先天免疫系统的功能下降(3]。在此期间,E2水平升高在上周突然分娩之前,峰值在交付前的最后3天,和秋天之后迅速崩解和恢复基础值(3,4]。描述,雌激素都抗炎和促炎的功能,和他们的角色在调制先天免疫应答的上皮细胞在感染的记录(19]。它已经表明,E2乳腺上皮细胞增殖和导管发展需要越来越多的动物(20.]。此外,人的存在已被证明在这个组织(20.]。这项工作的目的是研究E2在bMECs的免疫调节功能金黄色葡萄球菌感染,到目前为止还没有开发。先前的报道显示牛E2的中性粒细胞免疫调节功能,我们评估E2浓度范围1 - 500 pg / mL (6]。细菌能够代谢性类固醇激素,如雌二醇(21]。因此,重要的是要分析E2是否改变金黄色葡萄球菌生存或发展。在孵化的时间和E2浓度的范围分析了我们没有检测E2的抑菌或杀菌作用金黄色葡萄球菌(图1)。在协议中,Hosoda et al。22)显示不同的类固醇激素没有杀菌金黄色葡萄球菌。此外,在浓度范围的测试,E2不是对牛乳腺上皮细胞的毒性。Sobolewska et al。23)报道,类似的E2和孕酮的浓度对自噬在48 h后bMECs起到刺激作用,这是隐含在退化的牛乳腺在干旱时期。在目前的研究中,我们不能丢弃的可能性与E2的孵化时间可能是这些细胞的细胞毒性。

在这项工作中,我们证明了50 pg / mL的E2明显抑制~ 50%金黄色葡萄球菌内化到bMECs(图2)。因为E2没有抗菌活性,减少可能的结果的免疫调节作用与这种激素有关。根据我们的结果,E2的效果金黄色葡萄球菌内化显示了非剂量反应曲线。这种行为需要进一步调查,然而;描述了非单调的E2在乳腺的发展在活的有机体内模型,以及在人类乳腺癌细胞。一个可能的解释可能与E2的多功能性行为,其中包括经典的基因组功能,以及nongenomic或membrane-initiated estrogen-signaling通路(24,25]。E2的抑制作用金黄色葡萄球菌内化不能归因于整合素的减少α5β1 MA因为这个受体不参与的内化金黄色葡萄球菌在E2-treated bMECs。此外,尽管E2降低α5β1 MA,细菌的存在促进了交通的早期感染(图3),正如我们先前的报道(10]。考虑到这一点,抑制金黄色葡萄球菌内化在E2-treated bMECs可以免疫调节通路的激活的结果。探索这种可能性,我们分析了受体TLR2参与这个过程。因此,结果如图4表明E2不诱导受体的马尽管上调其基因的表达。乳腺上皮细胞起着关键作用的监测乳腺组织在免疫细胞感染,因为他们帮助招聘和细菌识别通过TLR信号通路(26,27]。TLR2的主要受体金黄色葡萄球菌检测和调节免疫调节功能(28]。我们之前已经证明金黄色葡萄球菌马诱发TLR2和激活在bMECs以同样的方式,刺激乳腺分泌的催乳激素刺激金黄色葡萄球菌内化在bMECs [10]。E2显示了微分影响TLR2表达式和/或激活;例如,在THP-1细胞,它增加TLR2 mRNA的表达(29日),但牛输卵管上皮细胞培养,它减少了LPS-induced TLR2 mRNA表达(30.]。因此,E2 TLR2通路的激活依赖于组织和生物体的生理条件。同意没有TLR2激活E2-treated bMECs,我们发现,MAPK p38和ERK1/2灭活在这些细胞(图5)。此外,这些激酶抑制期间不工作金黄色葡萄球菌引起的内化E2(图5)。我们曾报道称,这三个MAPKs期间是必需的金黄色葡萄球菌内化到bMECs [18]。

我们接下来探索E2或感染是否调节人激活,因为这种激素是通过细胞内产生的直接影响人。在图6,我们表明,E2诱发的细胞内激活α,以及上调其基因的表达。同样的,金黄色葡萄球菌感染增加呃α信使rna表达的E2-treated bMECs,但这与ER感应无关α激活。在协议中,Yart et al。31日)报道,细胞系的bMECs MAC-T ER的表达αE2蛋白的增加反应治疗。然而,ER的激活α由感染还没有被广泛探讨。因此,河中沙洲et al。32)描述了有限合伙人的革兰氏阴性细菌降低ERα在内皮细胞蛋白质。ER的存在β从感染细胞核bMECs(图6 (c))表明这种受体的参与金黄色葡萄球菌感染,没有被报道。然而,流式细胞仪分析表明,E2不激活ERβ。总的来说,这些结果表明,E2激活ERαbMECs,可能直接或间接涉及的减少金黄色葡萄球菌内化。因为我们没有检测活化的MAPKs E2-treated bMECs(图5 (c))可能E2触发ER的直接激活α在bMECs,和/或会使各种基因的转录结合雌激素反应元件的基因或与其他转录因子相互作用[33]。为了解决这个假设,我们分析了一些炎症基因E2-treated bMECs没有或存在金黄色葡萄球菌感染。我们之前报道,除了TNF -α,金黄色葡萄球菌抑制bMECs的先天免疫反应,因为它不能诱发一些促炎细胞因子的基因表达,如il - 1β或il - 6 (10]。然而,我们也报道,在乙醇的存在车辆(2%),金黄色葡萄球菌略诱导il - 1β信使rna表达(15]。这项工作的结果加强先前的报道。有趣的是,E2在50个pg / mL显著增加促炎细胞因子mRNA表达如TNF -α和il - 1β之前,金黄色葡萄球菌感染。然而,在感染,两种细胞因子的水平mrna表达下调在E2-treated bMECs。微分E2对先天免疫反应基因的表达取决于多种因素,如激素浓度或个体的生理条件34]。这些结果与其他报告使用尿路上皮细胞,在E2降低LPS-induced细胞因子表达(19]。类固醇能够抑制炎症反应和/或解决。同意在bMECs E2的抗炎作用,我们发现显著减少促炎细胞因子的分泌(图7 (c))E2-treated细胞。这种效应是保持的金黄色葡萄球菌,除了il - 1β在受感染的E2-treated细胞,诱导。这种效应可以激活其他机制的结果,如inflammasome激活,这需要进一步的研究(35]。有趣的是,在协议与激素的抗炎作用,E2也诱发的mRNA表达il - 10,抗炎细胞因子,调节的激素E2-treated细胞与挑战金黄色葡萄球菌。

除了E2的免疫调节作用,据报道,这种激素也引发的生产抗菌化合物在子宫上皮细胞(19];类似的影响在目前的模型可以解释的内化金黄色葡萄球菌。我们的数据表明,E2-treated bMECs产生抗菌化合物,分泌到培养基(数字8(一个)和8 (b))。确定这个活动的起源,我们分析了不同抗菌肽的mRNA表达(β-defensins和psoriasin)。E2诱发DEFB1的表达、BNBD5 psoriasin S100A7 mrna。我们也分析了DEFB1分泌到培养基,由E2只由细菌引起,而不是。有必要分析BNBD5或psoriasin培养基的浓度来解决涉及减少金黄色葡萄球菌内化在E2-treated bMECs。因此,Fahey et al。19)确定子宫上皮细胞E2发挥抗炎作用和提高生产抗菌肽,显示直接防御行动在这个组织的感染。有可能是类似的效应可能发生在bMECs,但进一步的研究以证实这种可能性是必要的。此外,感应psoriasin表达的E2已经证明在人类乳腺上皮细胞系MCF-7 [36]。根据我们的结果,E2是不支持不可能成为抗菌化合物的生产。总之,这些结果表明,E2在50 pg / mL减少金黄色葡萄球菌内化在bMECs调制通过ER的激活先天免疫反应α。因为我们没有检测ERα激活金黄色葡萄球菌挑战bMECs,我们可以假设50 pg / mL的E2在24小时激活ERαbMECs,促进稍微期间加强抗炎反应,感染。期间有可能感染其他机制(即。,transcription factors) are participating because the activation of ERα是关闭的。在这个过程中,TLR2 / MAPK通路不激活。

5。结论

E2 (50 pg / mL)诱发的抗炎反应bMECs期间金黄色葡萄球菌通过参与ER内化α。这将导致增加生产抗菌分子,支持金黄色葡萄球菌消除。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

从CONACyT伊凡Medina-Estrada得到了奖学金。这项工作是支持由CONACyT (cb - 2012 - 178238), CIC-UMSNH(14.1),和ICGEB CRP-ICGEB / MEX13-01 Alejandra Ochoa-Zarzosa和CONACyT (infr - 2014 - 02 - 230603)乔尔·e·Lopez-Meza。作者感谢Nayeli Alva-Murillo在ELISA技术援助决定,诺玛Guijosa-Garcia和安娜劳拉Alvarez-Araiza细菌生长和细胞生存能力分析的性能。