文摘

骨髓纤维化(MF)是一个克隆造血干/祖细胞的肿瘤相关基因突变的杰纳斯激酶2 (JAK2),骨髓白血病病毒致癌基因(MPL)和calreticulin (CALR)基因。曼氏金融也表现为慢性炎症状态。Calreticulin (CRT),作为一个多功能蛋白质,参与一系列的细胞过程包括炎症、自身免疫和癌症启动/发展。基于这一背景,我们提出,在曼氏金融循环CRT可能反映了炎症过程。在目前的研究中,我们表明,循环CRT增加MF患者与健康对照组相比。在MF, CRT水平高度与骨髓纤维化,脾肿大,白细胞介素- 6 (il - 6)等离子体水平。反过来,也较高的il - 6水平与疾病严重程度的增加脾脏大小、骨髓纤维化、CD34传播+细胞,降低血红蛋白值。这些结果表明,循环CRT参与炎症的曼氏金融网络和相关疾病的侵犯。

1。介绍

骨髓纤维化(MF)是一个Philadelphia-negative骨髓增殖性肿瘤(Ph-neg或然数)可能出现的新创(原发性骨髓纤维化,及或基本血小板增多后(等;PET-MF)和真性红细胞增多症(PV);PPV-MF)。MF是一种罕见的血液癌症的发病率约为0.58新病例每年每100.000人,但是因为长期和禁用患病率较高的课程总是导致死亡由于发展和疾病或治疗相关的并发症。这是一个无性繁殖障碍造血干/祖细胞的临床表现为宪法症状恶化,进步脾肿大,骨髓(BM)纤维化和血球减少以及开发血栓性并发症风险增加和急性白血病(1- - - - - -3]。

司机在Janus突变激酶2 (JAK2),calreticulin (CALR),骨髓白血病病毒致癌基因(MPL)已报告。然而,只有不到10%的病人不变异JAK2,MPL,CALR基因(“三阴”)。无论分子状态,所有的病人有失调JAK / STAT信号(2- - - - - -6]。

结合分子异常,MF的特点是异常表达一些促炎和immunoregulating细胞因子分泌的白细胞和血小板激活/巨核细胞。这个炎症微环境已成为一个关键球员MF发病机理(7- - - - - -12]。

生理上,第一次描述CRT作为内质网蛋白负责Ca2 +体内平衡和糖蛋白折叠;目前,CRT被公认为一个多功能的伴侣发现在其他细胞车厢,以及细胞外,它参与细胞增殖、吞噬作用、细胞凋亡、附着力和先天和适应性免疫过程包括消灭癌细胞的免疫原性细胞死亡和纤维化13]。CRT超表达与不同病理条件包括慢性炎性疾病,自身免疫,fibrosis-related障碍和恶性发展14- - - - - -18]。在MF, CRT蛋白突变被发现持续激活的MPL受体信号(19,20.]。

考虑到CRT参与炎症、纤维化和癌症,我们提出,在曼氏金融循环CRT可能反映了炎症过程。在这里,我们描述循环CRT的MF患者水平。此外,我们研究了CRT水平之间的相关性和各种临床和实验室参数。

2。材料和方法

2.1。研究人群

外周血(PB)获得30 MF患者骨盆韧带在慢性阶段,从10健康志愿者。MF的诊断是根据世卫组织2008年标准(21]。病人和控制研究提供了书面知情同意。这个研究是医学伦理委员会批准的博洛尼亚大学医院的,是按照《赫尔辛基宣言》。

2.2。循环蛋白质的测定

在这里,我们分析了CRT患者的血浆水平/控制。EDTA-anticoagulated PB离心机15分钟在1000×g在30分钟的集合。等离子体被收集并存储在−80°C到量化。CRT被商用评估ELISA试验(Cusabio生物科技有限公司、武汉,中国),根据制造商的指示。简单地说,100年的标准曲线μL整除的已知浓度的重组CRT是100年运行和一式三份μL样本添加到井中。CRT绑定使用生物素亲和素系统检测。盘子被评估ELISA板阅读器450海里。的Ciraplex™免疫/人类9-Plex阵列(Billerica Aushon生物系统公司,妈,美国)是用于测量循环il - 6和TNF -α。

2.3。分子模式

分子分析评估诊断或治疗开始前从粒细胞获得的DNA。驱动突变进行分析(如前所述)(22]。具体地说, 突变与ipsogen评估JAK2MutaQuant工具包。突变的比例 等位基因表达的比率 副本拷贝数(CN)JAK2(CN + CNJAK2野生型)。CALR第9外显子测序是由下一代测序(上天)方法与GS初级(罗氏- 454平台);进行了初步分析与艾娃软件(GRCh38引用)。罕见的CALR突变被门店经Sanger测序。MPL突变被ipsogen调查MPL W515K / LMutaScreen工具包和桑格(测序MPLS505N和其他二次10外显子突变)。

2.4。细胞遗传学分析

对BM细胞染色体显带分析,根据国际体系标准显带技术对人类细胞遗传学命名(23]。至少20中期是必需的。不宜核型的定义根据动态国际预后评分系统(下降)+ (24),包括复杂核型或单个或两个异常包括+ 8、−7/7q -,我(q) 17日,−5% 5 q - 12 p -发票(3),或11 q23处重排。

2.5。统计分析

统计分析(Wilcoxon测试和斯皮尔曼相关分析)进行了使用GraphPad (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA)。所有 值被认为是显著时 ≤0.05(双尾)。

3所示。结果

总共30 MF患者调查: -(16例),CALR——(10例),MPL-(3例)变异。一个病人是三阴性。CALR突变患者1型(8例)和2型(2例)。病人的特点如表所示1。15个患者在诊断。13名患者接受先前治疗MF(羟基脲(10例)和ruxolitinib(3例));然而,在这项研究的时候,他们治疗至少2个月。

表1
根据突变状态病人的特点。CALR-mutated病人相比,JAK2患者 突变是老( )和水平较高的血红蛋白( )。

如图1(一),我们发现显著提高CRT MF患者的血浆水平与健康受试者相比(平均,5.2 ng / mL,范围,-25年1.4,与中值,1.8 ng / mL,和范围,1.2 - -3.7; )。CRT等离子体水平的比较 和CALR突变的病人,没有观察到显著差异(图1 (b))。虽然一些患者进行了研究,CRT等离子体水平的MPL-mutated和三阴性患者重叠其他MF患者(图1 (b))。CRT患者血浆水平的诊断没有显著不同于其他的病人。之间没有相关性观察循环CRT水平和血红蛋白水平,白细胞、血小板计数、CD34传播+细胞数量。

(一)
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(b)
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(c)
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图1
CRT的循环水平,分析il - 6和TNF -α蛋白质。CRT等离子体水平的总MF (a)或细分为曼氏金融JAK2 V617F突变( ),CALR突变( ),MPL突变( )和triple-negative-mutated ( )组(b)由ELISA测定。相比同年龄组(高清; ),CRT MF患者的血浆水平显著增加( )。值得注意的是,突变组之间没有显著差异。无论突变状态,TNF -α(c)和il - 6 (d)血浆水平也增加了MF ( )。图,一个符号代表一个个体,酒吧的高度代表了中值。 ; 。

随着CRT等离子体水平,循环TNF -α(中位数:2.62 pg / mL;范围:0.05 - -9.37)和il - 6(中值:33.3 pg / mL;范围:8.7 - -258.9)也增加了MF患者比健康受试者(中位数,0.26 pg / mL,范围0 - 0.84,和中位数6.37 pg / mL,和范围4.5 - -32.8,分别地; )(数据1 (c)和1 (d))。肿瘤坏死因子-α和il - 6等离子体水平没有影响突变状态和等位基因负担(数据未显示)。有趣的是,在MF,不管病人在诊断,之间存在着正相关的血浆水平CRT和BM纤维化( ; ),脾肿大( ; )和循环il - 6 ( ; )(数据2(一个),2 (b),2 (c))。这种相关性也不管突变状态(比较 突变和CALR突变的患者)。反过来,il - 6血浆水平与BM纤维化( ; ),脾肿大( ; ),循环CD34的数量+细胞( ; 与血红蛋白值()和相关负 ; ;数据3(一个),3 (b),3 (c),3 (d))。

(一)
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(b)
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(c)
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图2
CRT等离子体水平之间的相关性和BM纤维化,脾肿大,循环il - 6。循环CRT积极与纤维化、脾肿大和可溶性il - 6在MF。散点图展示的血浆水平之间的相关性CRT和BM纤维化( ; ),脾肿大( ; )和循环il - 6 ( ; 在MF患者(a、b和c,分别地。)。 设在(一个)显示的BM纤维化。
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图3
il - 6之间的相关性血浆水平和BM纤维化,脾肿大、CD34传播 + 细胞和血红蛋白值。无论突变状态,il - 6血浆水平与BM纤维化( ; ),脾肿大( ; ),循环CD34的绝对数量+细胞( ; 与血红蛋白值()和负相关 ; );(a, b, c, d,职责)。 设在(一个)显示的BM纤维化。

4所示。讨论

有缺乏了解关于可溶性CRT在曼氏金融的作用。研究的第一个结果是,在曼氏金融CRT等离子体水平提高与健康对照组相比。CRT已经发现一个优惠表达式巨核细胞和血小板正常受试者或从患者Ph-neg或然数(不管突变状态)25]。因此,这些细胞,这表明在MF /函数数量异常,可能是主要的贡献者的增强循环CRT。先前的研究支持假设细胞外和可溶性CRT主要释放死亡,死亡,或发炎/强调细胞(13- - - - - -16]。因此,高CRT水平检测在曼氏金融可能主要是由于慢性炎症状态特征骨髓和周围环境和反映损伤组织内稳态。

第二个结果是CRT等离子体水平也同样增加了 突变和CALR-mutated MF患者。在这项研究中,我们使用了一个抗体是针对CRT的N末端,将标签突变和不突变的蛋白质。因此,循环中发现的蛋白质CALR艾滋病患者可能是突变的总和(造血限制)和不突变的分子。这个数据可能表明,突变的收购CALR基因,虽然导致hyperactivation MPL受体(19,20.),不引起循环CRT数量增加。

CRT蛋白质含量,因此,我们表明,直接被发现与疾病的临床攻击性的大脾大小和更严重的骨髓纤维化。此外,我们发现了一个循环之间的直接相关性血浆CRT和il - 6的水平,其中一个最有效的促炎细胞因子调节在MF (26]。反过来,也较高的il - 6水平与疾病严重程度的增加脾脏大小、骨髓纤维化、CD34传播+细胞,降低血红蛋白值。即使这些相关性很弱( 总是低于0.5),一起指出CRT的参与炎症网络和疾病侵略性。CRT和il - 6等离子体水平之间的对应关系可能至少部分合理的,因为最近发现可溶性CRT诱发积极通过MAPK和NF-kB mRNA转录激活巨噬细胞,从而增加他们的il - 6和TNF -α生产(27]。此外,最近的媒体我突变细胞表达类型CALR已被证明夸大从单核细胞(正常细胞因子的生产28]。因此可能在曼氏金融循环CRT的增加可能导致的疾病相关的炎症/纤维化通过积极增强il - 6生产。相比之下,尽管TNF -α是一个CRT的负面调节器表达式(29日),之间没有相关性观察CRT和TNF -循环αMF患者血浆水平,表明TNF -的存在α独立的监管机制。

综上所述,我们的数据突出这种蛋白质的作用在炎症的曼氏金融网络。CRT和其他炎性细胞因子之间的相互交互包括il - 6可能确实有助于炎症的一代/维护/ MF的纤维化。

本研究的潜在限制病人的小样本大小。尽管如此,我们的数据创建未来的研究调查的理性基础的角色循环CRT在炎症的曼氏金融网络和其他Ph-negative或然数在较大的群病人。值得注意的是,由于相关纤维化和脾肿大,循环CRT测量可能是有用的在临床实践中。

5。结论

我们得出这样的结论:等离子体阴极射线管水平升高在MF患者平行的疾病活动程度和炎症状态。这可能识别更严重疾病的患者可能受益于个体化治疗。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Daria Sollazzo和露西亚卡塔尼亚设计研究;尼古拉Polverelli Nicola Vianelli,弗朗西斯卡Palandri招募病人和协调他们的样本收集;Daria Sollazzo,多里安人的强项,玛格丽塔Perricone和马可Romano执行实验室工作和分析数据;尼古拉Vianelli和Michele Cavo监督研究;Daria Sollazzo,卢西亚卡塔尼亚,弗朗西斯卡Palandri写的手稿。Daria Sollazzo,多里安人的强项,弗朗西斯卡Palandri,卢西亚卡塔尼亚的贡献同样这项工作。

确认

这项研究受到了Associazione Italiana控制器le Leucemie-Bologna (BolognAIL)和博洛尼亚大学(卢西亚卡塔尼亚和弗兰西斯卡Palandri RFO 2014)。