文摘

硫酸吲哚酚(是)一个重要的尿毒症毒素和明显累积循环的结束阶段肾病(ESRD)患者,这可能导致残余肾单位的伤害和残余肾功能(RRF)的逐步丧失。因此本研究进行调查的作用是调节血管系膜细胞(MC)增殖和底层机制。MCs的扩散是由引起的细胞数量计数,DNA合酶率,分析细胞周期阶段。cox - 2表达了西方墨点法和存在,和一个特定的cox - 2抑制剂NS398应用定义它在引起MC增殖中的作用。下面是治疗,MCs展出总细胞数增加,DNA合成速率,年代的细胞数量和G2阶段平行的upregulation细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白D1。接下来,我们发现了一个诱导炎症相关的cox - 2酶显著提高了,和抑制cox - 2的NS398明显阻塞引起MC增殖与产生PGE2的封锁。这些研究结果表明,可以通过COX-2-mediated诱导MC增殖机制,提供新的见解的理解和治疗在ESRD RRF的逐步丧失。

1。介绍

保护残余肾功能(RRF)是重要的不仅predialysis ESRD患者还接受透析病人的存活率。RRF的预测结果和透析患者的存活率1]。透析充分性和许多观察性研究的前瞻性随机试验证实,RRF的损失是高度相关的死亡率和发病率在腹膜透析(PD)患者(2,3]。透析患者RRF非常有助于small-solute间隙,液体平衡,磷的控制,和删除middle-molecular尿毒症毒素,特别是对于依靠肾脏代谢的毒素或管状分泌物,如硫酸吲哚酚(是)2,4]。

证据表明,血清浓度显著升高(ESRD患者(5]。是一种蛋白结合的尿毒症毒素,来源于饮食色氨酸的代谢6]。然而,不能有效地去除常规血液透析,因为它的高亲和力白蛋白在先进的慢性肾脏疾病(CKD) [7]。因此,被认为是出现尿排泄的主要由管状分泌和肾小球滤过。血清中积累加速管状细胞损伤和诱发随后的间质纤维化,因此作为肾毒素(5,8- - - - - -10]。研究还表明,可能导致复杂氧化还原变化系膜细胞(mc) [11和血管平滑肌细胞细胞增殖12]。已被证明有许多病态角色uremia-related器官损伤。例如,它可以提高生产活性氧(ROS),导致血管壁重构和细胞外基质沉积13]。MC增殖和随后的矩阵合成可能导致肾小球损伤和RRF的损失。然而,在调解MC增殖的作用仍然需要证据。

考克斯的诱导同种型,cox - 2表达肾小球旁体的致密斑,皮质厚提升肢体亨利(cTAL)在肾皮质、肾髓质和间质细胞(14]。PGE2的五大前列腺素合成的COX-2-related酶级联调节肾小球滤过,在肾皮质肾素释放,管状吸收的钠和/或水髓质(15]。越来越多的证据表明cox - 2有助于许多炎性疾病(16,17可能通过PGE2-mediated机制。最近的一份报告表明,cox - 2在MCs在鞘氨醇诱导1-phosphate刺激(18]。因此,在目前的研究中,我们充分研究的角色在MCs核扩散和cox - 2的规定,以及cox - 2在增殖过程中所扮演的角色的MCs挑战。

2。材料和方法

2.1。材料

是购买的σ(圣路易斯,密苏里州)。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),胎牛血清的边后卫,penicillin-streptomycin, trypsin-EDTA解决方案从Gibco购买(表达载体,宏伟的岛,纽约)。细胞周期蛋白D1鼠标单克隆抗体和细胞周期蛋白A2兔多克隆抗体来自Abcam。cox - 2鼠单克隆抗体从开曼群岛购买化学品(安阿伯市MI)。Anti-GAPDH (ab9485)提供的细胞信号技术(丹弗斯,MA)。PGE2酶免疫测定工具包是开曼群岛(安阿伯市MI)的化学物质。cox - 2抑制剂ns - 398,从Beyotime购买(上海,中国)。

2.2。MCs文化

从中国获得鼠标MC线HBZY-1类型文化中心集合(CCTCC武汉,中国)。细胞被维持在37°C调湿有限公司5%2大气中装有5.6毫米DMEM葡萄糖,10%胎牛血清(的边后卫;GIBCO), 100 U /毫升青霉素、链霉素100毫克/毫升、NaHCO 44毫米3,4 - 14毫米(2-hydroxy-ethyl) 1-piperazineethanesulfonic酸。MCs培养60% - -70%汇合后,他们是24小时处理不同剂量(0,250,500μ米)有或没有cox - 2抑制剂ns - 398治疗剂量的10μM。

2.3。细胞周期分析

MCs与车辆和指定的剂量的治疗是有或没有cox - 2抑制剂在血清DMEM的24 h。细胞被洗两次与PBS在70%的乙醇与0.25%胰蛋白酶消化和固定前至少2 h在4°C。然后由离心收集细胞,与核糖核酸酶治疗,沾propidium碘通过细胞周期检测工具(注册机,上海,中国)。在G1细胞的数量、年代和G2 / M被流式细胞术分析细胞周期阶段(BD流式细胞仪石中剑流式细胞分析仪,贝德福德,MA), modifit 3.0执行和数据分析软件。

2.4。定量实时聚合酶链反应

总RNA从培养MCs通过使用试剂盒试剂(豆类)根据制造商的协议。使用PrimeScript RT执行反转录试剂盒(豆类)根据制造商的协议。寡核苷酸(细胞周期蛋白D1:向前,5′公司治理文化有条件现金转移支付在20 TTT CTT行动TC-3′,相反,5′gca GTC gg GGA ATG GTC条t - 3′;细胞周期素A2:向前,5′亚美大陆煤层气有限公司ATG CCC TGG CTT TTA GTG-3′,相反,5′-TAACATTCACTGGCTTTTCGTCT-3′;Cyclooxygenase-2:向前,5′-AGGACTCTGCTCACGAAGGA-3′,相反,5′-TGACATGGATTGGAACAGCA-3′;和GAPDH:向前,5′-GTCTTCACTACCATGGAGAAGG-3′,和反向5′-TCATGGATGACCTTGGCCAG-3′)设计软件(可以在使用引物5http://frodo.wi.mit.edu/英杰公司)和合成。实时PCR扩增进行使用ABI 7500实时PCR检测系统(CA)福斯特城使用SYBR预混料Taq交货(豆类)。循环程序由一个初步变性10分钟(95°C),紧随其后的是40周期(95°C 1分钟15秒和60°C)。相对基因表达mRNA的规范化使用ΔΔCt GAPDH和计算方法。

2.5。免疫印迹分析

在指定的时间点,MCs迅速用冰冷的PBS和细胞溶解在冰上裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂。离心后,蛋白质含量是决定使用一个微型BCA蛋白质分析工具与牛血清白蛋白标准(皮尔斯,热)。60微克的细胞蛋白sds - page和转移到PVDF膜分离(Bio-Rad)。膜都被TBS-T (TBS渐变20 0.1%)包含5%脱脂牛奶在室温下1 h,然后孵化主要抗体针对细胞周期蛋白D1(1: 1000),细胞周期蛋白A2(1: 500),一夜之间,cox - 2(1: 500)孵化在4°C,紧随其后的是添加HRP-labeled二级抗体室温1 h。GAPDH是作为内部标准控制。J带强度测量使用图像软件(NIH的贝塞斯达,医学博士,美国)。

2.6。酶免疫分析法

细胞培养基在12000×g离心5分钟。中PGE2的浓度是由酶免疫分析法(开曼化学),根据制造商的指示。

2.7。数据分析

数据意味着±SE。统计分析了使用方差分析分析Bonferroni期末测验。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。引起MCs扩散

调查是否可以诱导MC增殖,我们对待MCs 250剂量μ米和500μM,分别。细胞增殖是首先检查直接在显微镜下细胞计数和DNA合成速率([3H]胸苷吸收)。如图所示的数据,是治疗剂量的250年和500年的24小时μ适度但总细胞数显著增加了21%和35%,分别为(图1(一))。为了进一步证实这一结果,我们对DNA合成速率。同样,的数量3治疗细胞H]胸苷吸收也增加剂量依赖性的方式(图1 (b))。数据表明,在促进系膜细胞增殖中发挥了一定的作用。

(一)
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图1
硫酸吲哚酚效果(是)在MCs细胞增殖。系膜细胞培养60% - -70%汇合后,他们是24小时处理不同剂量(0,250,500μ米)和细胞增殖测定细胞计数(a)和(3H]胸苷(3H-TdR)公司(b)。值意味着±SD; 在每一个组。
3.2。在MCs引起细胞周期进程

为了进一步验证上述结论,我们通过流式细胞仪测定细胞周期在MCs暴露于不同剂量的。如图所示的数据,造成一个温和但明显降低MC数在G1 / G0期和S期细胞数增加(数据2(一个)- - - - - -2 (f))。细胞周期分析显示,在MCs可以刺激细胞周期进程。

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图2
在MCs细胞周期进程的影响。细胞在不同的比例由流式细胞术检测细胞周期阶段MCs的显示剂量治疗后24 h。(a - c)代表的图像用不同剂量的细胞周期。(d-f)细胞的百分比在年代,G1 / G0和(S + G2 / M阶段。值意味着±SD; 在每一个组。
3.3。是调节细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白A2在MCs

进一步探讨影响MC增殖,我们测量了一些关键的细胞cycle-related蛋白的表达。这里我们发现明显增加了细胞周期蛋白D1的mRNA水平和细胞周期蛋白A2在剂量-时间礼貌取决于存在(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。通过免疫印迹,我们观察到一个类似模式的细胞周期蛋白D1蛋白表达和细胞周期蛋白A2 mRNA监管(数据3 (e)- - - - - -3 (h))。

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图3
在细胞周期蛋白D1的表达和细胞周期蛋白在MCs A2。MCs被处理后,细胞周期蛋白D1 (a)和细胞周期蛋白A2 (b) mRNA水平升高在24小时后剂量依赖性的方式治疗。与此同时,一个依赖于时间的诱导细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白A2 mRNA表达测试(c和d)。蛋白质水平的细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白A2也发现使用剂量和时间的实验(情况)。所有值都意味着±SD; 在每组; 与控制和 与控制。
3.4。MCs调节cox - 2的表达

研究可能的cox - 2参与引起扩散女士,我们测量cox - 2表达蛋白免疫印迹和存在。如数据所示,cox - 2蛋白摄入量有关升高(数字4(一)和4 (b))。信使rna的表达,500μ但不是250μcox - 2 mRNA水平增加(图4 (c))。使用500μM是,我们发现一个依赖于时间的感应cox - 2 mRNA表达(图4 (d))。这些结果表明,cox - 2可能是由MCs。

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图4
cox - 2的表达在MCs引起老鼠。MCs表示剂量的治疗是(0,250,500μM) 24 h,然后cox - 2蛋白mRNA (a和b)和(c)和蛋白质表达分析西方墨点法和存在。时间进程分析cox - 2 mRNA表达下面是治疗剂量的500μ米也检查(d)。值意味着±SD; 在每组; 与控制和 与控制。
3.5。沉默cox - 2在MCs细胞周期进程阻塞引起

检测cox - 2在MCs引起扩散的作用,具体的cox - 2抑制剂用于MCs。如数据所示5(一个)和5 (b),cox - 2抑制剂在10到20μ米降低cox - 2的表达。进一步,我们发现cox - 2抑制减少细胞S期和增加细胞数量在G1 / G0期(数字5 (c)- - - - - -5 (j))。此外,我们还发现cox - 2抑制剂明显减毒引起细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白A2表达在mRNA水平(数字6(一)和6 (b))。这些数据高度建议cox - 2在MC增殖发挥了重要作用。

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图5
具体cox - 2抑制剂NS398对细胞周期的影响是治疗后进展。细胞治疗NS398 (10μ500年前12 h (M)μ米)管理。(a)中存在的分析cox - 2在cox - 2抑制剂(NS398 10μ米,20μ在MCs M)治疗。(b)的免疫印迹分析cox - 2表达cox - 2抑制剂后(10μM和20μ在MCs M)治疗。(氟)代表细胞周期治疗后的图像和/或cox - 2抑制剂。(g-j)比例的细胞G1 / G0 (g), G2 / M (h),(我),(S + G2 / M (j)治疗后阶段和/或cox - 2抑制剂。值意味着±SD; 在每一个组。
(一)
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图6
cox - 2 mRNA表达的抑制效应细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白A2和PGE2的生产。(a) mRNA的表达细胞周期蛋白D1由存在决定;(b)的mRNA表达细胞周期蛋白A2由存在决定;(c)酶免疫分析法PGE2的媒介。值意味着±SD; 在每一个组。
3.6。沉默cox - 2诱导产生PGE2明显阻塞

进一步检查的效率cox - 2抑制剂在这项研究中,我们测量产生PGE2的媒介。由图所示6 (c)治疗PGE2水平增加了3.8倍,完全废除的cox - 2抑制。

4所示。讨论

RRF predialysis和透析病人是非常重要的。研究已经证明,RRF的损失是一个强大的预测死亡率和发病率在腹膜透析(PD)患者(1- - - - - -3]。RRF非常有利于消除中、大分子量毒素(2,4]。是最著名的尿毒症毒素,明显积累在透析病人的血清和加速疾病的进展6,19]。在这项研究中,我们发现可以适度但显著刺激通过COX-2-mediated MC增殖机制,这可能有助于RRF的逐步丧失。

细胞增殖是最终调节细胞周期G1的过程包括四个阶段,年代,G2,与重要的检查站和M在G1和G2。细胞周期蛋白D1控制细胞周期G1期,进展G1-to-S过渡(20.),细胞周期蛋白关联的激酶活性需要进入年代,完成年代,进入有丝分裂期(21]。因此,细胞周期蛋白D1的表达和细胞周期蛋白A2被选为标记细胞周期进程。剂量反应实验表明,显著诱导细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白D1表达MCs一致的结果在老鼠MCs [22]。同样,在S期细胞数的增加也观察到下面是治疗。这些发现强烈建议作为一个贡献者的细胞周期进展,在MCs细胞增殖。

接下来,我们检查了可能的机制调解是对MC增殖的影响。通过回顾文献,最近的证据表明,诱导炎症cox - 2酶可以在MCs在鞘氨醇诱导1-phosphate刺激(18]。这个概念后,我们检查了cox - 2的规定在MCs下面是治疗。有趣的是,非常cox - 2 mRNA和蛋白表达水平升高在剂量-时间和相关的礼仪。与此同时,也产生PGE2升高。这些数据表明,可以直接刺激cox - 2在MCs upregulation和PGE2的感应。为了进一步定义cox - 2在这个细胞周期进展的作用,cox - 2特异性抑制剂是应用于细胞之前是管理。正如所料,cox - 2抑制剂抑制了cox - 2的表达。同时,减少细胞cycle-related蛋白的细胞周期蛋白D1和A2也显著减毒通过抑制cox - 2与PGE2感应的封锁。

所有这些数据表示的一个重要的角色是通过激活cox - 2在促进MC增殖。MCs的扩散是由于残余肾单位的进步的障碍,以及ESRD患者RRF的损失在某种程度上。考虑到RRF的重要作用在维持更好的体内平衡的内部环境和更好的生活质量的患者,目标和cox - 2可能是有用的RRF的保护。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

朱淑真李和程Sijie同样导致了这项工作。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81370802号,81300591,81670647,81570616),(没有国家重点研发项目。2016 yfc0906103),江苏省自然科学基金(没有。BK2012001)。