文摘

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是一个咄咄逼人,入侵上皮来源的恶性肿瘤。的进展恶化前的lesions-oral白斑(OLK)和口腔扁平苔癣(OLP)——OSCC涉及复杂的炎症过程,尚未阐明。我们调查了角色的炎症介质和浸润免疫细胞OLK的致病过程,OLP OSCC。发生的调控t细胞亚群)和肿瘤相关巨噬细胞(tam)和促炎细胞因子和抗炎细胞因子的表达在OLK调查,OLP, OSCC组织。CD4免疫组织化学染色,FOXP3、CD68 TGF -β1、il - 10、il - 4,干扰素-γ,MCP-1表明亚群的发生和tam增加与疾病进展OLK OSCC。il - 10在OLK的早期阶段逐渐增加,在OSCC。浸润il - 4⁺巨噬细胞被认为在OLK组织越来越频繁地在口腔发育不良的进展。更少的TGF -β1⁺巨噬细胞被认为在OSCC OLK OLP。干扰素的表达γ逐渐减少OLK发展并在OSCC表达最低。MCP-1表达式在OSCC的发展没有明显变化。结果表明,慢性炎症诱导的免疫抑制在OSCC促进肿瘤发生,而不是启动它。

1。介绍

大量的流行病学和分子生物学研究表明,炎症大大增加罹患癌症的风险。慢性炎症可以引起持续的组织损伤和炎症细胞和细胞因子的变化出现在组织微环境。这些变化影响肿瘤的最终发展,恶性入侵和转移在炎症性疾病,如溃疡性结肠炎、萎缩性胃炎,巴雷特食管、结肠直肠癌、肝癌(1- - - - - -6]。

肿瘤微环境包括基质细胞、免疫细胞、肿瘤浸润和多种生物活性物质,抑制免疫反应和防止肿瘤的免疫监视。调控t细胞亚群)和肿瘤相关巨噬细胞(tam)占大多数的肿瘤浸润细胞与肿瘤微环境中免疫抑制(7- - - - - -9]。抗炎细胞因子,白细胞介素- 10”(il - 10)、il - 4、转化生长因子-β1 (TGF -β1),调节局部免疫抑制和促进增加亚群和tam的渗透。炎性细胞因子、干扰素-(IFN -)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1),可以抑制肿瘤血管生成,诱导细胞凋亡或作为肿瘤恶化的负调控。慢性炎症可能因此影响肿瘤发生、发展入侵和转移通过炎性细胞数量和细胞因子水平变化在当地组织。

口腔鳞状细胞癌(OSCC)第十一最常见实体瘤在世界范围内,大约有4%的负责所有恶性肿瘤(10]。这是一个积极、入侵上皮恶性肿瘤和总是与癌变前的口腔病变有关。口腔白斑(OLK),它表现为“白色区域或在口腔,”是最常见的口腔黏膜的潜在恶性条件(11- - - - - -13]。口腔扁平苔癣(OLP)是一种慢性T-cell-mediated黏膜与皮肤的炎症病因不明的条件。这是被世界卫生组织称为潜在的癌前和已经显著增加患口腔癌的风险(14,15]。大多数的t细胞在上皮受到OLP和毗邻受损基底角质细胞CD8激活⁺淋巴细胞,刺激角质细胞的凋亡。炎症介质的概要OLK也类似于在OSCC的进展。

的进展OSCC癌变前的病变是一种慢性、复杂、多步骤的过程。关键的炎性介质(s)影响OLK的进展和OLP OSCC尚未确定。本研究的目的是为了进一步阐明炎症介质的作用和渗透在OSCC的发病机制的研究。

2。材料和方法

2.1。组织标本

八十四例标本,包括OLK (),OLP (),OSCC (),免疫组织化学染色(包含IHC)进行评估。所有手术切除组织活检标本来自北京口腔医院,北京,中国。OLK标本被分为三组,OLK-I (),OLK-II ()和OLK-III (),的程度的口腔发育不良。OLP病变并不用类固醇治疗。组织在福尔马林固定和嵌入在石蜡组织病理学检查。知情同意之前就从所有参与者获得组织捐款。北京口腔医院的伦理委员会批准了研究方案。病人和临床病理的特点如表所示1。

2.2。包含IHC分析

IHC程序中使用的主要抗体Foxp3 (1: 200), il - 10 (1: 400), il - 4(1: 400),干扰素-(1:400),MCP-1 (1: 300;所有从Abcam,剑桥,英国),CD4 (Novocastra 1: 300年,纽卡斯尔,英国),CD68 (KP-1, 1: 300;DAKO、斯特鲁普、丹麦),TGF -β圣克鲁斯生物技术1(1:300年,德克萨斯州,美国)。都是鼠单克隆抗体。组织部分是从formalin-fixed削减和石蜡包埋块。部分与二甲苯deparaffinized然后患者通过三个减少酒精的浓度。内源性过氧化物酶活性在3%过氧化氢被孵化了10分钟。抗原可以检索是由微波加热样品在10毫米三基地,1毫米EDTA (pH值9.0)缓冲区。非特异性结合被孵化5%牛血清白蛋白(美国GenView)在室温下20分钟。部分被孵化与相应的抗体在一夜之间在4°C。负控制部分在磷酸缓冲盐(PBS)孵化。样本用PBS (pH值7.4)和染色被孵化与ChenMate设想可视化⁺/合anti-rabbit /鼠标试剂(通用中国上海)30分钟在室温下孵化与3、3′-diaminobenzidine衬底的指令分析制造商。彩色部分与蒸馏水轻轻冲洗10分钟,与苏木精复染色,通过三个增加浓度的酒精脱水,二甲苯清理,安装在幻灯片。两个病理学家独立统计积极染色细胞的数量在五个随机选择的字段的每个标本并指出主要的位置(s)在组织内。

2.3。统计分析

连续变量表示为±SD方法,使用单向方差分析和差异测试菸害的事后测试紧随其后。皮尔逊相关系数的计算,并使用学生的评估以及。学生的以及用于评估学习小组之间的差异。的值被认为是显著的。数据使用SPSS软件分析了版本13.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果

3.1。分布在OLP Treg细胞,OLK, OSCC

如图1(一),CD4⁺t淋巴球主要被发现在OLP的肤浅的固有层和OLK样品或间质组织的癌巢。OLP和OLK包含更少的CD4细胞⁺t淋巴球比OSCC组织(图1 (b))。CD4细胞的数量⁺t淋巴球OLK-III和OSCC样本比较,都高于数字OLK-I和OLK-II组织样本。因此建议CD4 IHC结果⁺t淋巴球逐渐增加与口腔发育不良(图的进展1 (b))。

包含IHC染色的具体⁺淋巴细胞亚群)透露类似的具体分布⁺和CD4⁺在所有三组淋巴细胞(图1 (c)),但在具体的数量有显著差异⁺在OSCC细胞而OLP或OLK样本(图1 (d))。Foxp3无显著差异⁺/ CD4⁺比例是三组(图1 (e)),但这两个具体的数量⁺t淋巴球和Foxp3⁺/ CD4⁺比率逐渐增加口腔发育不良的进展OLK样本(数据1 (d)和1 (e))。

3.2。巨噬细胞分布在OLP OLK, OSCC

类似于CD4的模式⁺t淋巴球、CD68⁺巨噬细胞(tam)观察主要在OLP的肤浅的固有层和OLK组织和/或间质组织的癌巢(图2(一个))。有更多tam在OSCC OLK ()和OLP ()组织。的浸润tam OLK组织逐渐增加与OSCC的发展发育不良(图2 (b)),最大渗透在OSCC组织(图2 (b))。

3.3。变化的抗炎细胞因子(il - 10、il - 4和TGF -β1)在OLP OLK, OSCC

在OLP和OLK组织,il - 10⁺和il - 4⁺巨噬细胞主要是发现在固有层和上皮细胞层的全部或部分;用积极的TGF -细胞β1染色都分散在固有层。在OSCC组织中il - 10⁺和il - 4⁺巨噬细胞主要是癌细胞巢,和一些积极的信号也被发现在癌变上皮组织(数字3(一个)和3 (b))。很少TGF -β1⁺巨噬细胞被认为在OSCC组织中(图3 (c))。

有更多的il - 10⁺细胞在OSCC OLK和OLP组织(,图3 (d)),这表明il - 10可能导致癌症的免疫抑制微环境。然而,我们并没有观察il - 10的数量之间的正相关关系⁺细胞和发育不良的进展OLK病人(图3 (d))。显著减少il - 4⁺细胞被观察到在OSCC OLP OLK组织,表明il - 4可能不是癌症的免疫抑制微环境的关键因素(图3 (e))。然而,浸润il - 4的数量⁺巨噬细胞与发育不良的进展逐渐增加OLK组织(图3 (e)),这表明il - 4可能是肿瘤形成的关键因素。与il - 10,更少的TGF -β1⁺巨噬细胞被认为在OSCC OLK和OLP组织(图3 (f)),TGF -之间没有相关性β1⁺巨噬细胞和发育不良在OLK的进展。因此,TGF -β1可能不是OSCC发展的一个关键因素。

3.4。炎性细胞因子的变化在OLP, OLK, OSCC

干扰素-γ⁺巨噬细胞在OLK主要是检测;很少被认为在OLP和OSCC组织(图4(一))和干扰素-的数量γ⁺细胞是负相关,在OLK口腔发育不良(图的进展4 (b))。在OLP OLK, OSCC MCP-1的分布⁺和干扰素-γ⁺巨噬细胞(图中是相似的4 (c)),而且没有观察到显著差异在MCP-1的数量⁺在这些组织巨噬细胞(图4 (d))。这些结果表明,干扰素-γ⁺而不是MCP-1⁺巨噬细胞参与OSCC慢性炎症的进展。

4所示。讨论

慢性炎症与肿瘤进展提出了近50年前(16]。一方面,一些病原体,包括假丝酵母、eb病毒(EBV)和人类乳头状瘤病毒(HPV),已发现口腔白斑,这可能发起局部炎症反应在癌前病变(17]。另一方面,癌症相关的toll样受体(如TLR1-4)可以通过粘膜的细菌被激活,这将导致致癌过程通过诱导炎症和致瘤的转换(18]。发表的大量的研究在过去的十年里所描述的交互实体肿瘤和周围基质导致肿瘤生长,入侵和转移。

有证据表明,炎症细胞和细胞因子在肿瘤周围组织促进肿瘤发展和进步尽管宿主的抗肿瘤反应19),他们增加慢性病的风险,炎症条件发展到癌症。OLP的恶性转化和OLK可能因此有关,或依赖于一系列的分子刺激原始炎性浸润。我们调查的关键影响慢性炎症的发展,恶性肿瘤,包括tissue-infiltrating免疫细胞和反OLP的促炎细胞因子,OLK, OSCC组织微环境。

Treg和TAM细胞是肿瘤微环境的关键部件,但具体不表达在正常口腔黏膜(20.]。符合观察,我们发现,OLP OLK, OSCC组织中炎症区域被CD4渗透到不同的区段⁺t细胞和CD68⁺巨噬细胞,OSCC组织中CD4细胞⁺t细胞和CD68⁺巨噬细胞比OLP或OLK组织。此外,Foxp3特定人类CD4标记⁺CD25Treg细胞(21),表示在OLP OLK, OSCC组织。我们的数据表明,这些免疫细胞参与当地免疫反应的调节。逐步增加观察浸润CD4的数量⁺t细胞,Foxp3⁺t淋巴球和CD68⁺巨噬细胞与发育不良的进展OLK样本表明,当地的人口免疫抑制细胞的变化是一个重要影响肿瘤的恶性进展。发现这些免疫细胞是位于靠近基底膜的表面固有层OLK和OLP的间质组织,癌巢与先前的报道是一致的(22),表明这些细胞之间的交互的潜在可能性。

炎症细胞的浸润在肿瘤发生过程中伴随着局部细胞因子表达谱的变化。研究转基因小鼠和人类肿瘤的发现改变了表达选择pro - (MCP-1,干扰素γ)和/或抗炎细胞因子(il - 4、il - 10和TGF -β1)有至关重要的作用在促进胃,结肠直肠癌、肝癌、乳腺癌、和皮肤癌发展(23]。il - 10表达的不是正常组织的上皮细胞24,25),但包含IHC分析表明明显更强的il - 10⁺染色的上皮细胞胞浆在人类口腔和咽癌与正常上皮角化细胞和炎症细胞(26,27]。增长的癌症细胞通过旁分泌机制,诱导il - 4和il - 4的表达已经被报道在头颈部鳞状细胞癌和OSCC [28,29日]。TGF -β1是一个负调节的细胞免疫反应和广泛表达于正常和肿瘤细胞。然而,在鳞状细胞癌,通常TGF -之间的负相关β1表达和发育异常增加,没有TGF -β1表达[30.]。

有趣的是,il - 4、il - 10和TGF -β1在OLP有不同的表达,OLK, OSCC组织中。OSCC的il - 10明显较多⁺,但不是更多的il - 4⁺比OLP和OLK组织细胞,而il - 4的数量⁺,但不是il - 10⁺细胞与发育不良的进展逐渐增加OLK组织。相比之下在OSCC il - 10、il - 4数字的增加与OLK和OLP组织相比,更少的TGF -β1⁺巨噬细胞在OSCC组织中发现,之间不存在相关性TGF -β1⁺巨噬细胞和发育不良的进展OLK的病人。这些抗炎细胞因子的数据从而提出不同的角色。il - 4可能重要进展OLK的癌前OSCC条件,但不是OSCC的免疫逃避。il - 10可能不是关键的发展早期恶性发育不良,但有助于肿瘤的免疫逃逸进展OSCC后,虽然TGF -β1对OSCC的发展可能不那么重要。

除了抗炎细胞因子、炎性细胞因子也起着重要的作用在肿瘤发展和进步。干扰素-γ是一种重要的细胞因子Th1-type强烈诱导的炎症刺激也抑制il - 4 (31日]。在慢性炎症,M1巨噬细胞激活干扰素-有抗原递呈功能。Th1干扰素介导的免疫应答γ⁺巨噬细胞发挥抗肿瘤效应和抑制肿瘤的生长。干扰素-牙龈组织的渗透γ⁺细胞,包括巨噬细胞,导致慢性炎症在OLP的维护32]。Heimdal et al。33)发现,肿瘤浸润的巨噬细胞的重要来源MCP-1,导致招聘额外的单核细胞的积极的反馈。在这项研究中,干扰素-的数量γ⁺巨噬细胞与发育异常的程度降低在OSCC OLK和明显的。这些变化表明,减少表达干扰素-γ扮演着一个重要的角色在OSCC OLK的进展。MCP-1,具有多种生物活性的细胞因子(34),分泌到肿瘤微环境在肿瘤细胞和基质细胞(35]。然而,MCP-1数量无显著差异⁺巨噬细胞在OLK OLP, OSCC组织被认为在这项研究中。

之前的研究表明,细胞因子的相互作用和/或免疫细胞对免疫反应的调节很重要36- - - - - -43]。我们观察到CD4的增加⁺t细胞,Foxp3⁺t淋巴球、CD68⁺巨噬细胞,il - 4⁺OLK进展中细胞发育不良和并行降低炎性细胞因子的表达干扰素-γ。这些数据表明转向过程中免疫抑制黏膜与皮肤的炎性疾病恶性肿瘤。此外,正如在OSCC il - 4减少,随之而来的il - 10表达可能进一步采取行动,抑制免疫反应。

5。结论

我们的研究增加了所谓关于慢性炎症可以引起免疫抑制,导致OSCC的发生。进一步的研究应该进行研究发展的抑制OSCC通过恢复免疫内稳态在癌前阶段。

缩写

细胞毒性t淋巴细胞:	细胞毒性t淋巴球
CTLA-4:	细胞毒性T-lymphocyte-associated antigen-4
具体:	Forkhead盒P3转录监管机构
干扰素-γ:	干扰素-γ
il - 4:	Interleukin-4
il - 10:	白细胞介素- 10”
MCP-1:	单核细胞化学引诱物蛋白1
OLK:	口腔白斑
OLP:	口腔扁平苔癣
OSCC:	口腔鳞状细胞癌
TAM:	肿瘤相关巨噬细胞
TGF -β1:	转化生长因子-β1
Treg:	监管t细胞。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Yujuan太阳和南刘同样对本文亦有贡献。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(授予号。30973325和30973325),北京市自然科学基金(批准号7092036),北京市政府特殊医院临床医学发展的资金支持(批准号XMLX201402)。