文摘
过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα)在心脏肥大的发病机制中发挥作用,尽管其潜在的机制仍不清楚。本研究的目的是评估PPAR的效果α激活endothelin-1——(ET-1)引起的心肌细胞肥大和探索其潜在机制。人类心肌细胞(hcm)培养有或没有ET-1,随后非诺贝特的抑制性影响,PPARα激活,细胞大小和脂联素蛋白质进行了测试。我们检查了激活的细胞外signal-regulated ET-1引起的蛋白质激酶(ERK)和p38的抑制ERK和p38通路ET-1-induced细胞大小和脂联素的表达。此外,我们研究了PPAR之间的交互α与脂联素和核因子-κB (NF -κ电泳迁移率改变分析和coimmunoprecipitation B)。ET-1治疗显著增加细胞大小、抑制PPARα表达和增强脂联素的表达。预处理与非诺贝特抑制的增加脂联素表达的细胞大小和增强。ET-1显著激活ERK和p38通路,而PD98059和SB205380分别抑制它们。我们的研究结果表明,PPAR激活α可以降低脂联素的激活和NF -κB和抑制ET-1-induced心肌细胞肥大。
1。介绍
心脏的心脏肥大是一种适应性反应,保护心脏泵功能在不利的条件下,和长时间的肥大是心力衰竭的主要预测因素之一(1,2]。先前的研究表明,endothelin-1 (ET-1)中扮演着一个关键的角色在肌细胞肥大的感应3,4]。
过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα)缺乏可损害心脏的功能能力5]。激活PPARα减少心脏肥大,减少心脏纤维化,减弱心脏功能障碍,由profibrotic抑制和改善生存,促炎,prohypertrophic基因(6]。非诺贝特,PPARα活化剂,据报道减少ET-1-caused心脏肥大的差别通过对这些基因的激活蛋白1 (AP-1)绑定和p38增殖抑制蛋白激酶(MAPK)信号7,8]。Fenofibrate-activated PPARα也可以通过修改干扰ET-1-induced心肌细胞肥大的核转录因子激活t细胞——(NFAT)相关的信号9,10]。此外,据报道,他汀类药物抑制心脏肥大之间通过抑制负相声核因子-κB (NF -κB)和PPARα(11]。然而,其他可能的分子机制相关PPAR心肌细胞肥大α调制仍有待阐明。
脂联素是一个丰富的血清adipokine来源于脂肪组织,展品在心肌和血管保护作用12]。脂联素抑制心肌肥厚性信号,有助于心脏重塑的规定(13]。此外,脂联素可以显著提高PPARα活动,adiponectin-dependent PPARα激活可能发挥保护作用与血管紧张素II-induced心脏纤维化(14]。然而,并不是所有的脂联素的影响是有益的,如果它的循环或组织水平不断提升。例如,脂联素可能激活NF -κB和AP-1,导致促炎基因的表达和增强血管紧张素II-induced心脏成纤维细胞增殖的15,16),这可能反过来在心力衰竭进展中发挥作用(17,18]。脂联素管理仍然可以增加能量消耗,降低体重,这可能是与心脏恶病质发展先进的心脏衰竭(19,20.]。
在我们之前的研究中,我们发现ET-1和血管紧张素ⅱ强烈刺激脂联素表达和人工培养的心肌细胞显著增加细胞大小(hcm) [21]。因此,我们推测,这种联系PPAR之间也可能存在αNF -κB、脂联素和心脏肥大。本研究的目的是阐明这个假设。
2。材料和方法
2.1。HCM文化
hcm买来ScienCell研究实验室(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)和生长在心脏肌细胞中补充5%胎牛血清的边后卫,补充心脏肌细胞增长1%,1%青霉素、链霉素的解决方案。细胞培养在poly-L-lysine-coated菜湿润孵化器有限公司为5%2在37°C。细胞间通道3 - 5都是用于实验。高雄医学大学生物实验的安全委员会批准了hcm的使用在体外实验使用。以下药物使用:非诺贝特(PPARα受体激动剂,σ),GW6471 (GW, PPARα拮抗剂,Santa Cruz), bq - 123 [BQ123,内皮素受体拮抗剂(ETA),σ),BQ788 [B BQ788,内皮素受体拮抗剂(ETB)σ),PD98059 (ERK抑制剂、细胞信号),和SB203580 (p38抑制剂、细胞信号)。这些药物显著影响细胞的生存能力(> 90%)。
2.2。测量细胞表面区域
Rhodamine-phalloidin用于可视化荧光显微镜下肌动蛋白纤维。hcm是沾rhodamine-phalloidin(1: 100稀释,微孔)目标f -肌动蛋白在胞质然后沾4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(1: 10000稀释,微孔)5分钟针对细胞核的DNA。hcm相机连接到显微镜下看。表面积决定使用图像分析软件(4.5 MetaMorph成像系统、元成像系列)和计算100个细胞的意思是至少10个随机选择的字段(×40目的)在三个独立的实验。
2.3。免疫印迹
细胞溶解产物是由细胞溶菌作用的缓冲(细胞信号,丹弗斯,MA)。细胞溶解产物受到12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚乙二烯二氟化物膜免疫印迹。墨迹是孵化与各种主要抗体:rabbit-anti-human-adiponectin (Abcam、剑桥、马),rabbit-anti-human-beta-myosin重链(βmhc;圣克鲁斯生物技术,CA)、rabbit-anti-human-B-type利钠肽(BNP);圣克鲁斯生物技术,CA), goat-anti-human-ERK(细胞信号,丹弗斯,MA), rabbit-anti-human phosphor-p38 MAPK(细胞信号,丹弗斯,MA), rabbit-anti-human-p65(圣克鲁斯生物技术,CA),组蛋白H1(圣克鲁斯生物技术,CA)和mouse-anti-human -β肌动蛋白(σ,圣路易斯,密苏里州)1 h。信号检测使用化学发光试剂+ (NEN波士顿,MA) [22,23]。每个乐队的强度量化的密度计。
2.4。(3H]亮氨酸合并
hcm中培养48-well盘子,使用不同的药物,然后刺激有或没有ET-1 (50 nM)和coincubated [3H]亮氨酸(1μCi /毫升)(σ,MA) 48 h。细胞被洗PBS和10%三氯乙酸是添加到井中。然后,10%三氯乙酸被删除,用95%乙醇。井被干后,1毫升0.5 mol / L氢氧化钠添加到井和样本转移到闪烁瓶来衡量3H-Leu合并。
2.5。免疫荧光染色
hcm和抗体免疫荧光染色(1:100稀释,Abcam,剑桥,MA)针对脂联素,然后用DAPI染色(1:10000稀释,微孔)5分钟针对细胞核的DNA。hcm相机连接到显微镜下看。
2.6。电泳迁移率改变分析(EMSA)
NF -κB探针用于测定凝胶转变,这是一个31-mer合成双链寡核苷酸(5′aca gg广汽TTT 20 CTG GGG行动TTC CAG三大′;3′tgt太极拳CTG AAA GGC广汽CCC TGA GTC亚美大陆煤层气有限公司c - 5′)包含的直接重复κB站点。EMSA, digoxigenin(挖)凝胶转变工具包寡核苷酸的3′端标签(美国罗氏,印第安纳波利斯)是用于绑定化验。
2.7。Coimmunoprecipitation化验(Co-IP)
人类心肌细胞的核内蛋白提取利用核蛋白质提取工具包(微孔、马、美国)。单克隆抗体被添加到300μ克孤立的核内蛋白和孵化一夜之间在4°C。然后,50μL的蛋白质/ G-Sepharose珠悬浮(圣克鲁斯,CA)被添加到每个样本,轻轻混合在一夜之间。样本然后离心机在12000 g×30年代;此后,1毫升的珠子被洗了三次IP缓冲区(微孔,MA)。恢复珠子在sds - page resuspended加载缓冲区,和上层清液用于电泳分离和免疫印迹。
2.8。统计分析
数据意味着±SEM。统计两组之间的差异进行分析,未配对的学生以及,多个组的数据差异分析单向方差分析采取Bonferroni紧随其后事后测试与GraphPad棱镜软件(版本5.03)。统计学意义的标准。
3所示。结果
3.1。非诺贝特抑制ET-1-Induced细胞肥大和脂联素的表达
非诺贝特的角色和ET-1 HCM细胞大小评估PPAR预处理的细胞α或PPAR激动剂(非诺贝特)α拮抗剂(GW6471) 24小时然后有或没有ET-1刺激。如数据所示1(一)- - - - - -1 (c),ET-1显著增加细胞大小和心肌细胞的蛋白质合成,比对照组;但非诺贝特抑制ET-1-caused细胞肥大。此外,ET-1和PPAR的使用α拮抗剂HCM的进一步增加细胞的大小和蛋白质合成。此外,免疫印迹试验表明,脂联素表达明显增强ET-1-treated hcm hcm相比,在控制。此外,脂联素表达的增强ET-1 hcm中可以抑制预处理与非诺贝特(图1 (d))。
(一)
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(c)
(d)
3.2。ETA受体参与ET-1-Induced细胞肥大和脂联素的表达
ET-1受体的作用ET-1-induced细胞肥大和蛋白质合成,研究了HCM细胞使用ETA受体拮抗剂BQ123或ETB受体拮抗剂(BQ788) 1 h,紧随其后的是刺激有或没有ET-1 (50 nM) 48 h。如数据所示2(一个)- - - - - -2 (c)预处理,ETA受体拮抗剂BQ123,而不是ETB受体拮抗剂(BQ788),明显废除ET-1引起的细胞肥大和心肌细胞的蛋白质合成。此外,增加脂联素表达引起ET-1也由ETA受体(图2 (d))。
(一)
(b)
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3.3。信号转导途径在ET-1-Induced细胞肥大和脂联素的表达
ET-1显著增加细胞大小和脂联素蛋白表达在HCM的价格相比对照组。如图3(一个)、磷酸化ERK和p38蛋白质被ET-1诱导时间的方式。增加ET-1-induced细胞肥大和脂联素蛋白表达显著,虽然只是部分,添加PD98059或SB203580后减毒,但之前ET-1刺激(数字3 (b)- - - - - -3 (d))。结果表明,ET-1增加细胞大小和脂联素通过ERK和p38信号通路蛋白表达。
(一)
(b)
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3.4。非诺贝特减毒ET-1-Activated脂联素和NF -κB
免疫荧光染色显示预处理的hcm和非诺贝特显著地抑制脂联素的ET-1-induced激活(图4(一))。预处理的hcm非诺贝特也显著抑制p65蛋白核易位。组蛋白H1是用来加载控制核蛋白质(图4 (b))。EMSA也证明了非诺贝特明显减毒ET-1-induced NF -κ(图B绑定活动4 (c))。总结了数据从三个独立的实验如图4 (d)。
(一)
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(c)
(d)
3.5。协会的ET-1脂联素的影响,NF -κB, PPARα
蛋白质与脂联素抗体分离细胞和免疫沉淀反应或控制老鼠的免疫球蛋白,然后用抗体探测p65(图5(一个)),PPARα(图5 (b)),脂联素(图5 (c))和免疫印迹分析。结果表明,培养的细胞1 h和ET-1 p65显著增强脂联素和脂联素的IP,但不是PPAR的脂联素α。因此,PPARα激活非诺贝特可能抵消的影响ET-1通过阻止脂联素和NF -κB。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
在这项研究中,功能性PPAR之间的关系α激活和ET-1-induced脂联素表达和细胞肥大培养HCM的调查在体外。在我们的研究中几个新的观测。ET-1敏锐地增加细胞大小和刺激脂联素通过HCM的ETA受体表达,可能通过激活ERK和p38介导的通路。此外,这样的增加脂联素表达的细胞大小和增强被预处理与PPAR减少α激活非诺贝特。最后,非诺贝特抗心肌肥厚的能力可能部分归因于抑制脂联素和NF -κB。
PPARs被广泛的脂质代谢和inflammation-modulating角色。为PPAR激动剂配体α一直在临床上用于管理[动脉粥24]。最近,PPARs已经注意到的多效性的影响与PPAR的证据α是负的心肌细胞肥大的监管机构。除降脂效果,PPARα配体也可以用于心肌肥厚和重构的管理25- - - - - -27]。
PPARαdownregulation观察心脏肥大,心脏衰竭,这表明PPARα不足会损害心脏功能能力(28- - - - - -31日]。PPARα激活减弱心脏功能障碍、心肌纤维化和心脏肥大;改善生存通过调节redox-regulated转录因子;并导致抑制profibrotic、prohypertrophic和炎症基因在动物28,32- - - - - -34]。先前的研究表明,非诺贝特减少ET-1-caused心脏肥大通过抑制AP-1绑定和p38信号(7,8]。激活PPARα由非诺贝特还可以与GATA-4绑定和干扰ET-1-caused心肌细胞肥大(9]。
脂联素是一种荷尔蒙胰岛素敏化,发挥其作用通过其受体AdipoR1, AdipoR2, snps [35]。由于脂联素是一个白色和褐色脂肪组织激素,它在三聚物的在血液中循环,hexameric,和high-molecular-mass物种,而不同形式的脂联素被发现扮演不同的角色在能源自稳态的平衡35]。它也被报道心脏重塑中发挥关键作用。脂联素通过激活活化蛋白激酶信号,抑制心肌肥大(13,36- - - - - -39]。此外,补充外源性脂联素改善心脏肥大adiponectin-deficient动物,表明脂联素可以保护心肌细胞直接(36- - - - - -39]。正如我们所知,患者血浆脂联素是增加明显心力衰竭;高脂联素水平可作为一个独立的临床结果预测心力衰竭(40- - - - - -42]。在我们之前的研究中,在心肌组织脂联素的表达与心衰的严重程度有关。我们的研究结果提供了第一个证据,PPAR激活α可以降低脂联素的激活和NF -κB和抑制ET-1-induced心肌细胞肥大。因此,脂联素可能发挥作用在心力衰竭的恶化和代谢紊乱在心力衰竭(42]。然而继续不断的增加血浆心肌脂联素的表达水平和心脏衰竭患者可能代表一个补偿性响应防止心肌损伤的进展。然而,它也可能代表短期有利的适应性反应的急性损伤,最终可能变成有害的不适应的信号和慢性激活时间延长,如持续交感神经过度活跃的先进的心脏衰竭。脂联素的影响可能对心血管系统产生不利影响,甚至全身慢性激活。例如,脂联素可能激活NF -κB和AP-1,导致促炎基因的表达和增强血管紧张素II-induced心脏成纤维细胞增殖,可能,反过来,在心力衰竭进展中发挥作用(17,18]。另一方面,脂联素可以增加能量消耗,降低体重,可能参与心脏恶病质发展先进的心脏衰竭(19,20.]。
ET-1在肌细胞肥大的发展起着至关重要的作用[3,4]。各种信号通路作为下游效应器的ET-1,包括p38和几个NFAT-related信号系统(7- - - - - -10]。最近,ET-1已被证明作为调节因子分泌不同的发病,包括脂联素(43,44]。通过ETA受体,ET-1刺激脂肪细胞分泌脂联素,表明ET-1可能扮演了一个重要的角色在脂肪组织脂联素的规定(43,44]。在先前的研究中,我们还发现,ET-1和血管紧张素ⅱ可以强烈刺激培养hcm中脂联素的表达和显著增加细胞大小(21,42]。血管紧张素受体阻滞剂的使用可以抑制血管紧张素II-induced脂联素表达(42,43]。因此,我们假设PPARαNF -κB、脂联素和心脏肥大可能是相互关联的。据我们所知,没有具体的数据关于非诺贝特之间的相互关系,ET-1,脂联素细胞肥大,还没有被报道。
一些限制是目前的研究指出。首先,我们没有探索如果外源性脂联素抑制ET-1表达式。第二,当前的研究不能排除的可能影响ET-1监管的其他因素参与脂联素的表达。此外,尽管NF -的机制κB绑定PPARα减少他们的绑定肥厚性基因启动子还有待阐明,可能这些分子可以争夺相同的DNA结合位点。此外,我们目前的研究没有调查非诺贝特是否可以通过其他机制发挥其antihypertrophic效果。因此,尽管我们的研究可能提供额外的证据显示PPAR的应用α治疗心脏肥大,进一步的研究需要阐明这一点(45]。
5。结论
我们的结果符合PPAR的一个模型α激活非诺贝特可以防止脂联素的激活和NF -κB,从而防止由ET-1诱导心肌细胞肥大。我们的研究结果提供了一个新颖的机械的见解PPAR的角色α和脂联素在心脏肥大。我们建议干扰炎症核转录因子非诺贝特可能是一个潜在的治疗方法以防止心脏肥大。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Po-Len刘、陈Yung-Hsiang这项研究同样起到了推波助澜的作用。
确认
这项工作是支持部分由台湾科学技术部(NSC 99 - 2320 - b - 350 - 002 - my3和大多数104 - 2320 b - 039 - 016 - my3), Cheng-Hsin Hospital-National阳明大学合作项目(没有。98 f117cy09),台湾卫生和福利部的临床试验和研究卓越中心(mohw105 - tdu - b - 212 - 133019),和中国医科大学(CMU105-S-19)。作者感谢Chin-Feng程女士她的援助在准备这手稿。