文摘
神经肽P物质(SP)表达在初级感觉神经元,通常被视为“疼痛”的神经递质。在周围炎症,SP激活neurokinin-1 (NK-1)受体和强化活动的瞬时受体电位草酸亚型1 (TRPV1),由疼痛的coexpressed神经元。因此,SP函数作为一种重要的神经递质参与hypersensitization炎性疼痛。Resolvin E1 (RvE1),源自ω- 3多不饱和脂肪酸,能抑制通过激活TRPV1活动chemerin 23受体(ChemR23)——RvE1受体位于背根神经节覆盖因此产生炎性疼痛的抑制作用。我们这里证明RvE1调节SP-induced TRPV1的强化通过g蛋白偶联受体(GPCR)在周围疼痛的神经元。SP-induced TRPV1的强化RvE1被抑制的Gαi-coupled GPCR抑制剂百日咳毒素和g蛋白抑制剂GDPβ- s。这些结果表明,低浓度的RvE1强烈抑制TRPV1的增强作用,诱导NK-1 SP-mediated激活,通过GPCR信号通路激活ChemR23在疼痛的神经元。RvE1可能代表一个新的治疗目标治疗炎性疼痛作为一个潜在的内源性抑制剂,强烈抑制TRPV1活动与周围炎症有关。
1。介绍
大量的炎症介质由多种细胞产生对组织损伤参与调节疼痛感(1,2]。这些分泌炎性物质作用于特定受体表达的疼痛的感觉神经元导致第二信使的生产和下游激活的蛋白激酶和磷脂酶。第二信使随后引发周边敏感通过控制大量的受体和离子通道(3,4]。
外围P物质(SP)是一种神经递质直径较小的痛觉传入的躯体神经系统和脊髓背角的突触终端(5,6]。生物SP活动由三个不同的活动神经激肽受体(NK): NK-1, NK-2, NK-3 [7]。NK-1受体为SP(特别是有很强的亲和力8]。事实上,一些研究支持这一观点,SP-induced NK-1受体的激活脊髓内的有害信息的处理是参与炎症和神经性疼痛9- - - - - -11]。
瞬时受体电位草酸亚型1 (TPRV1)也明确表达的C纤维和痛觉受器的一个重要的角色在引发痛觉过敏反应辣椒素,有毒热,光子和各种内源性配体(12]。TRPV1活动是增强炎症介质如神经生长因子,生长激素抑制素、缓激肽、前列腺素,血清素,表明TRPV1是至关重要的为一体的各种信号通路调节对刺激的敏感性(13]。SP参与炎性疼痛的hypersensitization通过激活NK-1疼痛的表达的神经元和增效的活动TRPV1在周围炎症。这表明外围SP NK-1受体的激活TRPV1增加灵敏度和触发器痛觉过敏(14]。
resolvin内源性脂质介质产生ω3多不饱和脂肪酸在决议阶段的急性炎症有很强的解决和抗炎作用15,16]。Resolvin E1 (RvE1)来自二十碳五烯酸。低剂量管理通过外围RvE1减少炎性疼痛,脊椎和系统性管理/抑制炎症反应和TRPV1活动(15,16]。引人注目的是,RvE1强有力地抑制capsaicin-induced TRPV1电流(IC50= 1海里)在分离背根神经节神经元。这种集成电路50低于AMG9810大约是160次,一个常用的TRPV1的对手(17,18]。RvE1抑制TRPV1受体活动通过g蛋白耦合chemerin 23受体(ChemR23)。RvE1受体表达的初级感觉神经元诱发antinociceptive效应(16,18]。这些结果表明,ChemR23 coexpressed痛觉神经元表达NK-1和TRPV1。此外,低浓度RvE1完全抑制SP-induced TRPV1势差现象通过g蛋白偶联受体(GPCR)信号通路激活ChemR23。综上所述,我们建议RvE1可能函数作为TRPV1的内源性抑制剂与周围炎症相关的活动。
2。材料和方法
2.1。动物
综述了所有外科手术和实验程序和批准的机构动物保健和使用委员会Gachon大学医学院。成人C57BL / 6小鼠(男,4 - 6周)从Orientbio购买(凭借、韩国)。三十老鼠习惯至少1周之前传统的实验设施与十二12 h(灯上午8点)和每个周期随意获得食物和水。
2.2。准备背根神经节(DRG)神经元
DRG神经元文化是准备之前报道(17]。drg无菌远离老鼠和孵化了胶原酶(1.25毫克/毫升,罗氏,印第安纳波利斯)/ dispase-II(2.4单位/毫升,罗氏)37°C 90分钟,然后用0.25%胰蛋白酶消化为8分钟37°C,其次是0.25%胰蛋白酶抑制剂2分钟在37°C。细胞被机械分离和火焰抛光巴斯德吸管的0.05% DNAse我(σ,圣路易斯,密苏里州)。DRG细胞被镀在玻璃盖滑以前涂有0.1毫克/毫升溶液poly-L-ornithine和生长在neurobasal-defined介质(2% B27补充,英杰公司)5μM AraC和5%的公司236.5°C。DRG神经元增长了24小时前进一步的实验。
2.3。单细胞逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)
单细胞rt - pcr进行如前所述[19]。简单地说,一个细胞被吸进一个补丁吸管齿顶圆直径约为25μm,轻轻地放在一个包含逆转录反应管试剂和孵化1 h 50°C(上标三世,表达载体,卡尔斯巴德,CA)。互补的产品是使用在一个单独的PCR。所有用于单细胞PCR引物序列表1。第一轮PCR进行50μL(包含0.2毫米核苷酸PCR缓冲,0.2μM”外“引物5μL RT产品,和0.2μL铂Taq DNA聚合酶(表达载体)。协议包括一个5分钟的初始变性步骤在95°C紧随其后40周期的40多岁变性在95°C, 40年代退火55°C,三、四十年代伸长72°C。7分钟的反应是完成最后的伸长。参加第二轮扩增,反应缓冲(20μL)包含0.2毫米核苷酸,0.2μM“内在”引物,5μ0.1 L的第一轮PCR产品,μL铂Taq DNA聚合酶。这些引物的反应过程是一样的,在第一轮。消极的控制是获得吸量管还没有收获任何单元格内容被淹没在浴缸里的解决方案。PCR产品显示在ethidium bromide-stained 2%琼脂糖凝胶。
2.4。全细胞膜片箝记录
全细胞电压和current-clamp录音进行在24 - 28°C测量电流和动作电位,分别使用一个axopatch b - 200放大器(轴突仪器,联盟城市)。补丁吸量管救出硼硅酸盐毛细血管(追逐科学玻璃Inc . Rockwood CA)。当充满了吸管的解决方案,4 - 5 MΩ吸量管的阻力。录音室(卷300μL)连续过冷(2 - 3毫升/分钟)。串联电阻补偿(> 80%),并泄露减法。在2千赫采样数据low-pass-filtered 10 KHz。pClamp8(轴突仪器)软件在实验和分析。电压钳实验的吸管的解决方案是由126 K-gluconate(毫米),10氯化钠,1 MgCl210 EGTA 2 NaATP, 0.1 MgGTP,调整与KOH pH值7.4,与295 - 300 mOsm的渗透性。在某些情况下,国内生产总值β- s(2.5毫米)是阻止GPCRs包含在细胞内的解决方案。电压钳实验的细胞外的解决方案包含(140毫米)氯化钠,氯化钾,2 CaCl21 MgCl2,10玫瑰,和10葡萄糖,调整与氢氧化钠pH值7.4,与300 - 310 mOsm的渗透性。细胞外的解决方案是使Ca2 +通过添加0毫米CaCl无2和2毫米EGTA螯合的环境2 +。电压钳实验进行控股−60 mV的潜力。吸管current-clamp实验解决方案是由145 K-gluconate(毫米),2 MgCl21 CaCl210 EGTA 5玫瑰5 K2ATP,调整与KOH pH值7.3 - -7.4,300 mOsm的渗透性。current-clamp实验的细胞外的解决方案包含(140毫米)氯化钠,氯化钾,2 CaCl21 MgCl2,10玫瑰,和10葡萄糖,调整与氢氧化钠pH值7.4,与300 - 310 mOsm的渗透性。
2.5。Ca2 +成像
(Fura-2AM) -分子探针,尤金,或基于Ca2 +如前所述的成像实验(19]。简单地说,细胞含有fura-2AM (5μ米)在37°C被放置到一个倒置显微镜(IX70,奥林巴斯)和175 W氙弧灯照明。激发波长(340/380 nm)选择使用Lambda DG-4单色波长变换器(萨特仪器,诺瓦托,CA)。细胞内自由钙2 +浓度([Ca2 +]我在36°C)测定通过数字视频microfluorometry使用加剧了电荷耦合器件相机(级联、Roper科学、特伦顿,新泽西州)耦合与成像显微镜和奔腾5计算机软件(Metamorphor,通用成像Corp . PA)。
2.6。药物
辣椒素和SP(σ,圣路易斯,密苏里州)股票的解决方案是在乙醇和H2O,分别存储在−20°C。药物稀释他们的最终浓度与细胞外的解决方案,然后通过洗澡灌注系统采用重力。二磷酸鸟苷5′- [b-thio] trilithium盐(GDPβ从σ- s)获得。百日咳毒素从Tocris购买生物科学(英国布里斯托尔)。resolvin最初被隔离在分泌物形成的决议阶段自限性的急性炎症。完整的结构说明之后,resolvin由完整的有机化学合成15,20.]。合成RvE1 (5 s, 12 r 18 r-trihydroxy-6z 8 e, 10 e, 14个z, 16 e-eicosapentaenoic酸)从开曼群岛获得化学(安阿伯市,美国),合格的根据出版的物理和生物特性(15,21]。股票的解决方案包含10或100 ng /μL resolvin悬浮在100%乙醇和保存在一个冰箱−80°C。小心被送往RvE1避免接触空气样品制备过程中。立即使用前,RvE1直接稀释测试与溶液浓度,一度用。RvE1使用的最终浓度为0.5 3 nM基于我们之前的研究(18]。最终的乙醇浓度一直保持在1%以下。在这样的操作,没有退化RvE1在质量/质谱法测量(数据没有显示)。
2.7。统计分析
所有数据都表示为平均值±标准平均误差(SEM)。单向方差分析(方差分析)或未配对的学生t以及用于确定使用起源的差异6.0 (Microcal软件公司,北安普顿,MA)。差异被认为是重要的时候。
3所示。结果
3.1。Coexpression TRPV1的ChemR23, NK-1小型DRG神经元
我们调查了小型DRG神经元表达NK-1,是否使用单细胞rt - pcr ChemR23, TRPV1 mrna。单细胞rt - pcr分析在小型DRG神经元进行了选择性地显示,大约84% (/ 50),80% (/ 50)和70% (/ 50)的小型神经元表达TRPV1, ChemR23和NK-1(数字1(一)和1 (b))。值得注意的是,所有NK-1+神经元表达TRPV1和ChemR23(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.2。RvE1抑制了SP-Induced TRVP1的强化
一般来说,常数辣椒素治疗疼痛的神经元表达TRPV1触发Ca2 +通过细胞内Ca端依赖TRPV1的脱敏2 +涌入。在Ca2 +成像实验用小型DRG神经元,外部Ca的1毫米2 +解决方案是用来减少TRPV1的脱敏,和低浓度辣椒素(200海里)治疗的持续时间是保持在最低限度的(5秒)18,22]。细胞恢复时间(冲刷)8 - 10分钟。辣椒素治疗四次顺序时,TRPV1的极端脱敏(图中未发现2(一个))。辣椒素治疗RvE1(5分钟)抑制TRPV1剂量依赖性的方式在第三治疗(数字2 (b)和2 (c))。此外,SP treatment-induced TRPV1势差现象(10分钟的治疗,60%的增长)是由通过NK-1激活第二个辣椒素治疗,和TRPV1势差现象(增加20%)仍在第三个辣椒素诱导治疗即使没有SP(数字2 (d)和2 (f))。然而,这样一个回应的TRPV1增强作用的第三个辣椒素治疗剂量依赖性抑制了灌注RvE1特别是低浓度(数字2 (e)和2 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。RvE1抑制SP-Induced TRVP1通过GPCR信号通路的强化
全细胞电压钳记录实验表明RvE1抑制剂量依赖性的方式(IC capsaicin-induced电流50= 0.93,集成电路50= 0.38)在正常情况下没有与SP周效磺胺-乙胺嘧啶的治疗和治疗,分别(图3(一个))。TRPV1进一步治疗会使SP完全被RvE1即使在低浓度下(图3 (b))。我们测试是否SP-induced RvE1 TRPV1势差现象及其抑制的依赖于GPCR信号通路由NK-1 Chem23,分别。当Gαi-coupled GPCR抑制剂百日咳毒素和g蛋白抑制剂GDPβ- s, SP-induced TRPV1的增强作用和抑制作用RvE1 TRPV1都受阻(数字3 (c)(A和B)和3 (d))。这个结果表明,激活NK-1和ChemR23 SP和RvE1是由通过GPCR TRPV1的增强作用和抑制信号通路。此外,current-clamp记录实验表明辣椒素引起的动作电位治疗后进一步增加SP(27%),尽管他们完全被低浓度的RvE1(1纳米)。因此,我们的研究结果表明,RvE1强烈抑制TRPV1活动(数据3 (e)和3 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
组织损伤诱发炎性疼痛和周围炎症。一般来说,炎症引起的疼痛是周边敏感的初级感觉神经元受到刺激炎症介质(1- - - - - -3]。神经肽SP是最常见的已知的神经递质在痛苦中传播和表达的一个子集无髓鞘的DRG内疼痛的初级感觉神经元(14,23,24]。数电生理学的研究表明,SP受体NK-1由初级感觉神经元表达,因为SP激活DRG神经元在活的有机体内和在体外(25]。rt - pcr研究进一步证明NK-1 mrna的猫,老鼠,和鼠标DRG神经元(26,27]。具体NK-1乐队也观察到在西方墨迹的DRG神经元,这是进一步调节后完全弗氏adjuvant-induced炎症(14]。此外,我们的单细胞rt - pcr分析表明NK-1表达的大约80%的小型DRG神经元(数字1(一)- - - - - -1 (c)),这表明外围SP与组织损伤参与了相关的生产通过初级感觉神经元表达的NK-1炎性疼痛。
TPRV1专门C-fiber痛觉受器,一个关键的TRP通道表达的强烈参与炎性疼痛的起源(28]。最近,一种小分子TRPV1抑制剂被报道在发展过程中(29日]。有趣的是,不同脂质介质函数作为TRPV1的内源性抑制剂。其中,RvE1来自二十碳五烯酸通过抑制展示了强大的抗炎和镇痛效果的TRPV1 DRG神经元的活动。RvE1抒发其antinociceptive影响通过受体的激活g蛋白耦合ChemR23广泛表达的神经元(初级感觉神经元和脊髓神经元)、免疫细胞(巨噬细胞)和小胶质细胞30.]。目前的研究结果表明,ChemR23主要是coexpressed NK-1和TRPV1的小型DRG神经元(图1(一)),这表明TRPV1-positive DRG神经元coexpress NK-1痛觉神经元参与炎性疼痛。此外,由于ChemR23 coexpressed在这些TRPV1-positive痛觉受器(数字的78%1 (b)和1 (c)),RvE1可能有一个重要的角色在抑制炎性疼痛由于TRPV1活动与周围炎症有关。
外围(intraplantar)和中部(鞘内)RvE1管理有效降低炎性疼痛。有趣的是,RvE1抑制TRPV1在DRG神经元16]。同样,我们的钙成像结果表明,RvE1充当有效的内源性抑制剂TRPV1的小型DRG神经元(数字2 (b)和2 (c))。SP enhanced-TRPV1活动诱发热痛觉过敏在外围炎症(14]。目前钙成像实验证实,额外的治疗与辣椒素预处理后SP小型DRG神经元导致capsaicin-mediated TRPV1的增加超过60%(图的强化2 (d))。最令人吃惊的是,RvE1完全抑制SP-potentiated TRPV1活动更低的浓度比(1海里),要求在正常情况下没有SP(3海里)(数据2 (e)和2 (f))。这些结果表明,炎性介质SP扮演了一个角色在进一步其余TRPV1周围神经元的活动,这个活动是被RvE1在非常低的浓度(1海里),这表明即使是低浓度的RvE1可以抑制SP对疼痛的影响诱导外周组织损伤所致。膜片箝结果也表明了,RvE1剂量依赖性地抑制capsaicin-induced电流(IC50= 0.93)在正常情况下在疼痛的神经细胞(图3(一个))。TRPV1的活动是增强NK-1 DRG神经元SP处理时,在这种情况下,RvE1抑制浓度一半高的capsaicin-induced电流(IC50抑制所需= 0.38),在正常情况下(图3(一个))。此外,RvE1完全抑制capsaicin-induced动作电位,增加了27%在DRG神经元由于SP(数字3 (e)和3 (f))。这样RvE1 TRPV1的DRG神经元的抑制作用是抑制信号介导的g蛋白耦合受体ChemR23 [16,18]。预处理的DRG神经元百日咳毒素18 h和GDPβ- s导致抑制RvE1关于SP-induced TRPV1(人物的强化3(一个)和3 (b))。这些数据表明,RvE1抑制SP-induced TRPV1势差现象通过抑制信号通路激活特定PTX-sensitive / Gαi-coupled GPCRs。令人惊讶的是,一个非常低的浓度RvE1抑制TRPV1活动增强了周效磺胺-乙胺嘧啶的治疗。在这种情况下,它可以推测RvE1可以抑制TRPV1在低浓度反应更强烈,因为ChemR23基因就在伤害感受器神经元由于炎症物质的存在,包括SP。的确,ChemR23 mRNA水平增加了各种炎症物质在人类单核细胞、巨噬细胞和角膜,ChemR23受体表达(31日,32]。ChemR23的微分表达式模式刺激SP和可能的抑制作用RvE1 SP-induced TRPV1势差现象在小DRG神经元可能表明ChemR23信号根据不同的角色存在/ SP。进一步的研究对于cross-activity SP的NK-1激活TRPV1的增强作用和超表达的ChemR23通过GPCR信号通路在异种的HEK293细胞overexpressing NK-1, TRPV1,因此ChemR23是必需的。本研究的结果建议RvE1作为内源性抑制剂的治疗潜力的炎性疼痛,因为只有很低的浓度RvE1被要求抑制TRPV1活动增强了外围SP在疼痛的神经元。
总之,目前的研究表明,伤害感受器TRPV1, SP受体NK-1, RvE1受体ChemR23由小型coexpressed DRG神经元。此外,SP强化TRPV1痛觉神经元的活动,完全是被RvE1在非常低的浓度(1海里),这通过GPCR信号通路抑制发生。因此,我们建议RvE1可以有效地抑制SP-induced TRPV1势差现象由于周围炎症。
缩写
| SP: | P物质 |
| NK: | 神经激肽 |
| TRPV1: | 瞬时受体电位草酸亚型1 |
| RvE1: | Resolvin E1 |
| GPCR: | g蛋白耦合的受体 |
| 按: | Gorsal根神经节 |
| rt - pcr: | 逆转录聚合酶链反应。 |
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是支持的Gachon吉尔大学医学中心(朋友:2015 - 16)和由格兰特朝鲜的卫生技术研发项目,卫生和福利部,大韩民国(HI14C1842)。