文摘
我们调查的影响Dalbergioidin (DAL),一个著名的天然产物提取Uraria crinita阿霉素- (DXR)诱导小鼠肾纤维化。7天的老鼠进行预处理DAL后跟一个注入DXR(10毫克/公斤)通过尾静脉。分析了肾功能DXR 5周后治疗。DXR引起肾毒性。肾病综合症的症状后,大大提高了木豆治疗。肾纤维化的指数,Smad3的磷酸化和alpha-smooth肌肉肌动蛋白的表达(αsma)、纤连蛋白、胶原蛋白3 (Col III),钙TGF -β,在应对Smad7 DXR都同样被木豆。目前的研究结果表明,木豆改善肾脏损害调查在这个模型的标记DXR-induced实验性肾毒性。
1。介绍
阿霉素(DXR)是一种蒽环霉素糖苷抗生素,具有广谱抗肿瘤活性与多种人类实体瘤(卵巢、乳房、肺癌症以及其他一些癌症和血液恶性肿瘤(1- - - - - -3]。然而,DXR并不区分癌症和正常细胞和超越不仅快速增长的癌细胞,而且其他快速增长的细胞在体内;因此,它在化疗已被限制使用。DXR有多种毒性,包括心脏、肝、肾、血液毒性(4- - - - - -8]。虽然从DXR严重的细胞毒性的机制还没有完全理解,活性氧(ROS)被认为是一个关键因素。是非常重要的理解事件控制氧化损伤。DXR治疗导致羟基自由基的生产过剩,过氧化氢、超氧化物阴离子,引起膜脂质过氧化作用[9]。因此,越来越多的数据表明,同时DXR治疗和抗氧化剂可能缓解DXR的毒性。
Uraria海百合化石有一些很棒的健康好处,广泛分布在印度、泰国、印度尼西亚和中国。它一直被用作草药,有生物活性的属性,如抗氧化活性、抗溃疡的效果,和成骨的活动。其根源,因为他们的抗炎活性,也被用于治疗发冷、水肿,胃痛10,11]。本研究的目的是调查的影响Dalbergioidin (DAL),一个著名的花青素Uraria crinita在老鼠身上,DXR-induced肾纤维化。研究了确定治疗木豆可以抵消DRX体内引起的肾纤维化。我们也调查了木豆的作用机理。
2。方法
2.1。试剂
木豆是购自BioBioPha有限公司。SMAD3, p-SMAD3, SMAD7,αsma、纤连蛋白、坳我、粘附和TGF -β买来圣克鲁斯生物技术有限公司牛血清白蛋白(BSA), DXR、氢氧化钠、硝酸铁、三氯乙酸(TCA),和高氯酸(PCA)是从Sigma-Aldrich获得的。
2.2。动物
老鼠被安置和使用如前所述12]。
2.3。实验的程序
小鼠随机分为3组,每组8老鼠。组我作为对照组42天。组II作为模型组和接收一个静脉注射DXR在7天(10毫克/公斤)。第三组作为治疗组,并使用木豆(30毫克/公斤IP) 42天;7天,静脉注射一DXR(10毫克/公斤)管理。42天,老鼠被颈椎错位和牺牲,灌注来评估各种生化参数后,肾脏和血液样本。
2.4。测量尿液和血浆
收集尿液和血液样本(如前所述)(13]。尿白蛋白、血浆甘油三酯水平,血浆尿素水平,使用商业套装和血清肌酐水平测定,酶联免疫吸附试验设备(Exocell),尿素氮直接工具包(Stanbio实验室),一个LabAssay甘油三酸酯酶联免疫试剂盒和光)(kouichi,和肌酐Liquicolor工具包(Stanbio实验室)。
2.5。Masson-Trichrome染色
Masson-trichrome染色做了如前所述[14]。
2.6。测定谷胱甘肽在体内
木豆治疗的效果在谷胱甘肽(GSH)含量是评估使用商业套装(开曼化工有限公司)后,制造商的协议。
2.7。体内测定MDA水平
肾脏组织的脂质过氧化反应,研究了通过测量丙二醛(MDA)水平涉及硫代巴比土酸比色法(稍后通知)加合物的形成。由商业TBARS MDA测定分析工具包(开曼化工有限公司)后,制造商的协议。
2.8。逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)
细胞总RNA分离使用商业试剂盒试剂盒(Invitrogene);RNA浓度测定spectrophotometrically。第一个互补脱氧核糖核酸合成后执行制造商的指令(豆类,日本)。纤连蛋白的特定的引物,αsma,钙坳III、SMAD7 TGF -β和GAPDH(加载控制)如下:
纤连蛋白:感觉5′-CGAGGTGACAGAGACCACAA-3′, 5′反义-CTGGAGTCAAGCCAGACACA-3′;αsma:感觉5′-TGTGCTGGACTCTGGAGATG-3′, 5′反义-ATGTCACGGACAATCTCACG-3′;钙粘蛋白:感觉5′-AATGGCGGCAATGCAATCCCAAGA-3′,反义5′-TGCCACAGACCGATTGTGGAGATA-3′;坳III:感觉5′-AGGCAACAGTGGTTCTCCTG-3′,反义5′-GACCTCGTGCTCCAGTTAGC-3′;smad7:感觉5′-AGGTGTTCCCCGGTTTCTCCA-3′;反义:5′-TTCACAAAGCTGATCTGCACGGT-3′;TGF -β:感觉5′-GCAACATGTGGAACTCTACCAGAA-3′,反义5′-GACGTCAAAAGACAGCCACTCA-3′;GAPDH:感觉5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′, 5′反义-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3′。协议如下:50°C 2分钟,95°C 10分钟,40 95°C的周期为15秒,30秒和60°C。
2.9。免疫印迹分析
用免疫印迹的方法如前所述[12),组织均质和上层的套利交易。第一抗体被添加和孵化膜在一夜之间在4°C。HRP-conjugated二级抗体稀释和孵化膜在20°C。这些墨迹被孵化与化学发光底物(微孔)和暴露于柯达胶卷。
2.10。ELISA试验
TGF -β测量使用TGF -βELISA定量工具后,制造商的协议(R & D, Inc .)。
2.11。统计分析
学生的团体之间的差异进行了分析以及。所有数据点都作为治疗组的平均值±标准偏差(SD)的意思。值小于0.05被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。木豆对肾功能的影响
如图1(一)、24小时尿蛋白排泄的老鼠注入DXR后逐渐增加。21天,DXR-treated老鼠的尿蛋白显著高于控制老鼠。开始28天,尿蛋白DXR-treated老鼠的迅速增加。木豆治疗显著降低尿蛋白在周5和6。DXR-treated老鼠会产生严重高脂血症(血浆甘油三酯毫克/毫升),治疗组(血浆甘油三酯那么严重毫克/毫升)(图1 (b))。治疗小鼠DXR导致面包和血浆肌酐水平显著增加了2.3和4.1倍,分别与对照组相比的数字1 (c)和1 (d))。预处理和木豆7天恢复了包子和血浆肌酐附近控制水平()。因此,木豆变弱肾毒性DXR的小鼠模型。
(一)
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3.2。木豆对肾纤维化的影响
就像许多其他器官系统,肾脏僵硬受伤后,这一过程越来越被认为是肾纤维化的重要驱动力(15]。与肾损伤的减少与药物治疗的效果,肾纤维化被马森染色(图评估2(一个))。肾纤维化的标志alpha-smooth肌肉肌动蛋白(αsma)、纤连蛋白和钙粘蛋白的上皮细胞标记被西方墨点法评估(16,17]。与蛋白尿数据一致,DXR老鼠的结果显示肾纤维化,就是明证成纤维细胞表达的增加标记(数字2 (b)- - - - - -2 (d))。治疗小鼠DXR引起肾蛋白表达显著增加的著名的成纤维细胞标记和钙粘蛋白在肾组织的表达增加(数据2 (b)- - - - - -2 (d))。木豆改善肾纤维化DXR的小鼠模型。
(一)
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(d)
3.3。木豆对肾脏氧化还原电位的影响
提升生产活性氧(ROS)的主要机制DXR-induced细胞毒性(18,19]。MDA和谷胱甘肽有助于评估ROS水平。在这项研究中,有一个显著增加肾脏的MDA DXR组与对照组相比)。与DXR组相比,小鼠DXR-induced肾毒性与木豆治疗显示,MDA水平显著降低(图3(一个))。我们也测量了谷胱甘肽浓度作为指标肾组织细胞氧化还原状态的调查木豆的抗氧化作用。DXR治疗后,谷胱甘肽的含量明显减少,如图3 (b)()。与DXR组相比,集团收到木豆显示显著逆转谷胱甘肽耗竭。这表明DAL维护肾脏的氧化还原平衡组织。
(一)
(b)
3.4。木豆对TGF -的影响β信号通路
TGF -β是一个关键的中介在肾纤维化的发病机制和诱发肾瘢痕主要通过激活其下游Smad信号通路(20.]。尽管TGF -β信号通路是由Smad2 Smad3, Smad2预防及/ Smad3-mediated肾纤维化(21]。因此,磷酸化的效应是Smad3 TGF -β介导肾纤维化。肾脏的磷酸化水平Smad3增加DXR(图4(一))。如图4(一),DAL-treated组表现出显著减少的磷酸化水平SMAD3相比DXR组()。因为胶原蛋白III是一个目标基因的鉴定及/ SMAD3,胶原蛋白三世的mRNA和蛋白表达在肾被q-PCR评估和免疫印迹。如数据所示4 (b)和4 (c)第三,胶原蛋白mRNA和蛋白水平DAL-treated组明显下降而DXR的组。Smad7作为对手的TGF -β信号通路通过阻止R-Smads互动与他们的受体或与Co-Smads竞争的一代R-Smad / Co-Smad复合物[22,23]。DXR治疗后Smad7 mRNA和蛋白水平相对较低,但这种效应逆转了木豆治疗(;数据5(一个)和5 (b))。木豆抑制了TGF -β信号通路在肾组织中。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
3.5。木豆TGF -的影响β蛋白表达
TGF -β是一种蛋白质控制增殖,细胞分化,在大多数细胞和其他功能。TGF -β重要的是感应的纤维化和EMT常与慢性炎性疾病的阶段24]。如图6,信使rna和蛋白质水平的TGF -βDAL-treated组相比明显下降与DXR-treated组。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
在最近的研究中,木豆改善DXR的严重肾病综合症引起的老鼠。尿白蛋白和血浆尿素和肌酐是肾毒性的最敏感的标记与肾损伤的诊断(25,26]。DXR治疗明显增加血清肌酐、面包和高脂血症。相比之下,木豆治疗导致明显降低DXR-treated这些参数的动物。这些结果表明,木豆可能提供相当nephroprotective对DXR的毒性效应。
肾纤维化是一个众所周知的原因在DXR-induced肾病肾功能衰竭27]。一些细胞通路,包括成纤维细胞激活和管状epithelial-mesenchymal过渡,已经被确认为肾纤维化的主要原因28]。在这项研究中,木豆管理显著改善肾纤维化。保护的主要机制之一的木豆在这个模型中包括抑制成纤维细胞激活。35天后DXR注入,纤连蛋白和αsma信使rna和蛋白质水平显著调节和木豆显著抑制他们的表达水平。我们也检查了信使rna和蛋白质水平的上皮钙粘蛋白标志。木豆治疗逆转减少钙粘蛋白。与这些结果组织学上一致,木豆治疗改善DXR-induced肾纤维化。
TGF -β调节在一些研究中,扮演一个关键的角色在管状epithelial-mesenchymal过渡的肾纤维化进展;治疗目标TGF -β已成功和良好的耐受性在动物模型9,21,23]。它最近被假定通过TGF - ROS调解纤维化β端依赖途径(29日,30.]。此外,ROS出现在DXR-induced肾病的发病机制31日,32]。有人建议,一个DXR半醌过程中起着重要作用DXR肾毒性。虽然半醌有一个短暂的生命,他们发起一连串的反应,生成活性氧与氧气分子相互作用后(5,33]。已经表明,DXR增加自由基的生产如超氧化物、羟基自由基、过氧化氢,有一个伟大的能力迅速反应和脂质引起氢过氧化脂质(法律流程外包)9]。法律流程外包是DXR摄入的有毒的表现之一;它的存在是由测量MDA水平。过度提供法律服务外包的报道在DXR-treated小鼠的肾脏34]。DXR-treated老鼠显示在当前的研究中,MDA水平的提高与控制老鼠。thiol-containing抗氧化剂谷胱甘肽是最重要,它在预防氧化损伤中起着举足轻重的作用35,36]。谷胱甘肽也被用作生物标记的氧化应激生物系统(37]。谷胱甘肽的耗竭已被观察到在DXR的老鼠34]。在我们的研究中,木豆MDA的含量降低,增加谷胱甘肽的水平。组织微环境的氧化还原平衡恢复是最可能的机制木豆施加nephroprotective效应和抑制管epithelial-mesenchymal过渡。
Smad3下游是一个关键的中介负责TGF -的生物效应β与家庭成员,他们调节几百个基因的转录。在肾纤维化Smad3强烈激活实验和人类肾脏疾病(20.]。磷酸化Smad3 DXR组的增加。这个观察表明,TGF -β在DXR-induced肾病/ Smad信号通路被激活。然而,这一现象被木豆逆转。胶原蛋白,纤维发生的基因,下游TGF -的目标β/ Smad3信号通路。木豆逆转的增加胶原蛋白i .此外,Smad7,它是一种抑制剂的TGF -β/ Smad信号通路,调节了木豆治疗。木豆也增加的mRNA和蛋白表达TGF -β在DXR-induced肾病。
总之,我们的结果表明,木豆的nephroprotective DXR小鼠模型的影响。木豆的nephroprotective效应可能是通过抑制TGF -介导的β全身的肾小管epithelial-to-mesenchymal过渡。这是一个早期的研究nephroprotective木豆的效果;行动的详细机制需要进一步澄清。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
徐Changliang项目的最初的想法。Yun Bo, Xianguo任Junting风扇,陈桑帕做所有的实验工作。在整个工作未红赵提供指导。瞿Haowei,他任Xianzhi荣,Yulian金分析了实验数据。徐大梁,杨董给了一些建议关于如何安排这些数据。徐Changliang起草了手稿。Changliang徐和帕陈提供了资金。Yun Bo, Xianguo任Junting风扇,和陈桑帕的贡献同样工作和应被视为第一作者。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81302829)和浙江省中药的主要项目,中国(没有。2015 zz002)。