文摘

系统性红斑狼疮(SLE)是一种慢性自身免疫性疾病,其特征是异常的T细胞免疫反应。弥漫性增生性狼疮肾炎(LN-IV)是最常见的,严重的,活动形式的狼疮肾炎。在这项研究中,我们调查了生产Th1、Th2, Th17细胞因子预测LN-IV的活动形式。ProcartaPlex多元分析板是用于检测血清Th1、Th2, Th17细胞因子分析。Th1和Th17细胞因子(地震、干扰素-γIL-12p70, il - 6和IL-17A)显著表达第四狼疮肾炎患者的血清相比,健康控制。然而,只有IL18高和白细胞介素6类第四和第三类狼疮肾炎。重要的是,Th1 / Th2的比率(地震/ il - 4)和Th17 / Th2 (IL-17A / il - 4)显著升高LN-IV与LN-III相比,LN-V和健康对照组。一致,血清细胞因子的地震、IL-17A和干扰素-γ明显表现在LN-IV病人肾小球和间质组织相比其他类包含IHC LN。中华民国进一步表明,地震是一个潜在的LN-IV的标志。数据从我们的研究表明,这些细胞因子的早期检测和量化可能有助于预测LN-IV的活动形式。

1。介绍

系统性红斑狼疮(SLE)是一种慢性自身免疫性疾病,其特征是对核自身抗原失去宽容,lymphoproliferation, multiorgan组织炎症。大多数的系统性红斑狼疮患者显示严重的临床表现,如尿液蛋白尿,血尿,尿,溶血性贫血,关节炎和中枢神经系统的参与。肾脏是由系统性红斑狼疮主要器官直接影响肾脏疾病导致结束阶段(ESRD)多达50%的病人在系统性红斑狼疮的发病和超过60%的患者在疾病过程中1,2]。狼疮nephritis-IV (DPLN)是最常见的,严重的和肾炎的活性形式;这类病人的预后成正比的周期实施诊断和有效治疗(3,4]。最近的一个大型临床研究的LN患者建议LN-II和LN-III类患者有利的结果而LN-IV, LN-V, LN-VI贫穷的结果(5),进一步强调早期发现的活动形式的LN是有价值的毅力来降低发病率和死亡率。目前,肾活检提供信息在肾组织损伤的程度,病理活动,肾脏疾病的严重性。然而,这是一种外科器械手术,有些患者不愿执行的过程。

异常的T细胞免疫反应在LN的发病机制中扮演着重要的角色6]。激活T细胞可以释放促炎细胞因子,促进中性粒细胞和巨噬细胞的激活7]。各种研究表明,活性形式的LN与Th1密切相关,外围的Th2, Th17细胞表达细胞因子,他们有很强的正相关性与系统性红斑狼疮疾病活动指数(咽部)[8- - - - - -10]。不同种类的T细胞表达在肾组织的组织学图像同质LN类人类[11]。此外,Th1 / Th2细胞因子的比值显著升高与咽部菌系统性红斑狼疮和关联,这进一步表明,细胞因子的不平衡剖面介导肾组织的炎症反应在发病过程中(12]。除了红斑狼疮患者有异常高水平的IL-17A连同干扰素-γ报告在先前的研究已经表明,血清水平的增加IL-17A作为强有力的炎症反应(12,13]。尽管如此,肾活检是公认的过程,是一个明确的诊断的“金标准方法”LN (14]。另一方面,研究人员也辩论的重复使用LN肾活检监测疾病活动,虽然它是一个行不通的方法由于一个侵入性程序(15]。,因此,从组织学和形态学方面的重要作用,Th1、Th2, Th17细胞因子在LN诊断预测可能备用。

在这里,我们的研究表明,血清促炎细胞因子的地震,地震/ il - 4和IL-17A / il - 4 LN-IV发展的重大作用,和民国进一步表明地震作为LN-IV潜在的标记。因此,在系统性红斑狼疮患者血清细胞因子分析的使用可能协助找到组织学类型的LN早些时候,因此追求特定的免疫抑制治疗及时,减少ESRD的快速发展的可能性。

2。材料和方法

2.1。病人的特点

这项研究包括49(45女4男)新诊断为系统性红斑狼疮肾炎患者,不接受任何免疫抑制药物剂如甲基强的松龙(MP)、环磷酰胺(CTX),霉酚酸(MMF)。所选患者汉族人从住院部肾脏病学会在2013年1月至2015年11月。病人完成美国风湿病学院(acr - 1997)分类标准SLE并发感染,没有被招募在这项研究[16]。患者肾活检诊断的根据世界卫生组织(世卫组织- 1995)分类。他们被分为三组,LN-III平均年龄(,),LN-IV (,)和LN-V (,),控制和健康志愿者(,)。健康的控制个人的年龄和性别选择的厦门大学第一附属医院肾脏学。肾组织病理学资料,详细的疾病史,和总系统性红斑狼疮疾病活动指数(咽部)获得的病人。咽部是由一个独立的评估临床医生。

2.2。道德声明

这项研究是通过制度研究委员会(IRB)厦门大学第一附属医院。书面通知同意了所有的参与者:红斑狼疮肾炎病人和志愿者。以防参与者能力受损提供同意,获得书面同意的近亲地位或照顾者。

2.3。样本集合

在无菌技术,清晨,空腹静脉血样本(共5毫升)从每个病人,把在一个光管在同一天的肾活检。血清是由离心分离,享年1000岁g在20°C,但在一些样品,由于脂质含量高的存在,离心,享年10000岁g 10分钟4°C。后续组血清分数是由使用标准血清分离器管。血清是储存在−80°C到进一步使用。

2.4。评估疾病活动

评估疾病活动通过结合临床病史,体格检查,机关具体的功能测试,和血清学的研究。咽部总分当日测定的血清样本收集和评估由一个独立的医师和临床试验与我们的研究结果(17]。咽部总分是105。通常分为三个类别的得分少于5和5 - 10和10多被认为是低,介质,分别和高疾病活动。在我们的研究中所有的病人咽部很高。咽部的平均值是LN-III (),LN-IV ()和LN-V ()。此外,通过使用肾肾参与评估项目的咽部菌2000代表的总和四kidney-related参数:血尿(> 5细胞/高通滤波器)、脓尿(> 5细胞/高通滤波器),蛋白尿(0.5通用/天),和肾铸。每个SLEDAI-R项得到4分(17]。

2.5。测定Th1、Th2和Th17表示对血清细胞因子和Lipocalin-2水平

血清水平的干扰素-γ肿瘤坏死因子-α2、地震- il - 4、IL-5 il - 6,并使用ProcartaPlex IL-13是由多路复用分析面板,affymetrix (eBioscience epx110 - 10810 - 901),和Luminex 100/200。血清IL-17A和细胞因子il - 10水平分析酶联免疫试剂盒(人类铂ELISA、eBioscience affymetrix)根据制造商的指示。同样,人类Lipocalin-2 / NGAL ELISA (BioVendor RD191102200R)是用于定量检测血清NGAL的所有组的病人。每个血清样本测试两个磁珠井在人类ProcataPlex面板、ELSIA IL-17A, il - 10, NGAL。平均结果和计算每条指令。

2.6。免疫组织化学分析

anti-IL-18 IL-17A,干扰素γ抗体是来自Abcam(剑桥,麻萨诸塞州)。deparaffinization和补液后,部分接受3% H₂O₂其次是阻塞山羊血清在PBS为10%。被染色的部分地震,干扰素-γ一夜之间,IL-17A在4°C,其次是生物素共轭二次抗体。之前报道的半定量的评价了。浸润的单核细胞的细胞因子表达式(跨国公司)肾小球的检查和赋值从0到3如下:0,没有染色,类似于在消极的控制样本;1、焦染色;2多病灶的激烈跨国公司染色;3、在整个跨国公司激烈的染色。分析了肾小球。肾小球的分数计算以下方程:阳性总分=(%跨国公司染色0)+(%跨国公司染色1)+(%跨国公司染色2)+(%跨国公司染色3)。

2.7。实验室参数

我们已经采取了重要的常规实验室参数支持系统性红斑狼疮肾炎患者的诊断。这些参数C3, C4(浊度计),CysC(乳胶粒子增强Immunoturbidimetric方法),24小时尿蛋白(缩二脲Colorometry),安娜(间接免疫荧光法(IIF)和dsDNA (短膜虫属luciliae)被检测到。

2.8。统计分析

SPSS统计软件,版本20.0 (SPSS,芝加哥,IL),用于数据分析。定量变量作为意味着±SD,中位数,在适当的地方差。克鲁斯卡尔-沃利斯,单向方差分析方差分析测试是用来比较独立样本中位数。总体上的明显差异,细胞因子水平与其他独立变量组相比在LN-IV LN和健康控制通过使用双尾Mann-Whitney测试。长枪兵相关应用于评估与咽部菌血清细胞因子水平的相关性分数,常规的实验室参数,和血清细胞因子水平和比率。5.0数据绘制与棱镜软件程序。被认为具有统计显著性值小于0.05。接受者操作特征曲线(ROC)被用来确定最佳预测LN-IV截止点。

3所示。结果

3.1。人口数据的狼疮肾炎患者和健康对照组

狼疮肾炎患者和健康对照组的人口中所描述的表1。年龄和性别无显著差异的群体。

3.2。血清水平的Th1、Th2和Th17细胞细胞因子表达,咽部,24小时尿蛋白、半胱氨酸C, C3, C4, dsDNA

血清水平的Th1细胞因子(IFN -γ、地震和IL-12p70)和Th17细胞因子(IL-17A和il - 6)与健康相比明显升高狼疮nephritis-IV控制。此外,所有LN患者表达高水平的NGAL这表明LN患者的肾功能失调(表2)。此外,血清的地震比单独的显著高水平的地震在LN-IV LN-III(相比),LN-V (),和健康的控制()(图1(一))。此外,只有IL18高和白细胞介素6类第四和第三类狼疮肾炎。血清水平的地震,干扰素-γ所示,IL-12p70在LN-IV咽部呈极显著的正相关关系(;,;,;)分别,但地震与24小时尿蛋白不是LN-IV显著相关的患者(;)。然而,Th2细胞细胞因子(il - 4、IL-5 il - 10和IL-13)没有升高我们的LN患者组相比,健康控制。特此,Th1和Th17细胞因子有重要作用的发展LN-IV同时Th2细胞细胞因子在系统性红斑狼疮肾炎有关LN-IV可能不是非常具体。

3.3。免疫组织化学染色,光学显微镜观察

Th1 (IFN -的口供γ和地震)和th 17 (IL-17A)石蜡包埋IHC测定肾组织。我们发现相当大的地震,干扰素-γ,IL-17A抗体沉积在肾组织相比LN-IV LN-III和LN-V病人。然而,只有一个LN-IV中观察到的地震-表达显著差异,LN-III, LN-V病人(图2)。

3.4。Th1失衡,Th17 / Th2(地震,干扰素γ和IL-17A / il - 4)细胞因子在狼疮肾炎

虽然在LN Th2细胞因子并没有改变,最近的研究已经表明,Th1 Th17和Th2失衡LN的发展有至关重要的作用。因此,这些细胞因子的比率进行了分析。正如所料,血清Th1 / Th2细胞因子的地震/ il - 4水平明显高于与其他群体相比,LN-IV狼疮肾炎LN-III (),LN-V (),和健康的控制()。同样,Th17 / Th2比率也计算的水平血清IL-17A除以的il - 4 (il - 4的如果实际观测值的范围,然后再考虑最小灵敏度值根据协议1.5);在LN-IV IL-17A / il - 4的比例明显高于LN-III LN-V。然而,没有观察到显著差异LN-IV LN-III(相比)和LN-V (的比率)干扰素-γ/ il - 4(图3)。此外,我们发现,Th1 / Th2比率的地震/ il - 4和干扰素-γ/ il - 4,咽部有显著相关性(;和;),分别(图3)。然而,与24小时尿蛋白(没有相关性;和;),分别。有趣的是,我们还分析了单一细胞因子之间的相关性,Th1 / Th2或Th17 / Th2比率,和肾咽部。正如预期的那样,我们发现干扰素-γ、地震、IL-17A, Th1 / Th2比率(地震/ il - 4和干扰素-γ/ il - 4)肾咽部菌有显著相关性,而无显著相关性IL-17A / il - 4和观察肾咽部(图5)。

3.5。敏感性和特异性的细胞因子LN-IV病人

民国执行测试来确定诊断的特异性和敏感性升高的细胞因子的预测LN-IV(表3和图4)。总之,这些数据显示,地震的关键作用,IL-17A和地震/ il - 4细胞因子在发病机理的比率LN-IV高度显著。

4所示。讨论

狼疮肾炎混合形态和组织学表现了不同的临床表现和后果。狼疮肾炎的早期诊断是一项具有挑战性的工作为临床从业人员没有一个肾活检的证据,因为肾活检不能经常或可能被推迟由于各种技术问题在医院设置。组肾小球炎症引发的细胞因子,最后把不可逆肾损害。然而,发病机制是不确定的。有趣的是,T细胞可以相互地抑制其他组T细胞的功能;Th1细胞产生的细胞因子可以负调控Th2细胞的功能,反之亦然(18]。当地激活T细胞表达的促炎细胞因子通常是增加等离子体水平和考虑肾组织病理19]。此外,细胞介导免疫反应导致系统性红斑狼疮患者的增生性肾小球肾炎主要是由Th1细胞衍生因子(11,20.]。之间的平衡Th1、Th2和Th17狼疮肾炎患者外周血CD4细胞是组织病理学的关键决定因素LN的照片(9,21]。

有趣的是,在我们的研究中我们发现,Th1、Th2和派生Th17细胞因子产生有害的影响在不同组织病理学课程的LN的进展。因为地震被称为干扰素-γ促炎细胞因子诱导细胞因子因素,小说支持向Th1细胞免疫反应的极化及其水平显著升高血清和突出在肾小球组织染色LN-IV患者相比LN-V [8]。一致,我们发现唤起,增加血清水平的地震-存在于LN-IV患者相比LN-III (),LN-V ()和健康对照组()。之前的研究也表明,地震的主要网站在LN是肾小球表达,特别是在LN-IV这可能是由肾小球渗透激活巨噬细胞(20.]。组织病理学活跃阶段肾脏的病人可能有更多的机会来堆放这些巨噬细胞在肾小球和随后的释放到循环作为一种防御机制。在这样的条件下,当地的表达地震招募从边缘通过IL-18R血液进入肾小球炎症细胞(22]对Th1和极化的免疫反应。这可能是海拔的原因在我们LN-IV患者血清的地震(8]。十年以来,地震的特征和系统性红斑狼疮的治疗方法都是有争议的,尽管其发展的临界值LN (8,20.]。最近,LN的小鼠模型研究表明antroquinonol激活/抑制T细胞增殖减少肾interleukin-18的生产。已改善蛋白尿,血尿,肾功能障碍,和发展严重的肾损伤,尤其是细胞新月形成、嗜中性粒细胞浸润,在肾小球和T细胞增殖,以及periglomerular间质炎症(23]。

随后,Th1、Th2细胞因子处于平衡状态的肾小球DPLN以及转向IFN -γ,远离Th2细胞因子(10,11]。然而,干扰素,γ和il - 4以复杂的方式对抗th17通路。相互之间的交互干扰素-γ、il - 4, IL-17A发生,IL-17A表达式描述一个特殊辅助T细胞调节组织炎症的作用[24]。同样,在我们的研究中我们发现,Th1 / Th2细胞因子的比率和地震/ il - 4被深刻地升高LN-IV LN-III(相比),LN-V (),和健康的控制()和咽部菌显著相关(;)。因此,干扰素,γ/ il - 4也显著升高LN-IV相比健康控制()。因此,Th1、Th2细胞因子的比率可以反映细胞因子体内平衡和指出的优势Th1、Th2细胞细胞因子在红斑狼疮的发病机制。这些比率与咽部菌显著相关(12]。尽管在血清il - 4细胞因子没有明显升高在我们的研究中,Th1 / Th2细胞因子的比率明显增加尤其是LN-IV病人。这可能是由于平衡T细胞的特征子集T细胞在炎症过程可能相互地抑制其它子集的T细胞的功能。Th1细胞产生的细胞因子可以负调控Th2细胞的功能,反之亦然在活跃的炎症(18]。之前的研究也显示,在系统性红斑狼疮患者Th1 / Th2比率较高,积极与咽部菌(12]。相比之下,一项研究表明,Th1 / Th2比率与24小时尿蛋白显著相关,但不与咽部菌(8]。然而,在我们的研究高比率的Th1 / Th2明显与咽部LN-IV而不是与24小时尿蛋白和其他实验参数。此外,我们的研究还发现,肾SLEDAI-R与单一IL18显著相关,干扰素-γIL-17A, Th1 / Th2比率。,先前的研究表明,肾活检的时候,SLEDAI-R LN-IV成绩显著提高,优于其他指标来预测与LN肾损伤的儿童(25]。促炎反应的增强诱导组织损伤多种多样的肾组织和恶化咽部与LN的活跃阶段,尤其是LN-IV。

th17是新发现的辅助T细胞子集成为了各种自身免疫性疾病发病机理的一个特点。最近,各种研究报道,系统性红斑狼疮IL-17A水平与健康对照组相比升高[26- - - - - -28]。本地化IL-17A和干扰素的突出表现γ发生在患者的肾组织LN-III和LN-IV LN-II包含IHC染色。因此,Th17细胞似乎是负责组织炎症和损伤(29日,30.]。不同的研究表明,血清LN患者IL-17A水平显著升高相比,系统性红斑狼疮患者没有肾炎和健康对照组,但它没有对临床和实验室参数如白细胞、血小板、血尿,dsDNA,安娜,C3, C4 (31日]。相比之下,IL-17A和干扰素-γ在系统性红斑狼疮明显放大;主要IL-17A充当一个强有力的预测细胞因子显著,因为它是与疾病活动和与更多的脓尿和蛋白尿,而血清干扰素-水平γ与更多的脓尿和血尿(28]。在我们的研究中,在LN IL-17A水平明显升高,尤其是LN-IV LN-V(相比)和健康的控制()。尽管如此,血清IL-17A之间没有显著相关水平,咽部菌在LN患者,按照类似的发现从先前的研究[31日]。这可能是由于异质性的系统性红斑狼疮肾炎或小样本大小。以前的研究也表明,一个增强Th17细胞反应,直接与系统性红斑狼疮患者的疾病活动的重要作用IL-17A红斑狼疮的发病机制。然而,Th1之间有一种平衡机制(IFN -γ)和Th17 (IL-17A)监管和生产异常的il - 6在系统性红斑狼疮,与增加Th17细胞反应(32]。因此,系统性红斑狼疮患者CD4的频率增加⁺Th17⁺细胞与健康对照组相比,但它改变了对系统性红斑狼疮Th17和Th1反应之间的平衡。王等人。33)表明,IL-17A表达T细胞主要在肾小球和间质组织渗透。此外,治疗的封锁IL-17A可能提供治疗LN的目标。因此IL-17A可能无疑在LN的发病机制中的作用。相比之下,最近的一项研究表明,IL-17A免疫反应在LN的发病机制中扮演没有主要的角色在推广/ lpr和NZB / WF-1老鼠,它认为IL-17A靶向治疗可能不支持34]。这样的争议,此外,它注意到,系统性红斑狼疮患者血清IL-17A细胞因子水平升高与中枢神经系统的参与和提高Th17 / Th2比率,与咽部菌(35]。这可能是由于这一事实IL-17A是由几个细胞类型包括CD4水平⁺Th细胞,γδT细胞,T细胞双重否定,Foxp3⁺Treg细胞(36,37]。然而,我们发现,血清IL-17A水平显著高于LN-V LN-IV患者和健康对照组。按照这个结果,我们进一步调查Th1细胞细胞因子的表达(IL18和干扰素-γ)和Th17细胞细胞因子在石蜡包埋IL-17A肾活检组织通过包含IHC染色法。地震,干扰素-γ明显,IL-17A沉积在肾活检组织从四级LN患者相比LN-III和LN-V(图2)。Th1和Th17细胞的渗透到肾小球是与先前的研究一致8,9,11]。在此,我们得出这样的结论:这些细胞因子对LN的发展至关重要,特别是LN-IV。虽然il - 6在LN-IV患者高于健康对照组在我们的研究中,这可能是由于有可能参与的细胞因子增强Th17细胞反应(32]。

在我们的研究中,我们发现,地震和地震/ il - 4比率是强大的预测(ROC曲线)的血清细胞因子和显著相关,总在LN-IV肾咽部。这个结果是由其他研究已报道,细胞因子的生产增加活跃DPLN肾炎患者(8,12,20.]。同样,在LN-IV IL-17 / il - 4的比例也增加,但不是与咽部菌显著相关;然而,它是与先前的研究一致28,31日]。

5。结论

总之,T细胞子集LN在发病机制中起着关键作用。特别是在我们的研究中血清的地震,地震/ il - 4, IL-17 / il - 4在LN-IV病人最有力的预测因子。这些T细胞亚群测定细胞因子分析对系统性红斑狼疮患者NGAL之前可能有助于早期预测LN-IV肾活检和指导临床医生及时启动特定的免疫抑制治疗,减少ESRD的倾向。立即在此,这些细胞因子的测量可能有助于预测狼疮肾炎的活性形式,特别是LN-IV前肾活检;如果活检不能容易地执行。不过,在那之前,肾活检是确诊的金标准方法建立LN。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Keshav Raj Sigdel和利华国际段的贡献同样这项工作。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金支持利华国际段(81302564)和国家自然科学基金委福建(2014 j01439 y张)。