文摘

疱疹疾病引起的单纯疱疹病毒1型(1型单纯疱疹病毒)是一个棘手的状况。这是一个公共卫生关注的重要问题。我们的本研究的目的是验证壳聚糖作为免疫佐剂的作用调节下特别单纯疱疹病毒1型(1型单纯疱疹病毒)感染。提前HSV感染、壳聚糖、热灭活的绿色荧光蛋白表达HSV (G-HSV)和壳聚糖和G-HSV被用来预处理ICR小鼠1型单纯疱疹病毒感染。使用流仪分析,t细胞的频率,单核细胞、树突状细胞(dc),和自然杀伤(NK)细胞表面表达的分析,,,,,细胞。在HSV感染的老鼠,壳聚糖处理显著增加的频率t细胞(%)与对照组(%,)。直流和NK细胞的频率也明显不同壳聚糖治疗老鼠和老鼠的控制。此外,anti-HSV IgG抗体在壳聚糖对小鼠表达下调。这些结果表明,壳聚糖是一个潜在的调制器或作为佐剂的免疫刺激1型单纯疱疹病毒感染的老鼠。

1。介绍

壳聚糖是一种生物相容性、生物可降解和天然无毒的生物聚合物阳离子高潜力。它是甲壳素的脱乙酰作用,产生的一个主要组件在蟹等甲壳类动物的壳,虾,和小龙虾1]。壳聚糖是一种安全有效的佐剂候选人适合广泛的预防和治疗性疫苗。最近,壳聚糖对其商业应用已经受到了相当大的关注在生物医学、食品和化学工业(2- - - - - -4]。壳聚糖具有许多生物效应,包括抗菌(5,6)和hypocholesterolemic活动(7,8)对药(9,10]。壳聚糖溶液增强体液免疫和细胞免疫反应皮下接种疫苗(11]。疫苗接种与壳聚糖水凝胶是有效的树突状细胞疫苗在肿瘤保护更容易检测到免疫相关的保护(12]。最近,据报道,壳聚糖能调节免疫反应通过增加t细胞,b细胞、单核细胞和巨噬细胞在正常小鼠细胞标记(13]。一些研究人员20多年前发现,壳聚糖可以是一个有效的激活的巨噬细胞和NK(自然杀伤细胞)细胞与免疫佐剂功能(14- - - - - -16]。

单纯疱疹病毒1型(1型单纯疱疹病毒)是一种常见的和不稳定的人类的病原体导致各种各样的疾病从轻微的皮肤失调到致命的脑炎。它已经被广泛的研究在动物模型(17- - - - - -19]。在小鼠模型中,HSV-specific CD4和CD8 T淋巴细胞已被证明在控制主要扮演重要角色和HSV感染复发20.]。在人类复发病灶,单核细胞和CD4 T淋巴细胞渗透首先其次是CD8 T淋巴细胞似乎清楚HSV感染(21- - - - - -23]。HSV感染的角化细胞体外和体内诱发一系列趋化因子和细胞因子的分泌干扰素等β、il - 12、il - 1β,il - 6 (24]。β趋化因子可能吸引单核细胞和CD4和CD8 T淋巴细胞病变。干扰素-α/β和il - 12乘火车Th1细胞因子反应模式HSV抗原刺激CD4和CD8 T淋巴细胞(25]。最近,NK之间不同的免疫突触的重要性,和CD4 t细胞在疱疹的皮肤损伤(26]。从这些结果,直流和NK细胞可以被视为HSV疫苗开发的目标。在我们以前的结果,用口服治疗chitosan-pCIN-mIL-4混合物被发现导致表达il - 4的信使rna和蛋白质在肠组织和增加小鼠血清il - 4水平。据报道,壳聚糖封装pDNA使GFP基因进入细胞体内的有效转移(27]。

在这项研究中,我们研究了壳聚糖作为immune-stimulatory或免疫调节的作用辅助分析频率在1型单纯疱疹病毒感染的抗原递呈细胞(apc)在LN和外周血单核细胞(PBMC)的正常小鼠。

2。材料和方法

2.1。实验组小鼠和

在这项研究中,4 - 5-week-old ICR雄性老鼠。动物是依照协议批准的亚州大学医学院动物保护委员会(amc - 102,韩国水原韩国)。

2.2。热灭活GFP-HSV做准备

绿色荧光蛋白结合单纯疱疹病毒(GFP-HSV)的礼物教授靖川口(28]。GFP-HSV股票在维洛细胞表面的单层文化传播与最低基本培养基(MEM)补充10%牛血清和抗生素。GFP-HSV灭活在65°C孵化器的30分钟。进一步证实了失活文化。热灭活的绿色荧光蛋白表达HSV (G-HSV)和200毫升PBS和口头管理三次十天的时间间隔。

2.3。壳聚糖的制备和管理

壳聚糖是由甲壳素的红蟹(Chionoecetes对虾治疗与氢氧化钠)。隔离50 KDa的壳聚糖、尺寸排阻色谱法(SEC)和超滤法(29日]。后的洗脱液分数秒冻干脱盐和重新溶解在蒸馏水通过0.45过滤μm膜过滤,然后应用到超滤膜安装在超滤单元(美国微孔Amicon 8400)。过滤材料是冻干的,随着在蒸馏水中,沉淀在丙酮/醚(50/50,V / V)混合,和真空干燥(10⁻³托)。壳聚糖粉末溶解在1%醋酸(壳聚糖醋酸)0.35% (w / v)和口服三次单独或与G-HSV为期10天的间隔。醋酸1%被用作控制在这个研究。

2.4。1型单纯疱疹病毒感染的体内

执行病毒接种使用出版过程(30.]。短暂,耳垂的老鼠挠针和接种1×10⁶点状单位(p.f.u。) /毫升的1型单纯疱疹病毒(F株)生长在维洛细胞。病毒接种两次进行为期10天的间隔。病毒接种的小鼠肌内注射安乐死的后腿与氯胺酮和甲苯噻嗪鸡尾酒(15毫克/公斤氯胺酮和10毫克/公斤甲苯噻嗪)。壳聚糖是HSV接种前服用。壳聚糖(芽),热灭活GFP-HSV (G-HSV),或壳聚糖G-HSV(芽+ G-HSV)口头管理到正常小鼠三次为10天的时间间隔。第二天第二次接种后,老鼠被牺牲了。HSV感染,最后壳聚糖政府10天后,HSV接种。第二天第二HSV接种后,老鼠用于进一步的实验。PBMC和淋巴结细胞被孤立使用流式细胞仪分析细胞的频率。图代表一个细胞阳性表示标记的频率。 The numbers of mice used in each group were marked in figures and figure legends.

2.5。流式细胞术

PBMC和LN细胞从老鼠和孤立与PBS洗,之后1×10⁶在4°C细胞孵化30分钟以下抗体:FITC anti-mouse CD4, PerCP-Cy5.5 anti-mouse CD8, PE-Cy7 anti-mouse CD3, APC anti-mouse CD14, APC anti-mouse CD11c, FITC anti-mouse CD11b, PE anti-mouse NK1.1, FITC anti-mouse DX5, PE anti-mouse IL-7R,和APC anti-mouse IL-15Ra (eBioscience, Inc .)、美国)。细胞分析使用流式细胞分析仪(加利福尼亚州圣何塞,正欲FACSCanto二世,美国)。

2.6。通过ELISA测量1型单纯疱疹病毒免疫球蛋白

牺牲后小鼠颈椎脱位,血液从心脏和收集血清免疫球蛋白水平进行了分析使用一个商业酶联免疫试剂盒的鼠标1型单纯疱疹病毒(Mouse-Rat 1型单纯疱疹病毒免疫球蛋白g酶联免疫试剂盒,GenWay生物技术公司,CA,美国)。ELISA进行根据制造商的指示。样品的吸光度值读取使用Bio-Rad模型在450 nm波长170 - 6850微型板块读者。

2.7。统计分析

所有数据被表示为均值±SD。统计实验组之间的差异取决于学生的以及和Bonferroni调整。统计分析进行了使用MedCalc 9.3.0.0®版本。统计学意义是考虑值小于0.05。

3所示。结果

3.1。壳聚糖对扩散的影响T淋巴细胞在淋巴结和PBMC或HSV感染

评估壳聚糖对T淋巴细胞增殖的影响,我们管理的壳聚糖,G-HSV或壳聚糖与口头G-HSV正常小鼠三次为10天的间隔。最后政府后第二天,老鼠牺牲或感染了HSV 10天后所描述的材料和方法。HSV接种后第二天,PBMC和淋巴结细胞被流式细胞仪分离和分析。的频率在HSV感染小鼠t细胞在淋巴结(%,,%,%,分别地)在没有感染的小鼠(低于%,%,%,%,resp)(图1(一))。虽然频率感染小鼠的t细胞在淋巴结显示较低的表情,他们之间没有显著不同的壳聚糖和壳聚糖与G-HSV(图的结合1(一))。在PBMC HSV感染的老鼠,的频率壳聚糖对小鼠t细胞((%)显著高于比对照组()%)(图1 (b))。然而,的频率t细胞在小鼠接受G-HSV或壳聚糖的组合和G-HSV (%,%,分别地)在未感染组(低于%或%)。

在相同的处理条件下,对的比例HSV感染的t细胞在淋巴结组,G-HSV治疗组表达较低(比未感染组(比例)%与%,,图1 (c))。没有HSV感染,G-HSV治疗调节()的频率t细胞相比,控制。联合治疗与壳聚糖和G-HSV表达下调()的频率t细胞G-HSV相比。在HSV感染,G-HSV治疗表达下调()的频率t细胞相比,壳聚糖的控制,而联合治疗和G-HSV恢复的频率t细胞控制水平(G-HSV与壳聚糖+ G-HSV,)。在PBMC的老鼠没有HSV感染,的模式t细胞频率在LN类似。在与HSV感染小鼠,壳聚糖治疗调节()的频率t细胞相比,控制(图1 (d))。代表流式细胞仪的频率直方图和细胞在HSV感染组出现在图1 (e)。

3.2。相关IL-7R IL-15Rα表达在淋巴结和PBMC HSV感染的老鼠

IL-15 / IL-15Rα细胞表面使持续IL-15活动和导致的长期生存CD8记忆t细胞(31日]。此外,IL-7R和IL-15R表达式与消失的记忆t细胞在呼吸道流感感染(32]。在我们的实验中,评估的相关性IL-7R IL-15Rα壳聚糖治疗孤立PBMC和LN HSV感染或感染小鼠在相同条件下进行流式细胞仪分析。结果如图1。LN与HSV感染的频率IL-7R细胞组之间没有显著差异。在LN HSV感染,IL-7R细胞的频率没有显著不同组间。然而,IL-7R细胞的频率与HSV感染四组相比显著降低没有HSV感染(图2(一个))。在PBMC, IL-7R细胞的频率在HSV感染组小鼠相比下降没有HSV感染(图2 (b))。然而,这样减少未达到统计上的显著水平。

IL-15R的频率α细胞在LN明显调节HSV感染的老鼠相比HSV感染的老鼠。然而,IL-15R频率的差异α细胞在壳聚糖和壳聚糖和G-HSV不显著(图2 (c))。在PBMC, IL-15R的频率α细胞显著下调HSV感染组小鼠相比没有HSV感染(图2 (d))。没有HSV感染,壳聚糖和G-HSV增加()IL-15Rα⁺细胞频率相比G-HSV孤单。

3.3。壳聚糖对CD14的频率没有影响

CD14是Glycosylphosphatidylinositol (GPI)表面固定分子尤其是表达单核细胞和巨噬细胞33,34]。它扮演了一个角色在宿主防御呼吸道感染甲型流感病毒(35]。一些报告表明,CD14充当消极监管机构在t细胞活化36,37]。确定壳聚糖的作用在HSV感染单核细胞和巨噬细胞,CD14表达进行了分析。壳聚糖不显著调节的频率细胞在LN和PBMC HSV感染小鼠或没有HSV感染的小鼠(数字3(一个)和3 (b))。细胞群没有明显影响壳聚糖,不管HSV感染。图3 (c)代表的流式细胞仪直方图的频率在PBMC细胞。

3.4。树突状细胞(dc)是显著下调在PBMC HSV感染

DCs是迅速分化细胞。他们能够捕捉和处理抗原和迁移到淋巴网站呈现抗原t细胞,从而诱导适应性免疫(38]。CD11c是直流的识别的主要标志39,40]。在小鼠模型中,它已经表明,1型单纯疱疹病毒利用直流背后的机制可能涉及CD11c [41]。因此,我们观察到DCs在这项研究的参与。在淋巴结,CD11c的频率⁺细胞低感染小鼠在对照组(%)或仅在经壳聚糖处理后组(%)或在壳聚糖的结合治疗组和G-HSV (%)比未感染组(%,%,%,resp)(图4(一))。然而,类似的CD11c表达式⁺治疗后观察细胞与G-HSV独自在被感染的老鼠(%)和未受感染的老鼠%)。类似的表达CD11c模式⁺在PBMC细胞也被证实。所有治疗与HSV感染的老鼠显示显著降低CD11c的表情⁺(%控制,%在壳聚糖,在G-HSV %,%与未感染的老鼠相比,壳聚糖与G-HSV) (%,%,%,%,分别地。,图4 (b))。在HSV感染的PBMC,壳聚糖显著调节CD11c⁺细胞与控制()。CD11b的频率⁻CD11c⁺显示出了相似的CD11c模式表达式⁺频率在LN和PBMC HSV感染的老鼠(数字4 (c)和4 (d))。

3.5。自然杀伤细胞的频率显著增加感染HSV后淋巴结和PBMC

自然杀伤(NK)细胞免疫反应的关键角色在早期阶段对各种类型的病原体(42,43]。1型单纯疱疹病毒感染的初期由1型干扰素的活性影响,巨噬细胞和NK细胞,可以限制早期病毒复制和传播44]。我们调查了NK细胞是否可以与壳聚糖与1型单纯疱疹病毒感染后产生的刺激。尽管NK细胞相关标记NK1.1表达式中没有观察到明显的淋巴结感染组或未感染组,NK1.1的频率⁺细胞明显高于与壳聚糖和G-HSV G-HSV和治疗HSV感染组相比在HSV感染组(图5(a))。在PBMC, NK1.1⁺细胞高表达所有感染组(控制、壳聚糖、G-HSV或壳聚糖G-HSV) (%在控制,%在壳聚糖,在G-HSV %,%在壳聚糖G-HSV),相比那些未感染组(%,%,%,%,分别地。,图5(b))。壳聚糖结合G-HSV调节()NK1.1⁺细胞与对照组相比没有HSV感染(图5(b))。CD3的淋巴结或PBMC的比例没有显著不同组间有或没有HSV感染(数字5(c)和5(d))。CD3的人口⁻NK1.1⁺在PBMC细胞也分析和淋巴结。在PBMC, CD3^{- - - - - -}NK1.1⁺细胞被适度增加组与HSV感染(%,%,%,%,分别地。,in control, chitosan, G-HSV, and chitosan with G-HSV) compared to that without infection (%,%,%,%,分别地。,图5(f)),除了那些在壳聚糖的结合治疗组和G-HSV(图5(f))。在淋巴结,CD3中没有显著差异⁻NK1.1⁺表达式(图5(e))。为进一步确认NK细胞的参与在这个实验中,DX5另外分析在PBMC和淋巴结。DX5,另一个NK标记,用于识别NK细胞(45]。在PBMC HSV感染,壳聚糖显著()调节DX5⁺细胞与对照组相比(图5(h))。在壳聚糖治疗组,DX5⁺细胞表达下调与HSV感染的小鼠相比,那些在HSV感染的老鼠。在HSV感染组淋巴结,DX5⁺细胞表达下调小鼠治疗相比,壳聚糖和G-HSV单独控制老鼠或经壳聚糖处理后的小鼠(图5(g))。没有明显差异的频率DX5⁺细胞与HSV感染小鼠和那些没有HSV感染(图5(g))。CD3^{- - - - - -}DX5⁺NK细胞频率进行了分析。在没有HSV感染的小鼠PBMC,壳聚糖显著调节CD3⁻DX5⁺细胞与控制(图5(j))。CD3没有显著差异⁻DX5⁺NK细胞之间的频率与HSV感染的老鼠和老鼠没有HSV感染(HSV感染:%,%,%,%,分别地;没有HSV感染:%,%,%,%,分别地。,图5(j))。类似的表达CD3的模式^{- - - - - -}DX5⁺在LN(图5(我))。与HSV感染,壳聚糖与G-HSV组显著下调CD3^{- - - - - -}DX5⁺细胞控制相比,壳聚糖或G-HSV治疗组(图5(我))。流式细胞仪的NK细胞频率直方图PBMC在图所示5(k)。

3.6。壳聚糖在早期感染1型单纯疱疹病毒具有保护作用

确定壳聚糖对1型单纯疱疹病毒感染的保护作用,血清免疫球蛋白水平的1型单纯疱疹病毒控制和壳聚糖治疗HSV感染组小鼠被ELISA测定。最近的一些研究表明,显著增加HSV活化的免疫球蛋白g是一个指标或当前或最近感染的46,47]。在这项研究中,生产1型单纯疱疹病毒免疫球蛋白表达下调(在壳聚糖组()国际单位/毫升)相比,在与HSV感染对照组(国际单位/毫升,图6)。这一结果表明,壳聚糖对1型单纯疱疹病毒感染有保护作用。

4所示。讨论

先天免疫防御感染后立即被激活。他们比特定的反应更迅速。高架先天防御可以推迟疾病的发作症状,给予特定的免疫防御足够的时间去开发一个更持久的保护。免疫增强药可以改变动物的免疫状态提高他们的工作能力捍卫一种疾病。最近的一项研究表明,壳聚糖对口蹄疫病毒的抗病毒活性,壳聚糖强烈调节辅助细胞参与免疫反应的功能活动,如巨噬细胞和粒细胞(48]。

单纯疱疹病毒感染可能产生免疫力的形式循环抗体和细胞介导免疫包括辅助T, T细胞毒性和记忆T淋巴细胞在人类和动物49,50]。此外,1型单纯疱疹病毒可以成为潜在的受感染的主机和接受复活,导致复发性疾病即使主机可能完好无损,先天和后天免疫防御51,52]。UV-inactivated 1型单纯疱疹病毒不能抄录其早期基因,病毒导致不能重复53]。此外,我们证实chitosan-pcDNA-EGFP-mIL4 DNA载体混合可以提高1型单纯疱疹病毒引起的遗传病的病症状通过增加细胞因子il - 4 (27]。

我们仅对正常小鼠与壳聚糖,热灭活的绿色荧光蛋白结合HSV(嗨GFP - HSV),或壳聚糖嗨GFP-HSV刺激PBMC和LN细胞体内感染1型单纯疱疹病毒。在这项研究中,我们首先分化的影响壳聚糖PBMC的抗原递呈细胞和淋巴结在早期感染1型单纯疱疹病毒。在我们的研究中,壳聚糖增加和t细胞增殖在PBMC比控制在1型单纯疱疹病毒(数字1 (b)和1 (d))。这一结果表明,壳聚糖可以增加的扩散和在1型单纯疱疹病毒感染t细胞。

细胞接触中扮演重要角色的刺激t细胞抗原递呈细胞包括单核细胞。由IL-15R IL-15的表示α激活单核细胞的膜是一种重要的机制,允许的生存和增殖t细胞(54]。然而,IL-7R和IL - 15 r表达逐渐失去了从持久化CD8记忆t细胞在脾脏(航空公司而不是32]。在这份报告中,我们发现IL-7R和IL-15R表达的差异通过淋巴结和PBMC在1型单纯疱疹病毒感染。IL-7R在PBMC表达高度,但IL-15Ra增加淋巴结在早期感染(图2)。

CD14表达下调,但单核细胞生存是调节人类疱疹病毒6型(hhv - 6)感染(55]。最近的研究已经证实的参与CD14在抗病毒免疫中起到控制艾滋病毒、呼吸道合胞病毒、登革热病毒感染(56]。这些数据强烈支持我们的结果。1型单纯疱疹病毒的存在,CD14表达减少PBMC和淋巴结,在没有感染的小鼠相比,所有治疗组的血压(图3)。

DCs被认为是最有效的抗原递呈细胞(apc)的免疫反应与CD11c DCs的识别的主要标志39,40]。CD11c还控制1型单纯疱疹病毒反应限制在原发感染(病毒复制41]。此外,壳聚糖纳米粒子已报告等刺激活动越来越聚集和激活的巨噬细胞和多形核的细胞,促进抗微生物感染,和诱导细胞因子(57]。我们目前的结果与这些结果是一致的,在早期感染1型单纯疱疹病毒,在PBMC CD11c或淋巴结的表达较低相比,在未受感染的老鼠(数字4(一)和4 (b))。CD11b^{- - - - - -}CD11c⁺表达在上面CD11c相同条件下显示出了类似的模式。有趣的是,经壳聚糖处理后小鼠单独显示,PBMC CD11c的高表达与感染相比,在控制。相反,在没有感染的情况下,壳聚糖单独不能促进PBMC CD11c的高表达,而联合治疗的壳聚糖和GFP-HSV CD11c相比壳聚糖(图的高表达4 (b))。

NK细胞中起决定性作用的最佳间隙1型单纯疱疹病毒感染的老鼠。NK1.1是自然杀伤(NK)细胞的标记和一个同种抗原的表达是有限的在几个品系小鼠NK细胞(58,59]。在这项研究中,我们的结果显示高NK1.1人口⁺细胞在HSV感染组比没有感染的小鼠。壳聚糖也增加了NK1.1⁺细胞在小鼠体内没有HSV感染。因此,壳聚糖可以作为辅助的NK细胞增殖。DX5是NK细胞的另一个标志。DX5的增加是类似于NK1.1表达式。因此,壳聚糖可以NK细胞的扩散者。

总之,我们证实了壳聚糖作为immune-stimulatory佐剂的作用在1型单纯疱疹病毒感染和免疫调节功能。壳聚糖口服放大CD11c的一代⁺特区NK1.1⁺NK细胞,DX5⁺以及NK细胞和1型单纯疱疹病毒感染后细胞。我们的研究结果表明,壳聚糖具有免疫调节功能在抗原递呈细胞,NK细胞和t细胞。我们发现一个复杂的壳聚糖参与小鼠体内有或没有1型单纯疱疹病毒感染。这些结果表明,壳聚糖本身可以是一个潜在的调制器或免疫刺激器在PBMC和淋巴结感染1型单纯疱疹病毒。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部、科学技术(批准2013 r1a1a3008248)。也支持通过韩国韩国卫生技术研发项目健康产业发展研究所(KHIDI)由卫生部和福利,大韩民国(格兰特HI15C2483)。