文摘

脓毒症,经常引起感染的细菌,被认为是一个无法控制的系统性炎症反应综合征(SIRS)。Maresin 1 (Mar1)是一种新的proresolving中介在几个动物模型和强有力的抗炎效果。然而,其效果在脓毒症还没有调查。为了解决这个问题,我们开发了脓毒症模型在BALB / c小鼠盲肠的结扎和穿刺(CLP)有或没有Mar1治疗。我们的数据表明,Mar1明显提高存活率和减少促炎细胞因子的水平在CLP小鼠白细胞介素- 6 (il - 6)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)。此外,Mar1降低血清水平的脂多糖(LPS)和增强细菌清除小鼠脓毒症模型。此外,Mar1减弱肺损伤和减少水平的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐(Cre)和血液尿素氮(BUN)测定小鼠血清中CLP后手术。治疗Mar1抑制核转录因子的激活(NF -κB b)途径。总之,Mar1展出在脓毒症的保护作用,减少有限合伙人,细菌血清中负担,抑制炎症反应,改善器官功能至关重要。所涉及的可能机制在一定程度上抑制NF - b激活。

1。介绍

脓毒症是一种系统性炎症反应综合征引起的感染的革兰氏阳性和/或革兰氏阴性微生物和人类的致命原因死亡率(1- - - - - -3]。脓毒症的发病率高,死亡率达到近20到50% (4]。到目前为止,尽管相当大的抗感染治疗和器官功能支持技术的进步,严重脓毒症和脓毒症休克仍然是一个致命的和棘手的病理条件5]。脓毒症的发病机制仍未完全阐明。随后可能的机制包括内毒素释放和激活免疫细胞过度分泌大量的炎症介质,其次是组织损伤和顺向多器官功能衰竭(MOF)综合症。人们普遍认为的初期信号通路包括toll样受体(通常)激活某些细菌组件如脂多糖(LPS)。然后,核转录因子(NF -κB b)系统被激活和调节炎症基因的转录控制各种细胞因子和炎症介质的表达(2]。过度炎症反应和随后的免疫紊乱引起多个器官功能障碍的发病率和高死亡率。

Maresin 1是一个新的proresolving中介就是来自二十二碳六烯酸(DHA) (6]。最近,体内和体外,maresin 1可以增强炎症分辨率和显示保护特性通过抑制炎症反应(7,8]。在脓毒性休克,许多炎症介质,如interleukin-1β肿瘤坏死因子-α白细胞介素- 6,急剧增加,受损组织或器官(9]。严重脓毒症常伴有急性呼吸窘迫综合征(ARDS),肝功能障碍,和其他器官的失败,导致预后不良(10]。许多先前的研究已经表明,proresolving介质,如maresin 1,在几个器官指定损伤模型的保护作用,如急性肺损伤、结肠炎、肝损伤、肺纤维化(7,11- - - - - -14]。盲肠的结扎和穿刺(CLP)是一个致命的败血症的实验模型,可以模拟整个病理的脓毒症发生在诊所的病人(2]。到目前为止,maresin 1的保护作用并没有在CLP脓毒症诱导的小鼠模型研究。在这种背景下,我们设计了本实验假设maresin 1潜在的治疗效果在鼠CLP脓毒症模型。

2。材料和方法

2.1。动物

所有BALB / c小鼠从武汉大学动物实验中心,购买年龄在9到10周和加权从22到25克。所有动物都保持在一个无菌的房间里用标准实验室饮食和水随意和室温22到24°C之间保持12 h光暗周期。所有实验过程涉及到老鼠的动物保健和使用委员会批准的华中科技大学同济医学院。

2.2。评议

7 r-maresin 1从开曼群岛购买化学(美国安阿伯市MI)。丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐(Cre)、血尿素氮(BUN)检测试剂盒购自南京建成生物技术研究所(中国南京)。小鼠肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)和白细胞介素- 6 (il - 6)的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自Dakewe生物工程有限公司有限公司(中国深圳)。NF - b p65抗体和 肌动蛋白是来自圣克鲁斯生物技术。核纤层蛋白B1抗体购自Epitomics(伯林盖姆,CA)。

2.3。实验过程和治疗

CLP像之前描述的那样进行轻微的改变。简单地说,老鼠被戊巴比妥钠麻醉(0.25%,50毫克/公斤);然后中间腹部切口暴露盲肠。盲肠被隔离和结扎在盲肠的中段与4 - 0丝绸缝合。然后,盲肠与18-gauge针穿刺。盲肠被回腹腔和切口关闭层。之后,1毫升无菌生理盐水注入皮下注射液体复苏。同样骗局组治疗过程中电集团没有盲肠穿刺和结扎。探索maresin 1的保护作用,小鼠分为四组:(1)假+ Mar1组:小鼠接受虚假的操作随后Mar1管理;(2)虚假的组:小鼠接受虚假的操作之后,车辆管理; (3) CLP group: mice were given CPL followed by administration of vehicle (0.1 mL sterilized saline); (4) maresin 1 group: mice were subjected to CLP operation followed by treatment with maresin 1. 1 ng. Mar1 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) was diluted in 0.1 mL saline and then was injected via the tail vein. The dose of Mar1 was chosen from what we reported before [7]。24小时操作后,血液样本收集从右心室肝素化注射器和腹膜灌洗是通过注入1.5毫升无菌生理盐水腹腔。肺样本同时收购。

2.4。生存分析

CLP治疗小鼠被随机分配接受尾静脉注射maresin 1或车辆。和生存记录每24小时总共7天。

2.5。确定有限合伙人CLP小鼠血清水平

12小时的CLP治疗后,小鼠被管理过量戊巴比妥钠的牺牲。血液从左心室获得的样本。从血液,分离血清样本离心机为3000 g 18分钟。一个鲎变形细胞溶解产物(LAL)测试是用来测量血清有限合伙人级别使用ToxinSensor™生色LAL内毒素试验装备(GenScript、南京、中国)根据制造商的指示。

2.6。细菌培养

测量数量的细菌,腹膜灌洗或血液在1:用无菌盐水稀释10 - 1:106。每个稀释培养在大豆胰蛋白酶的血琼脂板在一个24小时的有氧条件在37°C。然后,计算菌落(CFU) /毫升。

2.7。组织病理学分析

肺标本固定在4%多聚甲醛24 h,嵌入在石蜡,切成块,与苏木精和伊红染色。病理改变记录使用光学显微镜(奥林巴斯IX71、东京、日本)的病理学家是盲目的实验小组。肺损伤分数计算根据最近的报告标准(12]。简单,整体分数在0和1之间的用于评估肺损伤程度。损伤分数是按照以下公式计算:肺损伤分数= ( )/(字段数量×100)。的参数 , , , , 被描述在表1。

表1
肺损伤评分参数。
2.8。细胞因子检测

水平的il - 6、TNF -α,il - 1β由各自的小鼠血清测定酶联免疫试剂盒(Dakewe生物工程有限公司,深圳,中国),根据制造商的指示。

2.9。测定肝脏和肾脏功能

血清是通过离心的血液样本1500克,持续15分钟。Cre ALT, AST,发髻被各自的测量工具(南京建成生物技术研究所、南京、中国)根据制造商的指示。

2.10。免疫印迹

收集血液样本从老鼠CLP后12小时操作如前所述。外周血单核细胞(PBMC)收集使用聚蔗糖淋巴细胞分离介质(TBD科学,天津,中国)。总蛋白的提取PBMC使用无线电免疫沉淀反应分析工具(Beyotime生物科技公司、江苏、中国)根据制造商的指示。细胞质和核蛋白质提取与NE-PER Nuclearand胞质提取试剂(皮尔斯生物技术)根据制造商的指示。蛋白质浓度测定BCA分析工具包(Beyotime生物科技公司、江苏、中国)。然后蛋白提取分离在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜被5%的无脂牛奶0.1%渐变20 tris-buffered盐水(TBST)缓冲2小时,然后与抗体孵化 肌动蛋白(1:1000),NF - b(1: 1000),核纤层蛋白B1(1: 1000)在一夜之间在4°C。然后,细胞膜是孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体1小时。发射极耦合逻辑化学发光系统用于可视化的绑定和图像使用UVP成像系统开发。

2.11。统计分析

所有数据都表示为±SEM手段。使用生存率较存活率进行了分析。比较组间都是由单向方差分析(方差分析)和组间比较应用Student-Newman-Keuls事后分析。的值 所有的计算被认为是具有统计学意义。所有使用SPSS统计分析软件17.0版本(SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果

3.1。Maresin 1改善脓毒症小鼠的存活率和减肥

探索maresin 1能否改善CLP老鼠,生存被记录为7天。如图1(一)没有差别的存活率之间的虚假的组和假+ Mar1组。然而,CLP显著升高小鼠的死亡率。Mar1显著、治疗可以提高生存率在CLP老鼠,这表明Mar1在脓毒症的保护作用。在图1 (b)CLP后,体重明显降低。有趣的是,Mar1 +中电集团表现出较低的减肥速度相比,中电控股集团。减肥没有虚伪和假+ Mar1组之间的区别。

(一)
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(b)
(b)
图1
提高存活率( )3月1日在CLP老鼠和减肥。(a)存活率显著提高了3月1管理。(b)体重下降与治疗3月1。使用生存率较存活率进行了分析。 而虚假的集团。 与中电集团。
3.2。Maresin 1降低血清水平的有限合伙人

探索maresin 1是否可以降低LPS水平CLP小鼠血清有限合伙人是评估。在目前的研究中,LPS水平显著增加CLP手术后相比,虚假的和虚假的+ Mar1组(图2(一个))。与此同时,有限合伙人的血清水平明显降低maresin 1治疗。

(一)
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图2
Mar1有限合伙人和细菌减少负担在CLP老鼠。(a)的血清水平有限合伙人在CLP老鼠。菌落(cfu)在腹膜灌洗血(b)和(c)在CLP老鼠。数据表示为±SEM手段。 。 而虚假的集团。 与中电集团。
3.3。在脓毒症小鼠Maresin 1减少细菌的负担

探索maresin 1能否提高细菌间隙在CLP老鼠,血液和灌洗液的CFU测量。我们发现菌落形成血液和灌洗液明显减少Mar1 +中电集团与中电集团(数字2 (b)和2 (c))。数据表明,maresin 1促进细菌间隙在脓毒症小鼠血液和灌洗液。

3.4。Maresin 1抑制CLP诱导促炎细胞因子的活动

压倒性的促炎细胞因子脓毒症的病理过程中发挥重要作用。在我们的研究中,我们发现虚假的操作不会增加炎症细胞因子。然而,水平等促炎细胞因子il - 6、TNF -α,il - 1βCLP后显著增加手术相比,虚假的和虚假的+ Mar1组。值得注意的是,活动的il - 6、TNF -α,il - 1β在CLP后抑制小鼠治疗maresin 1(图3)。

(一)
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(c)
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图3
抑制促炎细胞因子在CLP Mar1动物。水平的肿瘤坏死因子-α(一)、il - 6 (b)和il - 1β(c)在血清酶联免疫吸附试验测定。数据表示为±SEM手段。 。 而虚假的集团。 与中电集团。
3.5。Maresin 1缓解CLP小鼠肺组织病理变化

肺损伤经常参与脓毒症的病理过程。假+ Mar1和虚假的老鼠接受车辆显示正常的肺结构。如图4。肺组织中电集团重要的间质水肿和白细胞浸润(图显示4 (c))。相比之下,政府maresin 1 CLP后明显减少这些病理变化(图4 (d))。因此,肺损伤评分(肺损伤评分:假+ Mar1 = 虚假的= CLP = ,CLP + Mar1 = )按照在肺组织病理改变(图4 (e))。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
(d)
(e)
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图4
改善肺组织病理学变化在CLP Mar1老鼠。CLP后肺组织了24小时。(a, b, c, d)代表从虚假的显微图+ Mar1,骗局,中电,CLP + Mar1组显示。每组(e)肺损伤评分。数据表示为±SEM手段。黑条代表100μm。 。 而虚假的集团。 与中电集团。
3.6。Maresin CLP手术后1改善肝脏和肾脏功能

肝脏和肾脏功能障碍常常发生在严重脓毒症的病理过程。在虚假的和Mar1 +假集团、AST、ALT、Cre,包子呆在正常水平。AST、ALT、Cre和包子CLP手术后明显增加。然而,治疗maresin 1显著降低AST,血清中ALT、Cre,包子水平(图5)。

(一)
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(b)
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(d)
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图5
改善小鼠的肝脏和肾脏功能Mar1 CLP后手术。血清ALT (a)的变化和AST (b)活动在CLP Mar1老鼠。Cre (c)的变化和面包(d)在血清Mar1在CLP的动物。 。数据表示为±SEM手段。 而虚假的集团。 与中电集团。
3.7。Maresin 1抑制NF - b p65 PBMC的核易位

NF -的激活 b通路在炎症中起着关键作用。如图6,NF -水平 b p65在细胞质和细胞核没有虚假和Mar1 +假组之间的区别,这表明,虚假的操作没有激活NF - b p65通路。然而,NF - CLP组b细胞质p65水平显著降低,而NF - b核p65水平显著增加,这表明NF - b p65易位从细胞质到原子核是增强CLP治疗后相比,虚假和Mar1 +假组。相比之下,这种易位是抑制maresin 1管理。因此,激活NF - b通路与治疗Mar1抑制。

(一)
(一)
(b)
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图6
易位的PBMC NF - B p65亚基被Mar1抑制在CLP老鼠。(一)NF - B p65细胞质减少CLP后手术,但是增加了Mar1。(b) NF - 在CLP小鼠B p65增加,但Mar1 NF -水平下降 B p65细胞核。NF - B p65乐队从实验规范化了 肌动蛋白和核纤层蛋白B1。 。数据表示为±SEM手段。 与中电集团。

4所示。讨论

脓毒症被认为是无法控制炎症反应严重感染。小鼠CLP模型被广泛接受为脓毒症模型在当前脓毒症的研究。先前的报道表明,maresin 1大大减轻内毒素诱导肺损伤(7]。内毒素是脓毒症的主要原因,本研究旨在确定maresin 1在脓毒症的影响。

在目前的研究中,成功地引起的脓毒症模型。我们发现第一次建议maresin 1改善CLP引起的脓毒症小鼠的存活率,表示一定的有利影响,包括减少细菌和减轻负担过度的炎症反应。此外,我们的工作表明,至少有一部分可能机制参与器官功能保护脓毒症。脓毒症的发生和顺向MOF是高度相关的细菌和内毒素移位,从而引发过度的炎症反应和器官功能障碍(15]。有限合伙人是革兰氏阴性细菌的细胞壁的主要成分,许多研究证明,有限合伙人可以引起致命的炎症反应,导致MOF甚至死亡(9,16]。相应地,切除有限合伙人在动物身上是有效的治疗脓毒症(16]。在我们目前的研究中,我们发现血清LPS水平显著降低maresin 1。除此之外,血液中的细菌清除率和腹膜灌洗被提升。因此,这些建议maresin 1可能通过减少内毒素来源在脓毒症的保护作用。

此外,控制炎症反应是另一个脓毒症的病理特点(17]。有限合伙人可以促进超表达的促炎细胞因子il - 6、il - 1 和肿瘤坏死因子- ,这是参与随后的脓毒症(18,19]。这是以前发现,肿瘤坏死因子- 发挥了关键在脓毒症可以启动系统的炎症反应9]。il - 6也涉及CLP诱发败血症,据报道,il - 6的选择性封锁transsignaling提高存活率(20.]。此外,il - 6、il - 1 和肿瘤坏死因子- 有核心作用激活细胞因子级联反应败血症和部分参与财政部的发病机理21]。因此,减少这些proinflammation细胞因子的活性可能有潜在的保护作用,避免过度炎症反应在脓毒症。在我们的研究中,血清促炎细胞因子il - 6、il - 1 和肿瘤坏死因子- 极大地抑制了maresin 1在CLP老鼠。所有这些建议maresin 1在CLP脓毒症模型的抗炎作用。

肺、肝、肾器官很重要在脓毒症(易受攻击22]。可怜的功能和状态往往与不良预后相关。AST和ALT活性被广泛用于评价肝脏功能和肾脏功能是经常评估使用Cre和血清中包。在我们的研究中,pathohistologic CLP小鼠肺组织的变化与治疗maresin 1显著提高。结合生存率改善maresin 1治疗CLP老鼠,所有这些表明maresin 1潜在的保护作用,改善在脓毒症重要器官的功能。

此外,我们研究了可能的机制和信号通路参与这在脓毒症的保护作用。PBMC是脓毒症过程中炎症介质的主要来源之一。NF - b途径被认为是炎症基因表达的关键调节器(23,24]。据报道,NF - B抑制减轻肺损伤引起的CLP (25]。我们所知,NF -的激活 b磷酸化有关。通常情况下,各种刺激如生长因子、细胞因子、压力可以激活NF - b通路。这导致易位的NF - b核和激活特定基因的转录。先前的报道已经确定,有限合伙人可以增强易位的NF - b p65从细胞质细胞核(24,26]。因此,炎性细胞因子的转录激活。和一些报道表明NF - b通路被激活在脓毒症和增加促炎细胞因子的表达如il - 6、il - 1 和肿瘤坏死因子- ,导致过度的炎症反应(23,27]。在我们目前的研究中,NF -的激活 b在PBMC p65明显抑制maresin 1治疗在CLP的动物。这些数据暗示,败血症maresin 1的保护作用可能与抑制NF -激活 b通路。

5。结论

我们的研究结果建议maresin 1显著保护从CLP诱导小鼠脓毒症通过减少系统性炎症反应。可能机制,至少在某种程度上,可能与细菌的间隙负担和顺向有限合伙人在老鼠身上,随后抑制LPS诱导NF - 的差别b p65通路,对这些炎症反应,保护重要器官的功能。综上所述,maresin 1可以是一个潜在的治疗剂治疗脓毒症的未来。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Ruidong李和雅馨王是相等的贡献者。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(拨款81601669和81601669)。