文摘
过敏性哮喘的气道炎症是最常见的标志。趋化因子受体参与白细胞招募哮喘的病理密切相关。CCR9被描述为一个稳态和炎症趋化因子受体,但其作用及其配体CCL25期间肺部炎症仍然未知。调查CCR9的调制器气道炎症的作用,我们建立了一个OVA-induced CCR9-deficient小鼠过敏性炎症模型。在这里,我们报告CCR9的表达和CCL25早6小时post-OVA挑战嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)。此外,在挑战CCR9-deficient小鼠,细胞招聘在支气管旁和perivenular水平受损。OVA-administration CCR9-deficient老鼠少导致炎性细胞招聘、修改il - 10的表达,CCL11, CCL25在24小时后卵子的挑战。相比之下,分泌的il - 4和IL-5并不影响CCR9-deficient老鼠相比WT老鼠。这些结果首次表明,CCR9和CCL25表达式中诱导气道炎症的早期阶段,他们有一个重要的角色调制嗜酸性粒细胞和淋巴细胞招聘在炎症过程的第一个阶段,表明他们可能是一个潜在的目标管理在哮喘炎症。
1。介绍
过敏性哮喘是一种慢性疾病,影响全世界超过3亿人(1]。其患病率和死亡率在最近几十年已经越来越普遍,成为一个重要的健康问题由于其日益增长的医疗费用和减少工人的生产力。据估计,将有超过1亿的新哮喘病患者未来十年(2- - - - - -5]。
Allergen-triggered气道炎症由特定的IgE哮喘是最常见的特征(2]。气道炎症是由粒细胞的招聘和Th2淋巴细胞(6];都是描述为主要细胞炎症过程的效应物和由Th2细胞细胞因子由上皮细胞和炎症细胞表达7]。
细胞贩运的复杂性在肺部炎症趋化因子(严格管控8]。在这种情况下,建立了超表达的趋化因子受体与炎性细胞的定位和激活期间和之后过敏原的挑战。越来越多的证据支持在过敏性气道炎症趋化因子受体的作用;然而,CCR9参与哮喘尚不清楚。
CCR9及其独特的配位体,CCL25 (thymus-expressed趋化因子,泰克),最初是胸腺中描述他们在胸腺细胞发育中发挥作用(9- - - - - -11]。同时,它们在小肠的自我平衡的表达与肠道细胞归巢。此外,CCR9的参与肠道炎症条件下被广泛描述(10,12]。然而,它的表达式、函数和肺部的监管尚不清楚。
的表达CCR9招募到肺部的炎症细胞被描述。后在体外与促炎介质刺激,人类eosinophils-derived细胞株移植CCR9的表达和应对CCL25趋化性分析(13]。此外,CCR9调节外周血嗜酸性粒细胞哮喘的学科(14]。此外,炎症巨噬细胞是至关重要的细胞在过敏性炎症上调CCR9表达炎性微环境(15]。树突状细胞是一些最重要的效应器呼吸道敏感的早期阶段。在这些细胞中,CCR9表达式是调节的il - 4 (16];然而,其它Th2-derived细胞因子诱导的影响及其对炎症过程的监管的影响没有特点。
我们曾表明,CD4 + CD25 + FoxP3 + t淋巴球的族群有监管职能和依靠CCR9表达式来控制pathogen-induced肠道炎症(17]。因此,这项工作的目的是分析CCR9的作用在调节细胞招聘和调节炎症过程呼吸道致敏。与之前的研究一致,我们报告CCR9表达的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)。此外,我们证明CCR9-deficient老鼠(KO)敏化与卵巢显示受损招聘的粒细胞炎症导致的第一阶段减少炎症反应。这些数据表明,CCR9表达起着关键作用的调制单元招聘到航空公司在哮喘肺发炎。
2。材料和方法
2.1。动物
六到八周大的C57BL / 6雌性小鼠被用于所有的实验,在无菌条件下进行维护。水和食物供应随意。CCR9-deficient老鼠请提供的m·a . Wurbel博士(美国波士顿儿童医院,波士顿,MA)。所有实验过程涉及动物处理严格按照定义好的动物实践和经动物实验生命伦理准则的皇家研究院Investigaciones基于,大学根据墨西哥。
2.2。过敏性气道炎症小鼠模型
诱导气道炎症之后我们之前报道的协议与少量修改18,19]。简单地说,小鼠腹腔内政府10治疗μ卵白蛋白g(卵子,σ化学,密苏里州,美国),吸附到10毫克的明矾(美国新泽西州皮尔斯),悬浮在盐溶液(SS)天0和8。在15 - 20天,老鼠收到雾化卵子1%(美国俄亥俄州USB) 30分钟。34天,老鼠又喷雾卵子5%。小鼠安乐死6、24和48小时后表示。小鼠只有党卫军被用作控制。
2.3。测量OVA-Specific鼠标IgE ELISA
检测血清OVA-specific IgE, 96 - ELISA板(美国圣克鲁斯,TX)涂上了20μ在0.1 g的卵子碳酸盐缓冲(pH值8.3)。盘子被封锁一个小时PBS-SFB 2%。样本稀释10倍,然后添加到井中。与鼠anti-mouse IgE抗体检测特异性抗体(酶、钙、美国),紧随其后的第二个anti-rat生物素化的抗体(BioLegend、钙、美国)。Avidin-HRP(美国BD OptEIA)添加和反应是发达与tetramethylbenzidine衬底(KPL,医学博士,美国)和停止通过添加H2所以42 N。光密度的样本为450 nm (OD450)使用模数二世标仪(美国WI Promega)。
2.4。支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞分析
BALF收集从挑战中获得鼠2,6日,24日,48 h后卵巢政府表示。简单地说,800年μL PBS / EDTA 0.05解决方案是不断引入小鼠肺部和收集,直到恢复卷4毫升。BALF在1500转离心10分钟在4°C。细胞悬浮在1毫升的PBS和细胞总数量化使用标准的染色协议和微分细胞类型确定cytospun细胞沾Diff快速(戴德贝林Inc .,纽瓦克德),然后通过显微镜检查。形态分析细胞的淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞。剩余的细胞进行流式细胞术分析处理。
2.5。BALF中细胞因子测定
水平的il - 4、IL-5 TNF -α,BAL上层清液中il - 10细胞因子测定使用商业ELISA试剂盒(ELISA马克斯•™BioLegend,圣地亚哥,美国)根据制造商的指示。此外,小鼠MultiAnalyte ELISArray工具包(试剂盒Inc .,瓦伦西亚,CA)被用来量化12促炎细胞因子的水平,根据制造商的说明进行。
2.6。流式细胞术分析
流式细胞仪分析趋化因子受体的表达,细胞被孵化先屏蔽解决方案(PBS小鼠血清)在20分钟,其次是第二个孵化与生物素化的鼠标anti-CCR9抗体(1μ克/ 106细胞)(美国CA eBioscience)流式细胞仪缓冲区(PBS含2%胎牛血清和0.1%的南3在4°C) 30分钟。最后细胞被孵化的解决方案streptavidin-APC或streptavidin-PerCP 30分钟在黑暗中在4°C。
表型检测其他的细胞群,单个细胞悬浮液是preincubated anti-CD16 / CD32抗体的混合物(美国CA BioLegend)在室温下10分钟。第一次孵化和几个洗后,细胞被孵化与anti-CD4-PeCy7, anti-CD8-PE, anti-Gr1-PeCy5 (BioLegend、钙、美国),或anti-Siglec(美国CA BD)抗体流式细胞仪缓冲区在4°C为30分钟(根据制造商的建议)。最后,分析了样品调®声流式细胞分析仪(生活技术,热费希尔科学、马、美国)。8.7 FlowJo执行数据分析软件(树明星,Inc .)。
2.7。组织学分析
小鼠安乐死,肺部固定transcardiac和气管内的滴剂和4%多聚甲醛。固定后,肺被嵌入在石蜡组织化学分析和处理。肺段(7μM)与苏木精和伊红染色(他)和周期性acid-Schiff (PAS)。的形态学分析、幻灯片在Leika显微镜检查(徕卡微系统公司,布法罗格罗夫,,美国)。图片来自5个不同的领域从四个动物样本和分析使用Leika显微镜成像软件(徕卡微系统)。
2.8。Immunohistological趋化因子的分析表达式
短暂,多聚甲醛固定的肺组织被嵌入在石蜡为免疫组织化学分析和处理。部分是deparaffinized和水化与乙醇梯度。抗原检索是由微波炉加热在0.01柠檬酸钠溶液;内源性氧化物酶灭活了H2O2和阻止通用缓冲(Biogenex、钙、美国)。纯化山羊anti-mouse CCL25抗体(R&D)和控制山羊免疫球蛋白同形像(研发),作为推荐的制造商。一夜之间,部分被孵化;添加了几个洗后,二级peroxidase-labeled抗体免疫球蛋白在1小时在室温下。最后,部分5次洗了PBS / BSA 0.05%和揭示轻拍(向量实验室、CA、美国)。
2.9。实时聚合酶链反应
从组织总RNA是纯化试剂盒(表达载体、钙、美国)。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用2μ克总RNA为模板,M-MLV (WI Promega,麦迪逊,美国),和OligodT(英杰公司)根据制造商的指示。实时PCR进行使用权力SYBR®绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司)。引物序列用于放大如下:CCR9: F: 5′-TCCGAAGGGATCTGGTGAAG-3′, CCR9: R: 5′-GAATGAAACCCACTGGGC颈- 3′;CCL25: F: 5′-CCAAGGTGCCTTTGAAGACT-3′, CCL25: R: 5′-TCCTCCAGCTGGT GGTTACT-3′;CCL11: F: 5′-TCCACAGCGCTTCTATTCCTG-3′, CCL11: R: 5′- g GAGCC TGGGTGAGCCA-3′;CCR3: F: 5′-TTCTCACCAGGAAGAAACGGA-3′, CCR3: R: 5′gg AGGTGACTGAGGTGATTGC-3′;il - 10: F: 5′-TTTGAATTCCCTGGGTGAGAA-3′, il - 10: R: 5′-GGAGAAATCGATGACAGCGC-3′;IL-5: F: 5′-ACCTTGGCACTGCTTTCTACTC 3′, IL-5: R: 5′-AGAAACTCTTGCAGGTAGTCTAGG-3′β作为内部控制基因F肌动蛋白:5′-GGGTCAGAAGGATTCCTATG-3′, R: 5′-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3′。基因表达分析相对于执行β肌动蛋白和计算通过使用方法(20.]。
2.10。数据分析
组间显著差异进行评估使用单向方差分析(方差分析),其次是Dunnett多个比较测试使用GraphPad Prism 6.0版(美国加州La Jolla GraphPad软件)。值报告为的意思SD。差异与值等于或低于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。描述CCR9-Deficient OVA-Stimulation引起的炎症细胞的老鼠
第一个方法分析过敏性肺部炎症CCR9的监管作用在活的有机体内是使用ovalbumin-induced气道炎症的小鼠模型(图1(一))。野生型(WT)和CCR9-deficient (KO)小鼠致敏与卵子的挑战。炎症反应是诱导和分析过去OVA-challenge后24小时。CCR9的缺失导致受损细胞招聘,所观察到的细胞计数下降在支气管肺泡液体(BALF)(图1 (b))。相比SS-treated老鼠时,老鼠OVA-challenged增加淋巴细胞和嗜酸性粒细胞(早些时候报道19]。有趣的是,有一个减少的总数(30%)招募BALF中嗜酸性粒细胞KO小鼠相比WT老鼠(图1 (c))。然而,我们没有发现差异OVA-specific IgE CCR9 KO小鼠血清的生产而WT(图1 (d))。总之,这些结果表明,CCR9调节肺嗜酸性渗透在对卵子的回应。
(一)
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(c)
(d)
3.2。减少白细胞浸润在CCR9的缺失
接下来,我们决定在CCR9 KO小鼠气道炎症的组织学特征。与BALF中炎症细胞的数量一致,我们发现增加白血球细胞渗透在支气管旁和血管周的水平OVA-treated WT CCR9 KO小鼠,主要是单核细胞和嗜酸性粒细胞(图2(一个))。Morphometrical分析显示显著降低支气管旁渗透(近50%)和轻微减少perivenular层面缺乏CCR9相比WT老鼠。此外,它已经表明,趋化因子可能直接参与调节粘蛋白表达。因此,要检查肺部炎症反应的另一个特性,我们比较粘液生产WT与CCR9 KO小鼠PAS-staining(图2 (c))。我们的分析表明,数量没有显著差异PAS-positive杯状细胞在每组的老鼠(图2 (d))。这些结果可能表明CCR9气道炎症细胞的渗透调节作用,但显然不是在调节粘蛋白的表达。
(一)
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3.3。分析平衡细胞因子在OVA-Challenged CCR9-Deficient老鼠
Th2细胞因子中白细胞的主要监管机构招聘过敏性炎症。il - 4参与诱导和生产特定的IgE气道高反应和T细胞衍生IL-5是嗜酸性粒细胞在肺部的主要监管机构。我们分析了水平的il - 4和IL-5航空公司的OVA-sensitized CCR9 KO或WT老鼠,发现无显著差异水平的细胞因子CCR9 KO和WT同胞之间(图3)。此外,尽管TNF -α据报道为招募中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞在过敏模型,TNF -α生产没有影响CCR9 KO小鼠(图3)。另一方面,很强的相关性之间的报道CCR9表达和监管过程在肠道;因此,减少嗜酸性粒细胞浸润CCR9 KO小鼠(图中观察到1 (c))也可能与cytokine-mediated免疫调节相关事件。有趣的是,我们发现,il - 10是显著降低(超过60%)相比,CCR9 KO WT老鼠(图3)。这些结果表明,不同于以往的数据报告在肠道粘膜,CCR9的缺失导致增加炎症(17),在肺部过敏炎症过程期间,CCR9表达式与白细胞增加招聘,尽管减少了il - 10的水平。此外,我们分析了表达与调控炎症相关的细胞因子,在肺。有趣的是鉴定及和IL-17增加浓度在6 h和24 h后OVA-stimulation CCR9 KO小鼠相比WT(补充图在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/3635809)。
3.4。CCR9调节CCL25 OVA-Stimulation后表达
分析白细胞浸润后24小时后最终OVA-treatment表明,嗜酸性粒细胞和炎症介质评估依赖于CCR9表达式。详细研究CCR9 / CCL25轴的动力学表达式在肺部炎症尚未执行。因此,我们接下来分析动力学CCR9表达式使用修改后的呼吸道致敏(图模型4(一))。非常低水平的CCR9 mRNA表达被实时rt - pcr在肺组织中发现,尽管他们在6小时后检测到最后OVA-challenge达到最大程度的表达式后24 h OVA-challenge(图4 (b))。相比之下,我们发现CCL25表达调节早期过敏原的挑战(6小时)后,在24小时开始下降,进一步下调在48 h。调查如果CCL25表达式可能受CCR9,我们分析了表达式的CCL25 CCR9 KO和WT老鼠,OVA-challenge之前和之后。有趣的是,我们发现非常低水平的CCL25 OVA-treated KO小鼠WT(图4 (c)),这表明CCR9表达对CCL25感应很重要在气道过敏性炎症。我们还分析了CCL25表达式后,我们的肺部炎症模型中包含IHC 0, 6、24 OVA-stimulation(图S2)。证明中存在的实验,增加表达的CCL25 WT老鼠最早OVA-challenge后6 h;相比之下,有一个减少CCR9 CCL25表达式老鼠在任何时候进行测试。
(一)
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(c)
3.5。CCR9调节其他肺部炎症介质的表达
我们的研究结果表明CCR9可能调节肺中的其他炎症介质的表达。因此,我们分析了CCR3的表达及其同源配体之一,CCL11,被认为是重要的吸引子的嗜酸性粒细胞和Th2淋巴细胞在过敏性肺部炎症。如图5(一个)WT老鼠,有CCR3的mRNA水平的增加和CCL11以来第一个6 h后最后一个卵子48 h后显著下降(图和管理5(一个))。WT和KO透露,不过,比较分子是严重减少了在缺乏CCR9(图5 (b)),这表明CCR9的间接影响嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)招聘。
(一)
(b)
接下来,我们测试了两个相关细胞因子:IL-5,参与活动,招聘、嗜酸性粒细胞和apoptosis-resistance,是一种免疫调节细胞因子il - 10。如图5(一个),mRNA水平的细胞因子都是增加在WT老鼠OVA-stimulation后24 h。令人惊讶的是,IL-5 mRNA水平和il - 10后被减少或废除任何时候测试OVA-stimulation没有CCR9与WT的同胞相比(图5 (b))。因此,这些数据表明有重要依赖CCR9的重要分子的表达建立一个招聘过敏性气道炎症为特征的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)。
3.6。肺嗜酸性粒细胞招聘是没有CCR9的减少
CCR3和CCL11表达式被CCR9监管,减少嗜酸性粒细胞招募到肺部的BALF CCR9 KO小鼠决心(数据1 (b)和1 (c)),我们进一步分析了嗜酸性粒细胞动力学招聘(Gr1一起+ Siglec-F +细胞)在肺部CCR9 KO或WT雾化后小鼠卵巢的流式细胞仪。数据显示,尽管嗜酸性粒细胞开始增加在两组小鼠6 h,在OVA-treatment后24小时,有一个显著减少CCR9 KO WT老鼠相比,在比例和总数字(数字6(一)和6 (b)),这与我们之前发现BALF的形态特征(图1 (c))(65%比40%)。
(一)
(b)
(c)
CCR9表达的机制参与监管的嗜酸性粒细胞尚不清楚。据报道,在在体外激活条件,CCR9和其它趋化因子受体调节。获得一个更好的理解的角色CCR9 OVA-challenge后嗜酸性粒细胞迁移到BALF中,我们分析了CCR9表达这些细胞流式细胞术。我们的数据表明,有一个增加的人口CCR9 + Siglec-F +只嗜酸性粒细胞OVA-stimulation后6 h。然而,我们没有发现统计学差异Siglec-F表达式没有CCR9 OVA-challenge后(图S3),这coexpress CCR3期间肺招聘。趋化因子受体表达严重减少控制同窝出生在24小时炎症(图6 (c)),这表明CCR9是重要的炎症刺激下表达。因为航空公司招聘的嗜酸性粒细胞是严格监管CCR3等趋化因子受体CCR5和炎症介质的表达,比如CCL5 CCL11, CCL22 CCL24趋化因子和IL-5,我们发现CCR9 / CCL25轴也可以参与嗜酸性粒细胞OVA-stimulation招聘在早期小时后可能导致更好的理解复杂的免疫调节气道炎症。
3.7。t淋巴球招聘进入肺部没有CCR9的影响
完善,Th2-lymphocytes参与IL-5分泌后的肺部发炎过敏刺激(18]。如前所述,IL-5和Th2-like细胞因子的主要调节器过敏性炎症,招聘和激活诱导的气道嗜酸性粒细胞。因此,我们下一个调查是否CCR9的缺失也导致早期招聘到肺部受损。为了达到这个目标,我们评估BALF中淋巴细胞的细胞亚群CCR9 KO,流式细胞术WT同窝出生的。
如图7,而CD4 + T细胞比例BALF OVA-stimulation WT老鼠增加后,CD4 + T细胞在CCR9 KO小鼠显著降低6 - 24小时后OVA-stimulation(数字7(一)和7 (b))。招聘的CD4 + T细胞进入肺部WT老鼠与CCR9 +细胞的存在显著增加,因为这群OVA-stimulation 48 h后(图7 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
CD8 + T细胞在过敏性炎症的作用也被研究和已被证明是干扰素的分泌——负责γ和il - 420.]。如数据所示7 (d)和7 (e)、招聘的CD8 + T细胞在CCR9 KO小鼠减少6 - 24小时,但不是在OVA-stimulation后48 h。招聘CCR9 + CD8 + T细胞在早期小时后进入肺部增加去年OVA-stimulation保持48 h(图7 (f))。完全CCR9的这些结果表明,表达对CD4 + T)的招聘很重要并可能CD8 + T细胞在allergen-induced气道炎症。
4所示。讨论
气道炎症是过敏性哮喘(最重要的功能之一21]。过敏性气道炎症的调节是一个非常复杂的过程。趋化因子及其受体广泛与过敏相关流程,包括哮喘。一些CC和科学家趋化因子与哮喘相关的表型:CCL1, CCL2, CCL3, CCL5, CCL11, CCL24, CCL26, CXCL8, CXCL10 [22- - - - - -25]。然而本条例的动力学和动力学并不是完全理解在哮喘的背景下发展。同时,趋化因子受体就像CCR3、CCR4和CCR8已发现在哮喘患者升高和实验小鼠模型(26- - - - - -32]。CCR3已被广泛研究哮喘的临床和实验模型(33]。完善,这种受体有助于调节免疫反应在哮喘气道招聘和激活嗜酸性粒细胞,t淋巴球,肥大细胞(34]。趋化因子受体CCR4也一直使用小鼠动物模型研究过敏性气道炎症;尽管其白细胞表达可能不是过敏性气道炎症发展至关重要,它与招聘有关的调节性T细胞肺(35,36]。然而,一些信息关于CCR9的作用存在于调节肺部炎症。CCR9 CC-chemokine受体,是一个重要但不是必要参与调节贩卖胸腺细胞在胸腺淋巴细胞发展(11,37,38]。同时,CCR9与自导CD4 (16],CD8 [39),γδT细胞(40),树突细胞(41),和B细胞(42肠道固有层)。同样,CCR9和CCL25参与炎性疾病已被广泛研究。其表达式是调节炎症性肠病和结肠炎43- - - - - -45]。CCR9及其配体之间的相互作用在调节小肠炎症的发展很重要46,47),主要是通过吸引肠道炎症细胞。CCR9也有作用,调节细胞凋亡在肿瘤细胞系(48和癌症患者49,50),这使得这种受体在慢性炎症疾病潜在的化学疗法的目标。
在这个报告中,我们感兴趣的分析CCR9的作用在调节炎症过程过敏性气道炎症。为了达到这个目标,我们分析了一个之前报道过敏性气道炎症的小鼠模型。有趣的是,我们的数据表明,白细胞招募过敏航空公司在缺乏CCR9受损,特别是影响招聘的嗜酸性粒细胞。组织学分析表明,血管周围炎症和支气管旁都是减毒CCR9 KO小鼠,这表明CCR9-CCL25交互可能很重要,但不是关键,在气道炎症激活经典特性。在活的有机体内表达CCR9的嗜酸性粒细胞是不清楚14),在体外数据表明,CCR9可以诱导炎症刺激下(51]。过敏性呼吸道敏感的另一个重要特征是肺黏蛋白的表达增加。我们分析了很多PAS-positive杯状细胞在肺部OVA-stimulated /挑战老鼠和显示KO和WT老鼠之间没有统计学差异。虽然很少有研究报道有关趋化因子刺激和粘蛋白生产之间的直接关系,目前尚不清楚CCL25可能直接参与粘蛋白生产(52,53]。进一步研究关于chemokine-mediated感应应该执行不同类型的粘蛋白,特别是那些th2型相关炎症趋化因子分析表型CCL5和CCL11等。接下来,我们继续调查CCR9-CCL25轴调节的潜在作用的一些过敏炎症过程的事件与其他细胞因子。现在很清楚的是,th2型细胞因子对过敏发展和改造至关重要(54,55]。il - 4、IL-5 IL-9, IL-13细胞因子有明确影响靶细胞B细胞和嗜酸性粒细胞等。此外,其他细胞因子il - 1、il - 22生成时,IL-33, TSLP-1也激活Th2和ILC2天生的细胞增加炎症过程的复杂性。然而,Th2型环境本身似乎并没有解释这种疾病的广谱,部分因为严重哮喘不是只与Th2细胞因子的生产(56]。
我们发现il - 4的表达IL-5并没有修改的BALF OVA-stimulated CCR9 KO小鼠,虽然有显著增加干扰素-γ(补充图)后6 h后OVA-stimulation,表明Th2细胞因子可能不是CCR9-mediated信号和其他相关监管机制缺乏CCR9下参与他们的表情。
相比之下,BALF中il - 10的水平OVA-sensitized老鼠没有减少CCR9 WT。il - 10是一个强大的免疫调节细胞因子产生主要由CD4 +淋巴细胞亚群)的一个子集,B淋巴细胞,巨噬细胞(57,58]。在哮喘中,有许多研究在患者和动物模型证明il - 10的潜在作用调节呼吸道的炎症反应(59),主要来源是CD4 + CD25 +淋巴细胞)。然而,在我们的模型中没有发现差异数量的CD25 + FoxP3 + T细胞,这表明其他CCR9-dependent生产细胞il - 10可能参与气道的炎症过程的监管。在这种背景下树突细胞样的族群(CD11 + c, F480 + MHC II级+)是减少CCR9 KO的肺刺激后在很早的时间(数据没有显示)。
IL-17和鉴定及也没有CCR9(图修改3和补充图)。据报道,Th2和Th17通路可能是哮喘的监管。IL-17表达增加中性粒细胞炎症有关,也与某些科学家的水平增加有关趋化因子和粘蛋白增生(60,61年]。在我们的模型中,缺乏CCR9 IL-17水平的差别导致了对这些过敏航空公司虽然没有重大修改的il - 4水平,IL-5。
CCR9已被确定在肠道分泌血浆B细胞(41]。我们分析的IgE水平感兴趣,IgG1, IgG2a血清抗体(图1数据未显示),发现野生型之间没有显著差异基因敲除老鼠。这并不奇怪,因为中il - 4的水平基因敲除老鼠没有显著改进。众所周知,il - 4与激活B细胞增殖和分化,IgE切换、嗜酸性粒细胞诱导内皮轮回,Th2反应过敏疾病,调节和影响趋化因子的合成,如CCL11 CCL24, CCL26, CCL13 [62年- - - - - -64年]。虽然il - 4之间的相关性和IgE已被证明是相关的过敏性气道炎症,在我们的模型中,没有CCR9没有对这些蛋白质的表达的影响。
过敏性气道炎症的早期阶段(第一个4 - 8 h后过敏原刺激)的特点是具体的表达趋化因子,细胞因子和生长因子,与初始渗透的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞和肥大细胞的激活。气道高反应性的招聘与发展(AHR)。实验模型表明,趋化因子表达之间有协调监管和微分白细胞招募。il - 4、IL-5 IL-13, TNF -α细胞因子是调节在这个阶段,AHR开发中发挥关键作用,白细胞招聘、和后期阶段建立炎症,这可能持续几周(65年,66年]。此外,CC (CCL2, CCL3和CCL5)和科学家(处于受控,CXCL2, CXCL5 CXCL10)趋化因子表达在气道炎症的早期事件(主/ h过敏原后挑战),而CCL8, CCL11, CCL24表达后事件(从24小时到7天)67年- - - - - -69年]。因此,在这里,我们调查是否CCR9 / CCL25轴可能参与细胞动力学的调制招聘到航空公司在过敏原后早期炎症刺激。我们的数据显示一个upregulation CCR9和CCL25,信使rna和蛋白质含量,最早6 h和24 h后过敏原的挑战。这个表达式与增加淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。因此,CCR9 / CCL25表达可能导致白细胞招募炎性微环境下的早期阶段CCL11过敏原刺激以类似的方式。由于CCL25既定的胸腺和小肠上皮细胞表达的70年),很可能CCL25的主要来源在肺上皮细胞,尽管它可能不会以同样的方式调节其他趋化因子(71年]。
在我们的模型中,我们分析了2和6 h post-OVA-stimulation早期炎症发作的关键点。CCR9的没有发现嗜酸性粒细胞招募到肺部受损。嗜酸性反应postactivation被广泛描述在活的有机体内和在体外。这激活导致生产的促炎介质和趋化因子;因此缺陷的嗜酸性粒细胞招募有关不仅CCR9表达而是迁徙的依赖和嗜酸性粒细胞由CCL25激活。这个过程可能是炎症的关键管理和解决。此外,我们的结果显示数量的减少CCR9 + Siglec-F +后嗜酸性粒细胞前6小时。在OVA-challenge之后。这些细胞在刺激后48小时回到基底的水平,表明这些CCR9 +细胞可能是特别重要的肺部炎症的早期阶段。
同样,后期过敏性气道炎症反应(1 - 2天)的特点是迁移的t淋巴球,巨噬细胞和粒细胞的第二波。这个白细胞招聘是由特定的细胞因子和趋化因子,也有助于进一步气道重构(65年,72年]。在我们的模型中,缺乏CCR9受损严重的迁移到航空公司CD4 +和CD8 + T细胞OVA-challenge 24小时后。这些细胞的总数是类似于OVA-stimulated WT控制在去年OVA-challenge后48小时。还不清楚在T细胞的数量减少气道炎症的早期阶段与监管早期表型(CD4 + CD25 + FoxP3 +)为我们演示了早些时候的模型pathogen-mediated结肠炎症(17]。
总的来说我们的数据表明,CCR9调节过敏性气道炎症通过促进早期气道嗜酸性粒细胞影响CD4和CD8 t淋巴球招聘和表明,这种受体可以被认为是一个额外的过敏性气道炎症的治疗目标。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突存在关于这篇文章的发表。
确认
作者感谢Veronica从Facultad de药物罗德里格斯,自治,和MVZ乔治娜·迪亚兹从UMB IIB,自治,技术援助。c . Lopez-Pacheco博士生从项目Doctorado en Ciencias Bioquimicas,大学根据墨西哥,并支持从Conacyt没有博士奖学金。316675年。e . a . Garcia-Zepeda博士被Conacyt格兰特没有支持。167913年。
补充材料
补充图1。2、il - 6、il - 12、IL-13 IL-17A, IL-23, IFN-g TGF-b测定由ELISA multiarray落下帷幕。CCR9缺陷修改炎性细胞因子的生产特别在6小时后卵子的挑战。
补充图2。CCL25表达式分析了肺组织的免疫组织化学6点后24小时的挑战。图片证明CCL25高峰在6小时,取决于CCR9表达式。
补充图3。嗜酸性粒细胞是由流式细胞仪的表型分析BAL-derived细胞。CCR9表达决心Siglec并没有改变在CCR9的缺失。