文摘

苦参碱隔离开近年来并显示巨噬细胞的抗炎作用。我们评估了苦参碱的抑制影响环氧酶2 (cox - 2)和细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)表达式在脂多糖(LPS)刺激人类的肺上皮细胞A549细胞。此外,BALB / c小鼠接受各种苦参碱腹腔内注射剂量,然后肺损伤诱导通过气管内的有限合伙人的滴注法。的作品在LPS-stimulated A549细胞,苦参碱抑制interleukin-8(引发)、单核细胞趋化蛋白1,il - 6和降低cox - 2的表达。苦参碱治疗也减少了ICAM-1蛋白质表达和抑制neutrophil-like细胞炎症A549细胞的粘附。在体外结果表明,苦参碱显著抑制增殖作用蛋白激酶磷酸化和减少核转录因子kappa-B亚基p65蛋白转位到细胞核。在活的有机体内数据表明,苦参碱显著地抑制中性粒细胞浸润和肿瘤坏死因子-压制产品α和il - 6在小鼠支气管肺泡灌洗液和血清。肺组织的分析表明,苦参碱减少促炎细胞因子的基因表达,趋化因子,cox - 2和ICAM-1。我们的研究表明,苦参碱改善小鼠肺损伤和减少人类肺上皮细胞的炎症反应。

1。介绍

急性肺损伤(ALI)的特征是肺不张的肺空域,减少肺活量(1]。在阿里的情况下,肺组织释放大量炎性细胞因子,趋化因子和炎症介质,如一氧化氮和环氧酶2 (cox - 2)2]。阿里也会引起肺细胞分泌蛋白酶,导致肺泡细胞损伤和肺泡液体积累,导致肺组织水肿(3]。肺泡损伤导致血管通透性增加血管和肺组织中性粒细胞浸润,进一步加剧了肺部炎症和肺水肿和可能导致呼吸衰竭和死亡4]。

阿里常发生脓毒症的早期症状或细菌感染的呼吸道2]。革兰氏阴性细菌入侵肺部可引起细菌性肺炎和阿里5]。脂多糖(LPS)是一种革兰氏阴性细菌细胞壁的组成部分,可以引起一个先天免疫反应,激活免疫细胞对抗微生物感染(6]。因此,有限合伙人被广泛用于诱导急性肺的炎症动物模型。据报道,激活巨噬细胞和肺上皮细胞释放促炎细胞因子和趋化因子,加重阿里进展。之前的研究使用肺上皮细胞评估药物或天然化合物的抗炎反应在LPS-induced炎症反应(7,8]。

中国大陆和台湾的根源近年来(豆科)是用来治疗发热、黄疸、尿路感染、化脓性感染(9]。苦参碱隔离开美国近年来据报道,可以减弱脑缺血性损伤小鼠和诱导细胞凋亡的慢性粒细胞白血病细胞,骨肉瘤细胞和胆管细胞型肝癌细胞(9,10]。张等人先前表明,苦参碱抑制促炎细胞因子生产LPS-stimulated老鼠巨噬细胞(11]。以前,我们小组还发现,苦参碱能改善嗜酸性粒细胞浸润,在哮喘小鼠气道高反应性,Th2-associated细胞因子生产(12]。然而,苦参碱的抗炎活动的机制在肺上皮细胞在很大程度上是不清楚。

在目前的研究中,我们调查了苦参碱是否减少炎症反应和细胞间粘附molecule-1生产(ICAM-1)在肺上皮细胞。我们还研究了苦参碱是否保护,防止在LPS-induced小鼠急性肺损伤。

2。材料和方法

2.1。苦参碱和细胞培养

了采用高效液相色谱法测定苦参碱(≥99%)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)和溶解于生理盐水如前所述[12]。人类的肺上皮细胞系A549购买生物资源的收集和研究中心(BCRC、台湾)。A549细胞在DMEM培养基培养(Invitrogen-Gibco、佩斯利、苏格兰)包含2毫米谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素和链霉素,10%胎牛血清(生物产业、Haemek、以色列)。在37°C细胞孵化有限公司5%2湿润的空气,亚文化每周两次。

2.2。细胞生存能力分析

细胞生存能力是化验使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT);σ)如前所述13]。96年文化板块,A549细胞治疗各种苦参碱浓度24 h。然后洗盘子,麻省理工的解决方案是补充道,在37°C和盘子孵化4 h。甲瓒晶体溶于异丙醇,和细胞生存能力在570 nm spectrophotometrically测量标(Multiskan FC;热,沃尔瑟姆,妈,美国)。

2.3。动物

雌性BALB / c小鼠在台湾购买国家实验动物中心。老鼠与恒温器保持在动物房和中央空调。保健和住房的老鼠实验动物保健委员会批准长庚科技大学(IACUC批准号:2014 - 007)。

2.4。急性肺损伤和药物治疗

老鼠10小鼠随机分为4组:正常对照小鼠(N组),LPS组10毫克/公斤苦参碱+有限合伙人(M10组)和20毫克/公斤苦参碱+有限合伙人(M20组)。天1 - 7的实验中,小鼠腹腔注射苦参碱。8天,老鼠与异氟烷麻醉(Aesica,肯特,英国)和收到50气管内的注入μL有限合伙人(1μ克/毫升)或生理盐水。有限合伙人管理4小时后,老鼠被牺牲,我们收集的血清样本,支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织。

2.5。支气管肺泡灌洗液和细胞计数

BALF收集如前所述[14]。简单,鼠标气管插管和肺部与1毫升生理盐水冲洗。确定中性粒细胞在BALF细胞计数,细胞被刘沾污渍的解决方案(Polysciences, Inc .,台北,台湾)。上层清液也测量细胞因子和趋化因子产品。

2.6。肺组织的组织学分析

肺组织在10%福尔马林固定,石蜡嵌入式,切成6μ米的部分。幻灯片是苏木精和伊红染色(他)。如前所述执行中性粒细胞浸润试验(15]。

2.7。血清收集

麻醉后,血清收集从轨道血管丛。血清样本在6000转离心5分钟(如前所述)(16),其次是存储在−80°C到使用。

2.8。ELISA对细胞因子和趋化因子的生产

在一个在体外实验中,A549细胞用苦参碱预处理(100 - 400年μ米)的1 h 24-well盘子然后他们与LPS刺激(1μg / mL),培养24小时。然后我们使用特定的ELISA试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)分析引发,il - 6,单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1) CCL5, ICAM-1生产。光密度(OD) spectrophotometrically使用标仪测量450海里(Multiskan FC,热)。在我们的在活的有机体内研究中,我们还用ELISA测定血清和BALF中细胞因子和趋化因子。

2.9。RNA隔离和实时PCR基因表达

肺组织的总RNA提取使用试剂盒试剂(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。从这个RNA,我们合成cDNA使用互补脱氧核糖核酸合成工具(技术)。然后,我们使用一个实时PCR系统工具包(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)spectrofluorometric热循环(iCycler;Bio-Rad)检测互补脱氧核糖核酸基因表达。表1介绍了使用特定的基因引物。

表1
引物用于实时PCR分析mRNA的表达。
2.10。信息附着力试验

A549细胞治疗与苦参碱和孵化有限合伙人(1μg / mL) 24 h。然后,neutrophil-like HL-60细胞治疗与钙黄绿素是解决方案(σ)和cocultured A549细胞1 h。我们观察到的附着力HL-60细胞A549使用荧光显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。

2.11。和核蛋白质总量的准备

与苦参碱治疗后1 h, A549细胞与LPS刺激(1μg / mL) 30分钟为24小时检测蛋白质磷酸化或评估总蛋白表达。蛋白质提取使用蛋白质裂解缓冲含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(σ)。核蛋白质提取使用NE-PER核和胞质提取试剂盒(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。所有蛋白质都是量化使用BCA蛋白质分析工具包(皮尔斯)。

2.12。西方免疫印迹分析

等量的蛋白质分离10% SDS聚丙烯酰胺凝胶,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔,Billerica的)。PVDF膜被孵化一夜之间在4°C主要抗体,包括cox - 2,我κB -α,phosphorylated-IκB -α核纤层蛋白B1、p65 phosphorylated-IκB -α(圣克鲁斯、钙、美国),ERK1/2, p38,物,phosphorylated-ERK1/2, phosphorylated-p38, phosphorylated-JNK(微孔),ICAM-1,β肌动蛋白(σ)。隔夜孵化后,膜被TBST缓冲区(150毫米氯化钠;10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值8.0;和0.1%渐变20)和孵化HRP-conjugated二级抗体1 h。最后,膜清洗和加工与鲁米诺/增强器解决方案(微孔)检测和量化的具体使用BioSpectrum蛋白质600系统(美国UVP高地,CA)。

2.13。转染和荧光素酶检测

转染pNFκB-Luc NF -质粒评估κ如前所述(B活动13]。简而言之,A549细胞转染与pNF。虽然κB-Luc质粒(美国加州Stratagene)和细胞使用苦参碱1 h和与LPS刺激4 h。荧光素酶活性是化验使用多模标(HT BioTek协同作用,贝德福德郡,英国)。

2.14。统计分析

所有的数据进行了分析使用单向方差分析(方差分析),其次是Tukey-Kramer多重比较的方法。值表示为±SEM。一个 值< 0.05被认为是表明一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。苦参碱对激活A549细胞炎症反应的影响

≤400剂量μ米,苦参碱并不影响A549细胞的生存能力(数据没有显示)。因此,苦参碱浓度的100 - 400μ中使用了在体外实验。首先,我们调查了苦参碱调节细胞因子和趋化因子生产LPS-stimulated A549细胞(图1)。我们发现苦参碱显著降低il - 6浓度的方式生产:il - 6生产与有限合伙人, pg / mL;与100年μ苦参碱, pg / mL ( 仅与LPS);200年μ苦参碱, pg / mL ( 仅与LPS);400年μ苦参碱, pg / mL ( 对有限合伙人单独)。苦参碱也存在剂量依赖的相关性下降引发的水平,MCP-1, CCL5 LPS-stimulated A549细胞。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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图1
苦参碱对细胞因子和趋化因子产品LPS-stimulated A549细胞。ELISA用于测量水平的il - 6 (a),引发(b), CCL5 (c)和MCP-1 (d)。所有数据提出了均值±SEM。 与有限合伙人相比对照组。 与有限合伙人相比对照组。
3.2。苦参碱对LPS-Induced cox - 2和ICAM-1蛋白表达的影响

A549细胞用苦参碱预处理,其次是与LPS刺激24 h。苦参碱预处理浓度的方式显著抑制cox - 2蛋白表达与LPS-stimulated A549细胞(图2(一个))。ELISA(图2 (b)(图)和免疫印迹分析2(一个))还表明,苦参碱显著抑制ICAM-1表达式:有限合伙人, pg / mL;苦参碱100μ米, pg / mL ( 仅与LPS);苦参碱200μ米, pg / mL ( 仅与LPS);苦参碱400μ米, pg / mL ( 对有限合伙人单独)。炎性肺上皮细胞表达ICAM-1促进中性粒细胞粘附[17]。相应地,我们还发现苦参碱治疗的依从性下降HL-60细胞LPS-stimulated A549细胞(图2 (c))。

(一)
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(b)
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(c)
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图2
苦参碱影响LPS-induced作品的考克斯和ICAM-1 A549细胞。cox - 2和ICAM-1蛋白质水平检测使用西方的屁股β肌动蛋白表达作为内部控制(a),和ICAM-1水平衡量ELISA (b)。(c)治疗100 - 400μM苦参碱(M)的依从性抑制neutrophil-like HL-60细胞A549细胞活跃。数据均值±SEM。 相比,有限合伙人。
3.3。苦参碱对LPS-Induced NF -κB和磷酸化激活MAPK通路在人类肺上皮细胞

在发现苦参碱降低产品的趋化因子,促炎细胞因子,和cox - 2在LPS-stimulated A549细胞,我们进一步研究了苦参碱是否减毒的激活NF -κ在这些细胞B和MAPK通路。如果细胞,我κ持有NF - BκB复杂(p65和p50)在细胞质中,在LPS刺激诱发的磷酸化κB -α,增加释放p65进入核(18]。在这里我们发现苦参碱显著抑制了我κB -α磷酸化和减少我κB -α退化,从而衰减p65易位到细胞核与观察LPS-stimulated A549细胞(数字3(一个)和3 (b))。NF -κB活动评估使用一个启动子荧光素酶测定,发现苦参碱能显著减少荧光素酶活性(图3 (c))。我们也观察到,苦参碱抑制磷酸化ERK1/2,物,p38相比LPS-stimulated A549细胞(图4)。

(一)
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(b)
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图3
苦参碱抑制NF -核易位κB在A549细胞。(一)我苦参碱对的LPS-induced磷酸化的影响κB -α我,总κB -α作为内部控制的水平。(b)的核易位NF -κB细胞用不同浓度苦参碱预处理与有限合伙人(1 1 h然后孵化μ1 h g / mL)。内部控制在原子核和核纤层蛋白B1β肌动蛋白在胞质。(c)苦参碱抑制NF -荧光素酶活性κ启动子分析。三个独立的实验与LPS-treated对照组进行了分析和比较。数据均值±SEM。 相比,有限合伙人。

图4
苦参碱影响LPS-induced MAPK通路分子的磷酸化。西方墨迹显示的影响表明苦参碱浓度的磷酸化ERK (前两行),p38 (中间两排)和物(下面两行)。三个独立的实验分析和比较LPS-treated组。
3.4。苦参碱抑制中性粒细胞浸润LPS-Induced肺损伤的老鼠

老鼠的牺牲后,肺组织与福尔马林固定,他染色分析中性粒细胞在肺段的分布。LPS组表现出更大的中性粒细胞浸润与N组(图5)。此外,苦参碱治疗显著抑制中性粒细胞浸润肺活检的老鼠。


图5
苦参碱抑制中性粒细胞浸润。苏木精和伊红染色用于组织学检查气道炎症的肺组织(放大400倍)。N组:正常控制老鼠;LPS组:LPS处理;M10组:10毫克/公斤苦参碱+有限合伙人;M20组:20毫克/公斤苦参碱+有限合伙人。
3.5。苦参碱降低BALF的中性粒细胞计数LPS-Challenged老鼠

评价BALF透露,苦参碱抑制炎症细胞的急性肺损伤小鼠中性粒细胞浸润。苦参碱腹腔注射LPS-induced小鼠急性肺损伤导致明显降低中性粒细胞与LPS组:有限合伙人, 中性粒细胞/毫升;M10, 中性粒细胞/毫升( 仅与LPS);M20, 中性粒细胞/毫升( 独自与LPS)(图6(一))。

(一)
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图6
苦参碱影响中性粒细胞计数和BALF中细胞因子和趋化因子水平。在不同的治疗组中,我们分析了中性粒细胞细胞计数(a)和il - 6的水平(b)和肿瘤坏死因子-α通过ELISA (c)测定。N组:正常控制老鼠;LPS组:LPS处理;M10组:10毫克/公斤苦参碱+有限合伙人;M20组:20毫克/公斤苦参碱+有限合伙人。所有数据都意味着±SEM。 与有限合伙人相比对照组。 与有限合伙人相比对照组。
3.6。苦参碱对BALF中细胞因子和趋化因子水平的影响

急性肺损伤小鼠苦参碱处理表现出降低il - 6水平:有限合伙人, pg / mL;M10, pg / mL ( 仅与LPS);M20, pg / mL ( 独自与LPS)(图6 (b))。苦参碱治疗也降低TNF -α水平在这些老鼠:有限合伙人, pg / mL;M10, pg / mL ( 仅与LPS);M20, pg / mL ( 独自与LPS)(图6 (c))。使用实时PCR评估基因表达,我们发现苦参碱显著降低il - 1的含量β、il - 6、TNF -α、IL-13 MCP-1, CCL5肺损伤组织(图7)。然而,苦参碱不抑制il - 4的基因表达,CCL11或CCL24。我们进一步发现苦参碱抑制基因的表达ICAM-1,进气阀打开,cox - 2在肺损伤组织。


图7
苦参碱影响细胞因子的表达式,趋化因子和炎症介质的肺。使用实时rt - pcr基因表达测定。褶皱测量相对表达水平β肌动蛋白表达(内部控制)。数据意味着±SEM。 相比之下,有限合伙人控制老鼠。 相比之下,有限合伙人控制老鼠。
3.7。苦参碱对NF的磷酸化的影响κB和MAPK通路在肺损伤组织

苦参碱的价格相比显著地抑制p65的磷酸化LPS-stimulated肺损伤组织。苦参碱也抑制磷酸化ERK1/2、物和p38的肺损伤组织(图8)。


图8
苦参碱影响LPS-induced核的磷酸化NF -κB和MAPK通路分子的磷酸化。磷酸化在肺组织分析了西方的污点。三个独立的实验进行了分析并与LPS-treated组结果进行了比较。
3.8。苦参碱对血清细胞因子生产的影响

分析显示显著降低血清il - 6和TNF -生产α生产M20组相比,LPS组(图9)。

(一)
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(b)
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图9
苦参碱影响血清炎性细胞因子的水平,包括il - 6 (a)和肿瘤坏死因子-α(b)。所有数据都表现为±SEM手段。 与有限合伙人相比对照组。

4所示。讨论

苦参碱是一个主要的活性成分分离近年来(Kushen),据报道显示许多生物和医学属性,包括改善中枢神经系统的炎症反应,抗肿瘤的活动,和immunity-regulating效应(10,19]。我们之前证明苦参碱抑制肺组织中嗜酸性粒细胞浸润,改善和抑制气道高反应在哮喘小鼠气管杯状细胞增生(12]。此外,张等人描述肺组织病理学改变和炎性反应在18 h有限合伙人注入老鼠体内后,报告说,苦参碱降低髓过氧物酶和丙二醛活动,抑制活性氧和BALF中氧化应激20.]。

在我们目前的研究中,我们调查了苦参碱是否改善了炎症反应在急性肺损伤小鼠4 h有限合伙人注射后进入气管,还研究了在LPS-stimulated人类肺上皮细胞炎症反应。我们的研究结果表明,苦参碱显著抑制cox - 2表达和il - 6的作品,引发,MCP-1, CCL5 LPS-stimulated A549细胞。苦参碱治疗也抑制ICAM-1表达式,相应地减少LPS-stimulated A549细胞中性粒细胞粘附。最后,苦参碱抑制炎症信号通路的组件,包括NF -κB和MAPK通路。

有限合伙人是革兰氏阴性细菌细胞壁的重要组成部分21]。在感染革兰氏阴性细菌,有限合伙人释放导致发炎和发烧症状,可能导致严重的急性或慢性器官充血,水肿,甚至脓毒性休克和死亡(22]。LPS刺激我κB磷酸化,解放NF -κB(包含p50和p65)可能促使进入细胞核。在细胞核,p65炎症基因的启动子结合,导致促炎细胞因子的表达式,趋化因子,cox - 2, ICAM-1 LPS-stimulated A549细胞(21,23]。MAPK通路也调节NF -κB激活改变cox - 2和ICAM-1表达式(24]。我们目前的实验表明,苦参碱显著抑制促炎细胞因子和趋化因子的分泌LPS-induced A549肺上皮细胞。这种效应可能是由于苦参碱抑制MAPK和NF -κB激活。这些结果表明,苦参碱治疗可以改善肺部细菌感染的炎症反应的情况下。

以前,张等人研究了苦参碱的管理经过30分钟的LPS刺激和报道,苦参碱降低肺部炎症和氧化通过抑制炎症信号通路(20.]。然而,他们的协议涉及有限合伙人静脉注射60小时后,和存活率只有20%。老鼠给20毫克/公斤苦参碱没有显示增加存活率;小鼠给予100毫克/公斤苦参碱显示60%的存活率,减少肺损伤(20.]。相反,我们目前的实验模型的肺损伤气管内的注射LPS诱导局部炎症性肺损伤,这似乎更适合评估炎性反应。此外,本实验主要研究苦参碱是否对小鼠肺损伤提供保护。小鼠腹腔内苦参碱注射液治疗,连续7天,紧随其后的是气管内的有限合伙人注射第八天,和老鼠牺牲了四个小时后。实验过程并没有导致任何的死老鼠,和我们的模型更适合观察急性肺损伤的早期反应,对苦参碱在早期肺损伤的保护作用。我们的研究结果显示,20毫克/公斤苦参碱能保护,防止肺损伤症状在这个实验模型。尽管我们的动物实验模型之间的差异和所使用的肺损伤小鼠模型Zhang et al。20.),两组的实验结果表明,苦参碱能减少小鼠的肺损伤。

在细菌感染的情况下,中性粒细胞在肺摄取入侵的细菌和释放大量炎症介质诱导炎症反应在肺25]。我们的实验表明,治疗20毫克/公斤的苦参碱抑制嗜中性粒细胞浸润和相应减少肺部BALF中中性粒细胞的数量。Chemokines-particularly引发,MCP-1 CCL5-induce中性粒细胞迁移到炎症组织(26]。苦参碱抑制引发的作品,MCP-1, CCL5 LPS-stimulated A549细胞和抑制MCP-1和CCL5基因表达在小鼠的肺部组织。炎性肺上皮细胞也表达ICAM-1促进中性粒细胞粘附分子吸附(18,27]。我们的实验发现,苦参碱抑制ICAM-1表达式在体外和在活的有机体内。总的来说,我们的研究结果表明,苦参碱可能有助于减少中性粒细胞浸润在肺部的炎症反应。这是特别有用,因为肺部炎症和肺损伤在LPS-induced急性肺损伤主要是由于中性粒细胞浸润。另一方面,苦参碱没有有效地减少CCL11的基因表达和CCL24肺癌和,因此,苦参碱没有改善嗜酸性渗透在这个LPS-induced肺损伤小鼠模型。苦参碱也没有有效地抑制基因的表达Th2-associated肺组织中细胞因子il - 4和IL-13。

5。结论

总之,我们的结果表明,苦参碱显著抑制炎症反应在人类肺上皮细胞和阻塞ICAM-1表达式,防止LPS-induced小鼠急性肺损伤。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Chian-Jiun Liou和You-Rong赖了同样的纸。

确认

本研究支持部分由长庚医院(CMRPF1C0202和CMRPF3E0051)和长庚科技大学(EZRPF3E0191)。