文摘
红血球红细胞表面存储和存储期间经历许多变化可能引起负面影响,最终导致器官损伤输血。我们测试的假设的SP存储红血球会提高存储红细胞表面的质量并降低输血后肝损伤小鼠模型。红血球是从C57BL / 6 j小鼠和存储收获了14天CPDA-1含SP在盐水溶液或生理盐水。红血球溶解,24小时posttransfusion复苏,携带氧气的能力,和存储红血球的SOD活性进行了评估。等离子体生物化学、肝脏MDA水平,MPO活性,il - 6、TNF -α浓度和组织病理学检测存储红血球输血后的两个小时。与红血球存储在CPDA-1和生理盐水相比,红细胞表面增加SP存储恢复携带氧气的能力和SOD活性,降低了AST活性,包子的浓度,在等离子体和LDH活性,减少MDA水平,MPO活性,il - 6和TNF -的浓度α在肝脏。这些数据表明,添加SP存储有益影响存储期间红细胞表面损伤在体外输血后,随后减轻肝损伤红细胞表面存储在活的有机体内。
1。介绍
红细胞(RBC)出血性休克患者输血是一个拯救生命的治疗,贫血,和手术。红细胞表面,增加利用率,减少浪费,通常冷冻和储存在临床情况下好几天了。在存储期间,红细胞表面接受一系列的结构和功能改变,称为“存储病变”(1- - - - - -3]。细胞ATP和2,3-DPG损耗曾被观察到在存储期间,红细胞表面,这些变化影响输血的生存及其携带氧气的能力(4- - - - - -6]。此外,细胞抗氧化能力的丧失导致的生成活性氧(ROS)在存储,从而增加蛋白质和脂质氧化在红细胞表面存储7]。这种损伤可能直接刺激炎症介质的产生,随后引起器官损伤包括肝损伤在某些收件人输血后的红细胞表面存储(8,9),这可能是与发病率和死亡率的增加有关10- - - - - -12]。
美国食品和药物管理局(FDA)批准了红血球中存储的存储解决方案。具体来说,红细胞表面可以存储多达42天没有超过1%溶血和红细胞表面至少75%的输血生存输血后24 h (13- - - - - -15]。许多研究都试图降低病变通过改进的组成存储解决方案。的营养和抗氧化剂以前缓解存储病变在加拿大皇家银行存储。添加外源葡萄糖可以扩展存储红血球减少溶血和提供能源的16,17]。斯托等人表明,添加抗坏血酸溶液受益红血球中存储的恢复和免疫原性(4]。这项研究还表明,简单的抗氧化剂不能减少输血炎症的小鼠模型。在此,我们假设一个多功能添加剂的解决方案可以提供能量代谢的底物,产生抗氧化作用在红细胞存储可以减少存储病变以及减少氧化应激和炎症输血输液后小鼠模型。
丙酮酸是开3个碳分子在糖酵解产生的。丙酮酸可以转化为ATP三羧酸(TCA)周期和作为一种抗氧化剂(也得到了证实18]。丙酮酸钠(SP)据报道,在出血性休克减弱组织损伤,脑损伤和缺血再灌注损伤模型(19- - - - - -22]。此外,以往的研究表明,丙酮酸可以保持ATP和2,3-DPG水平在加拿大皇家银行存储在体外(23,24),这些结果表明,添加SP在红细胞存储可能缓解存储病变,这需要进一步研究。此外,添加SP的影响在红细胞储存在存储红血球输血后的器官损伤在活的有机体内是未知的。我们假设的SP在红细胞存储可以减少存储病变,随后减少器官损伤后在接受输血。
小鼠红细胞存储模型被广泛用于研究破坏红血球在存储(9,25]。先前的研究表明,小鼠红细胞表面存储两周是类似于人类红血球储存6周和存储期间经历了类似的生理生化变化7,26- - - - - -28]。SP的输血的影响红细胞表面存储一个小鼠模型中进行评估。我们发现SP可以恢复红血球携带氧气的能力,减少氧化应激和炎症在肝脏输血后的红细胞表面存储在一个小鼠模型。
2。材料和方法
2.1。动物
这项研究是制度动物保健和使用委员会批准的军事医学科学院(IACUC阿姆思- 2014 - 027)。都是努力减少实验用动物的数量,他们的痛苦。8 - 12个野生型雄性C57BL / 6 j小鼠从至关重要的河流(中国,北京)购买和使用后的适应时期至少五到七天25°C在12 h光/ 12 h暗周期。
2.2。SP备料和加法
SP是购买(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),和股票的解决方案的SP准备在325年最终浓度的盐溶液更易通过0.22 L和过滤μ真空过滤机。SP股票的解决方案被添加到鼠标红血球在1:130(卷/期)比,最后集中存储解决方案是2.5 SP的更易与离心前/ L。
2.3。小鼠红细胞表面:收集、存储和输血
老鼠与腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(75毫克/公斤)和机械通风的呼吸速率120 /分钟和潮汐的10μL / g使用Minivent鼠标通风机(哈佛装置,Hugstetten,德国)。体温维持在°C使用加热垫(SOFTRON, tms - 201,北京)。在血液采集,手术部位与75%乙醇消毒,和老鼠无菌流血通过心脏穿刺在无菌工作表,和血液收集CPDA-1(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。最后CPDA-1浓度用于存储是14%。整个血液从20到30老鼠收集池,使用无菌leukoreduced高效leukoreduction过滤器(ZhiXing生物科技有限公司、安徽蚌埠,中国),在400 g×15分钟离心机,volume-reduced最终比容的70%到75% (Hb 17到18 g / dL)。
红血球是存储在两个不同的解决方案:(1)对照组,红血球存储在CPDA-1 +生理盐水,和(2)SP集团红血球存储在CPDA-1 + 2.5毫米SP。红血球被放置在0.6毫升管(美国康宁公司CA)和储存在4°C 14天。
输血前,储存红细胞表面清洗三次使用10卷的PBS和离心机在400×g。最后洗后,红细胞表面清洗和存储在PBS resuspended最后Hb浓度类似于最后一个血球容积的70%到75%。所有收件人老鼠收到20%总血容量的鼠标通过尾静脉。两个小时后,老鼠通过心脏穿刺无菌流血评估等离子体生物化学。然后老鼠安乐死来获取组织样本。组织样本用生理盐水洗净snap-frozen在液态氮,并储存在液氮直到化验。
2.4。测量和计算在体外红细胞溶血
ABL90 FLEX的血气测定血气分析仪(辐射计,哥本哈根,丹麦)后14天的存储。上层清液和总Hb,被用来计算的百分比溶血,测量使用一个免费的血红蛋白测定工具包(南京建成生物工程研究所,中国)。随后的溶血率计算如下(29日]:
2.5。流式细胞术对红细胞生存
红细胞表面贴上了异硫氰酸荧光素(FITC)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)如前所报道(30.,31日]。荧光染料溶液是由溶解100毫克的异硫氰酸荧光素(FITC) 10毫升的PBS。这个解决方案添加到存储血液稀释剂,66年最后一个FITC浓度μ克/毫升。细胞染色中孵化20分钟解决方案在37°C在黑暗中,红细胞表面,标签被洗了三次在PBS和输血到每个收件人鼠标每实验组小鼠(5)通过尾静脉。十分钟和24小时输血后,收件人是retroorbitally融合成肝素化管,5μL 1毫升血液稀释的流式细胞仪缓冲区。红细胞表面的荧光比例是衡量流式细胞仪(美国BD FACSCalibur, MA)使用的百分比红细胞表面荧光测量输血后10分钟的参考价值。24小时生存决定是基于荧光红血球的比率在24小时的参考价值。
2.6。血红蛋白氧饱和度的实验
血氧饱和度测量Hemox分析器(TCS科学公司,新的希望,PA,美国)。简而言之,包含6毫克的悬浮红细胞的血红蛋白最初在37°C的环境4毫升Hemox缓冲区(30毫米的te (N-Tris hydroxymethyl-methyl-2-aminoethanesulfonic酸),氯化钾氯化钠135毫米和5毫米,pH在37°C;渗透性mOsm /公斤)和0.1% BSA Hemox分析器。之后的10μ消泡剂L(美国TCS科学、新的希望、PA),阿宝2和温度稳定在测量血氧饱和度。的值外推的设在点O2饱和度为50%。
2.7。测量等离子体生物化学和乳酸的水平
等离子体天冬氨酸转氨酶(AST)活性、血尿素氮(BUN)测定浓度,和乳酸脱氢酶(LDH)活性的评估使用日立7180 autoanalyser(日立高新技术公司,东京,日本)。乳酸的浓度是由乳酸测定工具包(中国南京建成生物研究所)根据制造商的建议。
2.8。MDA水平测量,MPO活性、SOD活性
SOD的活性在存储使用SOD测定红血球测量工具(南京建成生物研究所,中国)。肝组织均质在冷生理盐水准备匀浆10%,然后在1000 rpm和离心机在4°C 6分钟。当时上层清液收集测量MDA水平和MPO活性使用MDA浓度和MPO活性测定试剂盒(南京建成生物研究所中国)根据制造商的建议,如前所报道(32]。总肝蛋白质含量测定采用BCA蛋白质化验设备(生物医学生物公司,北京)。
2.9。炎性细胞因子水平的测量
肝组织均质冰在0.9%盐水含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏,曼海姆,德国)。匀浆是离心机在1000 g×6分钟4°C,和上层的化验的炎性细胞因子的水平。白介素- IL - 6和TNF -α水平上层清液测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(美国新泽西PeproTech,落基山)根据制造商的说明报告(25]。的值表示为pg /毫克的蛋白质。
2.10。肝脏组织学
输血后两个小时,肝脏和4%多聚甲醛固定石蜡和嵌入。部分被苏木精和伊红染色())来观察组织学变化(33]。肝脏的组织学变化是由光学显微镜检查盲评。肝损伤评估在炎症细胞浸润和得分分制评分(0,没有;1、轻微;2、温和;3、严重)如前所述34]。
2.11。统计分析
并给出了数据意味着±标准差(SD)。所有使用统计软件进行分析(SAS研究所Inc .,卡里、数控、美国)。基于选择的样本数据的平均值从初步的实验参数。4生物复制在体外研究或十老鼠每组在活的有机体内需要研究第一类误差为0.05,至少80%的力量。每组的方式比较使用单向方差分析(方差分析)其次是Student-Newman-Keuls测试时正常和方差齐性的假设是满意的;否则,方差分析后跟Student-Newman-Keuls多个测试应用范围。显著性水平被设定。
3所示。结果
3.1。血气分析
pH值、pCO2,阿宝2、SBE Na+,Cl−值控制和SP组没有显著差异(表1)。乳酸含量明显高于SP组(27.0±0.6更易/ L)比对照组(25.1±0.7)()。
3.2。血红蛋白氧饱和度的实验
值是阿宝2血红蛋白与氧half-saturated。如图1,价值SP集团(毫米汞柱)明显高于对照组(毫米汞柱)()。
3.3。SOD活性
SOD酶是一种抗氧化剂,被认为是重要的ROS消除。存储红血球的SOD活性明显高于SP组(U /毫克蛋白)比对照组存储后14天(648.1±10.0 U /毫克蛋白)(,图2)。
3.4。红细胞溶血和24小时恢复
红细胞表面的红血球溶解和24小时恢复存储测量。SP的红血球溶解的红细胞表面存储组(%)低于对照组(%),但是这种差异不显著()。
24小时恢复存储红血球高SP组(77.86±5.4%)高于对照组(75.63±1.8%),但这种差异也不显著()。
3.5。等离子体化学
等离子体生物化学是本研究调查。如图3(一个)AST活性显著降低,SP集团(比对照组(U / L)U / L) ()。包子的浓度也显著降低SP组(更易比对照组(左)更易/ L) (,图3 (b))。SP的LDH活性也显著降低集团(比对照组(U / L)U / L) (,图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.6。肝脂质过氧化作用
评估组织脂质过氧化水平,肝中MDA浓度测量。如图4(一)、MDA浓度显著低于SP集团(更易比对照组(毫克蛋白)更易/毫克蛋白)()。
(一)
(b)
3.7。肝脏嗜中性粒细胞聚集
中性粒细胞在肝脏积累水平是衡量确定MPO活性。肝脏的MPO活性显著降低SP组与对照组相比,图4 (b))。
3.8。肝脏的炎性细胞因子水平
增加肝脏明显抑制il - 6的SP组与对照组(,图5(一个))。肿瘤坏死因子的水平α在肝脏也SP组低于对照组(,图5 (b))。这些结果表明,SP可以减少系统性释放炎性细胞因子与对照组相比在红细胞存储。
(一)
(b)
3.9。肝脏组织学
如图6,在对照组肝脏表现出嗜中性粒细胞浸润,但这些现象不太明显的SP肝脏。炎症SP组的得分显著低于对照组(,图6 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
在这项研究中,添加SP的影响红细胞存储在存储期间红细胞表面的损伤在体外输血后和器官损伤小鼠模型进行评估。我们的实验表明,SP可以恢复红血球中存储的携带氧气的能力,减少AST活性,包子浓度,血浆LDH活动的接受者2 h后红细胞表面存储的输血。的SP在红细胞储存也减少了MDA浓度,MPO活性,il - 6和TNF -α输血后肝脏中含量与对照组相比。综上所述,我们的研究结果表明,添加SP存储红细胞表面可以减弱红细胞输血存储病变和随后的肝损伤小鼠模型。
SP可能受益的红血球携带氧气的能力,因为它不仅提供了能量代谢的底物,也作为一种抗氧化剂在红细胞存储。丙酮酸是糖代谢途径的关键中间产品,可以加快成乳酸,促进ATP的生成和2,3-DPG [35]。一项研究表明,ATP和2,3-DPG水平在红细胞表面显著减少存储(16]。SP可能恢复存储红血球携带氧气的能力的提高能量代谢。此外,红血球携带氧气的能力却降低了当血红蛋白氧化成高铁血红蛋白(36]。SP可能恢复的红血球携带氧气的能力衰减红细胞中血红蛋白的氧化存储。
红细胞表面的方法直接标签与先前(FITC已经报道30.]。我们测量了24小时的新鲜红血球(表1 s(在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/3549207),97.6±1.2%),类似于生存在一项研究报告(25]。这个结果表明,FITC-labelling协议不影响红细胞生存能力。
丙酮酸钠的保护作用在红细胞表面存储在CPDA-1和更现代的存储解决方案(即。、SAGM 1)仍然需要评估。在这项研究中,我们报道了丙酮酸钠的添加红血球CPDA-1存储中存储病变有有益的影响在体外随后减轻肝损伤后红细胞表面存储的输血在活的有机体内。这种有益的效应可能是由于改善能量代谢,氧化状态,细胞内酸中毒、或红细胞表面携带氧气的能力20.,37]。SAGM和含有甘露醇和氯化钠为1的解决方案,它可以维持细胞膜的完整性,而不CPDA-1解决方案。然而,SAGM和1存储解决方案不包含专门针对活性氧成分,细胞内酸中毒或能量代谢。因此,我们相信,丙酮酸钠的加入现代存储解决方案仍然可以提供额外的红细胞表面的保护作用。
丙酮酸钠与红细胞表面存储一直在调查之前提高存储人类红细胞表面的质量的目的。布特勒等人的研究表明,丙酮酸可以在人类红血球存储保持ATP水平浓度从0.3到3毫米,而2,3-DPG不能(23,38]。道森等人报道,丙酮酸浓度较高(40 - 320毫米)可以保持升高或正常2,3-DPG水平,但在存储人类红血球(ATP含量下降24]。在我们的研究中,丙酮酸钠剂量(2.5毫米)是我们初步选定基于以前的研究和实验。报道的治疗在体外剂量为丙酮酸钠在先前的研究大多在1和4毫米23,39,40]。在我们的初步实验中,我们观察到2.5毫米剂量是优越的值在体外1毫米的剂量相比,5毫米,或10毫米。我们发现丙酮酸(2.5毫米)可以提高ATP水平(41)和存储小鼠红细胞表面携带氧气的能力。需要更多的研究来优化丙酮酸浓度提高存储红细胞表面的质量。此外,以往的研究表明,丙酮酸钠可以在出血性休克减弱组织损伤,脑损伤和缺血再灌注损伤模型。因此,输血前清洗过程在这项研究是必要的,以排除残余丙酮酸钠对肝损伤的影响。
一项研究表明,长期的红细胞输血前存储与感染的比率上升,multiorgan失败,和死亡率在一些住院病人(11,42- - - - - -44]。尽管准确机制负责存储的有害影响红细胞输血并不完全理解,红细胞表面存储的可变形性一直被视为一个重要的负面影响的原因输血后观察到红细胞表面存储(45]。在这项研究中,我们发现SP的红细胞表面存储可以减弱输血后肝损伤。改善膜的红血球中存储的可变形性可能导致SP的有利影响。SP可能改善红细胞表面的膜可变形性和维护红细胞膜的完整性,减少脂质过氧化作用。额外的研究应该澄清的精确机制SP的保护器官接受者输血后存储红血球。
尽管只有肝损伤是评估在这项研究中,SP的红细胞表面存储也可能减轻nonhepatic器官损伤。我们的结果表明,添加SP储存红细胞表面浓度可降低等离子体包(图1),传统的肾损伤的标志,在输血。此外,LDH是一个重要的同工酶在糖酵解和无处不在的肺、心脏、肝、和其他组织。组织损伤导致血浆LDH的释放,这就增加了LDH活性在等离子体46]。在这项研究中,SP的红细胞表面存储还可以抑制输血后血浆LDH活动。这一结果表明,红细胞表面存储的SP可能减弱组织损伤后的收件人输血。
的SP的同渗重摩盐水改变最终的解决方案。以前的研究报道,渗透压会影响存储红细胞表面的质量(47,48]。增加同渗重摩据说可以促进钾的泄漏,干扰离子平衡,从而减少存储红细胞表面的质量(49]。在这个实验中,SP的盐水略升高的同渗重摩最终解决(SP组:mOsm /公斤;对照组:368±1 mOsm /公斤),但发现SP存储红血球中获益。这些结果表明,同渗重摩的变化由于添加SP在红细胞储存可能不会导致SP在这项研究中观察到的有利影响。
在这项研究中,小鼠系统是一个容易处理平台的快速存储红细胞表面的研究输血的不良后果在活的有机体内和添加SP在红细胞储存的改进。然而,在小鼠模型的区别和人类红细胞存储,这些观察直接从小鼠模型可能并不总是适用于人类(50- - - - - -52]。因此还需要后续的研究来测试这些假设在人类红细胞存储系统。
5。结论
总之,红细胞表面的SP的解决方案在随后存储恢复红血球携带氧气的能力,减轻肝损伤后红细胞表面存储的输血。虽然这些研究结果值得进一步研究,我们的研究结果表明,添加存储红血球SP可能是一种很有前途的战略避免输血存储红血球的不利影响。随后重点研究在人类需要测试这些假设在人类红细胞存储系统。
缩写
| AST: | 天冬氨酸转氨酶 |
| 包子: | 血尿素氮 |
| CPDA-1: | Citrate-phosphate-dextrose-adenine-1 |
| FITC: | 异硫氰酸荧光素 |
| 食品药品监督管理局: | 食品和药物管理局 |
| il - 6: | 白细胞介素- 6 |
| MDA: | 丙二醛 |
| MPO: | 髓过氧物酶 |
| LDH: | 乳酸脱氢酶 |
| pCO2: | 二氧化碳的分压 |
| 阿宝2: | 氧气分压 |
| 红细胞表面: | 红细胞 |
| ROS: | 活性氧 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| SP: | 丙酮酸钠 |
| 柠檬酸: | 三羧酸 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子-α。 |
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
夏沙和陈Gan同样这项工作:他们构思研究,开展研究,写了手稿。玉茎阴和薄王参与修订手稿,并帮助衡量炎性细胞因子水平。振威太阳帮助起草手稿从动物红细胞表面和收获。Jingxiang赵参与修订手稿和帮助起草的手稿和李Penglong导致了研究统计分析和灌输了存储红血球。连赵和香港周组长和负责这项研究的所有概念和技术方面。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(没有。81600148)和阿姆思的青年科学基金(没有。2015 cxjj22)。