文摘

背景和目的。调节性T细胞亚群)建议调节stroke-induced免疫反应。然而,亚群的分析和实验中风患者产生了矛盾的结果。我们当前的研究来评估执行的监管和功能亚群在中风患者外周血。表达CD39年龄依赖亚群在人与鼠量化。方法。总FoxP3⁺亚群和CD39⁺FoxP3⁺亚被流式细胞术定量控制和中风患者入院时和天1,3,5,7。Treg函数评估量化activation-induced CD69的表达的抑制和CD154 T效应细胞(画眉草)。结果。总treg CD4的占5.0%⁺T细胞在控制和<中风患者入院时的2.8%。他们仍低于控制值,直到第七天。CD39⁺减少中风患者亚群最强烈。在3天的Treg-mediated抑制CD154 upregulation CD4细胞⁺画眉草是中风患者受损。CD39表情Treg随着年龄增加外周血的老鼠和人。结论。我们将演示活动FoxP3的丧失⁺CD39⁺从中风病人的外周血亚群。剩余的抑制Treg功能亚群是卒中后受损。

1。介绍

缺血性stroke-induced免疫改变(SIIA)被认为影响中风患者的结果,在一定程度上提高他们对细菌感染的易感性。本实验中风模型所示的病人(1- - - - - -3]。改变免疫系统被认为是由快速激活自主神经系统和肾上腺(HPA)轴。在中风患者中,等离子体的应激激素水平与免疫改变的程度(4,5]。

除了系统性immune-suppressive改变观察外周血,局部炎症免疫反应也发展。在24 h,白细胞积聚在缺血性脑区(6,7]。最近的观测表明,淋巴细胞而不是粒细胞可以侵入血脑屏障和渗透缺血性损伤和半影[8- - - - - -10]。迄今为止,调节这个局部炎症反应的机制和白细胞亚型的角色只是部分理解。在实验中风模型中,T细胞激活的中枢神经系统抗原已经转移到老鼠缺乏B和T细胞。这些autoreactive T细胞被发现中风损伤及其转移增强中风的严重程度(11]。此外,T细胞免疫耐受化中枢神经系统自身抗原对实验性中风的结果(有很大好处12]。在一起,这些数据表明,中风之后有一些自身免疫性炎症的性质。

调节性T细胞亚群)调节器的适应性免疫反应和发挥重要作用在维护公差自体抗原。小鼠CD25枯竭⁺CD4⁺亚群或废除功能加剧各种自身免疫性疾病,包括自身免疫性胃炎、甲状腺炎,1型糖尿病(13]。因此,它被假定,在中风、亚可能会抑制免疫级联,导致继发性脑损伤,这不是直接由缺血引起的。支持这个概念的发现Liesz et al .,用抗体介入CD25的损耗⁺细胞消除亚群,糟糕的结果报道在一个实验性中风模型(14]。相比之下,耗尽FoxP3 Kleinschnitz等人报道⁺亚群的诱导白喉毒素受体构建FoxP3启动子的控制下减少脑损伤(15]。额外的相互矛盾的数据报告,Treg消耗使用类似中风小鼠模型在不同实验模型并没有改变最初的卒中后4天内的梗塞体积(16]。最近,有争议的数据继续从实验报告中风模型。提高Treg函数与一个superagonistic anti-CD28抗体(CD28SA) 3 h后大脑中动脉阻塞(MCAO)降低脑损伤和提高的结果,而相同的预处理CD28SA抗体MCAO后立即恶化临床结果和治疗对缺血性脑容量没有影响在另一项研究[17,18]。在人类中,Treg外周血的枚举和功能也产生了矛盾的结果。而拥抱等人都无法检测的变化Treg函数在缺血性中风患者5],燕等人报道功能受损,但亚群比例增加(19]。

在某种程度上,这些矛盾的发现可能导致甚至FoxP3的事实⁺亚不是一个同质人口;相反,他们可以分为几个子组,可以区分不同功能和表面抗原表达(20.]。CD45RA天真FoxP3表达⁺细胞。即使在成年后,一些天真FoxP3⁺细胞可以在循环中找到。在抗原刺激,CD45RA⁺亚失去CD45RA表达式,开始增殖,分化,more-suppressive Treg表型(13,20.]。CD39是病原ectonucleotidase劈开了促炎细胞外腺苷三磷酸(ATP) [21,22)抑制和抗增殖腺苷酸(23]。事实上,表达CD39可以识别功能活跃,抑制亚群在啮齿动物和人类24]。

我们目前的研究来确定执行监管Treg Treg功能子集的人类中风患者的外周血。

2。方法

2.1。人类研究

2.1.1。病人和控制

患者(年龄:18 > y)急性大脑中动脉梗塞研究都有资格在12 h疾病发作。他们招募了药格赖夫斯瓦尔德大学的神经学部门如果他们的美国国立卫生研究院的中风尺度(署)得分≥6日承认他们没有感染的迹象,他们的血浆c反应蛋白(CRP)水平≤50 mg / L和原降钙素(PCT)≤0.5 ng / mL。患者被排除在外,如果他们把immune-suppressive药物,患有恶性肿瘤,或有一个署得分< 6。治疗符合最佳医疗服务标准和发生在一个专用的卒中单元。重组组织纤溶酶原激活物管理和临床血栓切除术发生。控制受试者的健康或招募大学眼科诊所药格赖夫斯瓦尔德。控制受试者年龄相仿的和没有已知的神经或免疫紊乱和履行相同的标准c反应蛋白和PCT中风患者。病人和控制特性表中列出132 (a)。除了一群年轻健康对照组(21 - 79岁)被招募来分析年龄依赖性Treg CD39表达式。

中风病人分配到相关感染(SAI +)队列如果他们发达(a)临床症状的感染(肺炎、尿路感染和发热来历不明的);(b)血清CRP浓度> 50 mg / L;和(c)血清PCT浓度> 0.5 ng / mL。只有所有的条件相匹配的患者在整个研究期间感染被认为是免费的(SAI−)。病人满足某些标准但不是全部被排除在中风患者的比较,没有赛。这些标准被设计来确定两个截然不同的群体的病人如前面发表(3]。赛+细节和SAI−病人表1(b)。

2.1.2。道德声明

研究协议是医学院伦理委员会批准,格赖夫斯瓦尔德大学(没有。三世紫外线30/01)。所有患者给予书面知情同意在适当的地方直接或通过一个代理。

2.1.3。CT成像

常规脑CT图像(序列有条件现金转移支付本地、切片厚度4.5毫米和超越infratentorial;mAs = 50;kV = 120)收购16-row多层螺旋CT扫描仪(Somatom 16;西门子医疗系统,德国埃朗根)。计算病变大小、图像分析与OSIRIX 5.6。感兴趣的区域被定义手动,病变体积计算半自动地。

2.1.4。血液采样

血液样本是立即获得录取,然后6点至早上8:00在天1,3,5,7。调查人员没有盲目控制和中风患者样本,但是他们不知道中风的严重程度。

2.1.5节讨论。表型出现人类的亚群

200年整除μL(全血,实际上与乙二胺四乙酸(EDTA),孵化了的适当组合fluorescence-conjugated单克隆抗体染色表面分子。经过溶解的红细胞(缓冲区;人类FoxP3缓冲设置,BD生物科学,海德堡,德国),细胞被洗两次,准备细胞内染色没有进一步的刺激。30分钟后孵化anti-FoxP3-antibodies加上Alexa萤石647(美国BioLegend,圣地亚哥,CA)和一个额外的清洗步骤,测量细胞BD第二章或BD LSR二流式细胞分析仪(BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。

单克隆抗体用于确定表达式的细胞表面分子CD25-PE-Cy7, CD49d-FITC, CD4-V500 (BD生物科学、海德堡、德国)和CD45RA-PerCP-Cy5.5 CD39-PE (BioLegend、圣地亚哥、钙、美国)。同形像控制抗体与PE、PerCP-Cy5.5和Alexa萤石647来自BioLegend FITC和耦合,PE-Cy7, V500来自BD生物科学。

为每一个中风病人或控制样品六个合适的荧光- 1 (FMO)控制准备通过流式细胞仪确定积极的事件。占epitope-specific抗体的非特异性结合适当的同形像控制添加到每个FMO控制。

CD4细胞亚群被量化⁺CD49d⁻FoxP3⁺细胞。人类可以暂时性的FoxP3促炎效应细胞⁺但熊CD49d。因此,CD49⁺细胞被排除在FoxP3⁺人口(27]。CD45RA在这个人口亚群中,表达式是用来识别天真的亚群,尽管表面CD39表达式是用来检测激活亚群。没有CD39⁺CD45RA⁺细胞;然而,有一个一致的CD39人口⁺CD45RA⁻亚群。流式细胞术结果评估FlowJo软件7.6.5(树明星Inc .,亚什兰,美国)。

2.1.6。隔离的亚群

亚与CD4孤立⁺CD25^+高CD127^−/暗调节性T细胞隔离设备二世(人类)(Miltenyi研究GmbH, Bergisch格拉德巴赫,德国)根据制造商的指示。总之,外周血单核细胞(PBMCs)与聚蔗糖梯度分离(Biochrom AG),柏林,德国)。CD4⁺CD25⁺CD127⁻T细胞Biotin-Antibody鸡尾酒II用于消极CD4的丰富⁺CD127⁻细胞CD25的积极选择⁺细胞。

评估这些CD4细胞的纯度⁺CD25^+高CD127^−/暗细胞,样品和PBMCs被流式细胞仪检测。因此,细胞被孵化与细胞外的适量抗体和细胞内染色准备FoxP3-Alexa萤石647 (BioLegend)使用人类FoxP3缓冲区设置(BD生物科学)。细胞外染色、CD25-PE-Cy7 CD4-FITC (BD生物科学),和CD127-Pacific蓝色(BioLegend)。在所有的实验中,CD4细胞的纯度⁺CD25^+高CD127^−/暗FoxP3⁺细胞≥95%。

2.1.7。抑制试验

一旦亚被孤立,他们潜伏在100 000 / PBMCs在不同的比率(Treg: PBMC: 1: 1, 1: 2和1:4)在一个平底的盘子里。按照指令的BD FastImmune人类调节性T细胞功能套件(BD生物科学),细胞被激活与适量的CD3 / CD28珠子(Dynabeads人类T活化剂CD3 / CD28;表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)和孵化CD154-APC抗体。7 h孵化后37°C和5 - 7%₂,另外细胞被沾染了CD69-PE-Cy7 CD4-FITC CD25-PE和CD3-PerCP-Cy5.5 (BD FastImmune人类调节性T细胞功能设备;BD生物科学)。因此,CD25歧视treg从画眉草在这个分析,从分子结构上表达了对前7 h激活期内但尚未引起在后者。

样本用流式细胞术在BD LSR II (BD生物科学)按照公司的建议。T细胞激活是评估两个效应T细胞(苔麸)人群,CD25⁻CD3⁺CD4⁺辅助T细胞CD25⁻CD3⁺CD4⁻主要是CD8细胞⁺T细胞,因此在本文称为细胞毒性T细胞。增加CD4的抑制能力⁺CD25^+高CD127^−/暗亚被确定为抑制CD69画眉草种群和CD154表达。

2.2。动物研究

2.2.1。动物

动物实验都是经当地政府批准(Landesamt皮毛Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit和Fischerei (LALLF) Mecklenburg-Vorpommern)。DEREG(调节性T细胞耗竭)小鼠饲养在动物设施(Zentrale服务——和Forschungseinrichtung毛皮Versuchstiere (ZSFV),格赖夫斯瓦尔德)。DEREG老鼠携带DTR-eGFP (DTR:白喉毒素受体,GFP:绿色荧光蛋白)转基因额外FoxP3启动子的控制下允许Treg损耗由低剂量注射白喉毒素(25]。在这里,我们只利用eGFP的表达Treg识别的子集,没有耗尽Treg细胞。

2.2.2。缺血模型

不同年龄的男性未用尽的DEREG老鼠(8-46周)接受左使用灯丝MCAO模型。麻醉诱导2.5%异氟烷和70% N₂O / O 30%₂和保持在2%异氟烷和70% N₂O / O 30%₂在手术过程中。体温测量直肠探头和维护使用回馈控制加热垫的体温37°C±0.5°C。简单地说,颈总动脉和颈外动脉解剖和结扎。silicon-coated丝(美国马Doccol公司)被引入颈总动脉和先进到颈内动脉到大脑中动脉的起源。缺血诱导的手术时间不超过15分钟。灯丝被撤回后45分钟闭塞时间。体重和体温测量根据协议。

2.2.3。鼠标核磁共振

7 t-animal MRI (ClinScan力量Biospin, Ettlingen,德国)小鼠麻醉与1 - 2%异氟烷和1 L / min氧气。在脑部扫描呼吸监测和动物使用外部水浴保暖。在MCAO后第一天为脑部扫描3 d-t2加权成像(老鼠大脑线圈,TR = 2000毫秒,TE = 37女士,FoV 19×25毫米,厚度0.45毫米)和额外的扩散加权成像的可视化进行了急性梗塞。评估大脑核磁共振T2病灶体积的数据分析两个独立的调查人员对损伤位置和大小。手动选择感兴趣的区域,体积计算半自动地使用OsiriX软件。

2.2.4。流式细胞术在小鼠Treg CD39表达

CD39表达式确定FoxP3表达Treg天真的(8-48周大)和抚摸未用尽的DEREG老鼠。瞬态MCAO被描述过。与天真的老鼠,在d3中风后直接从心脏和血液被撤回实际上与EDTA。脾脏被收集后transcardial与冰冷的0.9%生理盐水灌注深麻醉老鼠。在同质化和低渗的裂解红细胞,单个细胞悬液用于流仪分析CD39 CD4的表达⁺FoxP3⁺Treg。不必要的Fc受体染色最初被孵化的细胞悬浊液TruStainFcX13 (anti-mouse CD16/32, BioLegend,圣地亚哥,美国)。亚被anti-CD4-Brilliant紫605抗体(BioLegend、圣地亚哥、钙、美国)的转基因表达eGFP FoxP3催化剂的控制。CD39 CD4细胞表面表达决心⁺FoxP3⁺淋巴细胞被染色的CD39 anti-CD39-PE抗体(BioLegend)及其同形像控制IgG2a PE (BioLegend、圣地亚哥、钙、美国)。流式细胞术进行LSRII正欲。数据分析使用FlowJo(树明星Inc .,或者,美国)。

2.3。统计分析

所有数据集进行测试与Kolmogorov-Smirnov偏离高斯分布测试。通过了测试的数据分析重复测量方差分析(方差分析),与Bonferroni多重比较检验作为后续测试。因为有些数据在每一个在体外实验失败了正常测试,我们使用非参数测试。克鲁斯卡尔-沃利斯检验,邓恩的多重比较测试作为后续测试,作为适当的。后续测试只有执行,如果初始测试显示团体之间的显著差异。相关性是由皮尔森相关分析。测试执行95%的置信区间(正反)。所有与软件分析进行GraphPad-PRISM 5.0 (GraphPad软件公司,圣地亚哥、钙、美国)。一个值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。CD39表情treg随着年龄的增加

因为它是不知道年龄如何影响亚群的CD39子集,我们决定CD49 CD39的年龄相关的表达式⁻FoxP3⁺亚群。在我们的人口比例的CD4细胞的亚群⁺T细胞没有显著变化,而CD45RA表达天真的亚群的比例随年龄下降(;)(补充图S1)网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2974605)。随着年龄的增加(CD39表达式;)(图1(一))。

3.2。亚群减少中风患者的外周血

流仪分析证实了很好的描述损失中风患者的外周血淋巴细胞,这是非常重要的在所有天()。CD4细胞的比例⁺总淋巴细胞T细胞没有明显改变在这个中风病人群,表明CD4细胞⁺T细胞是迷失在一个类似从外周血CD4数量⁻淋巴细胞(图2)。亚群,占5.0%(中位数)CD4(范围1.3 - -10.2%)⁺T细胞在健康对照组,中风患者减少至2.8%(中位数)(范围0.03 - -8.1%)承认,仍低于控制值,直到第七天()。这是由于CD39的丧失⁺激活亚(),达到至少1.2%(中位数)CD4(范围0.2 - -7.1%)⁺在5天的T细胞。天真的亚群,表达CD45RA(图基本上保持不变2 (c))。在控制,92.1%的值(范围71.0 - -98.3%)亚群CD25表达激活标志。在中风患者,CD25表达没有明显改变()(补充图S2A)。

我们也评估CD4的百分比⁺CD25⁺在中风患者细胞,这是以前作为亚群的标记;然而,激活T细胞也上调CD25细胞表面。中风患者(平均30.4%)CD4(范围4.2 - -71.6%)⁺CD25⁺细胞承认,当天并没有明显的区别于控制价值41.2%(中位数)(范围5.1 - -73.7%)()(补充图开通)。

没有看到当我们相比差异Treg两性之间的人群。没有健壮的亚群比例和他们的亚种群之间的相关性对神经赤字或中风的大小。

3.3。年龄依赖CD39监管⁺Treg在老鼠身上

使用nondepleted DEREG动物的GFP表达FoxP3⁺Treg被用来量化外周血Treg。在老年小鼠的比例CD39表达Treg增加而年轻的成年老鼠(图1 (b))。感应瞬态灯丝MCAO的脑缺血导致类似的梗塞大小年轻和老年小鼠(图3(一个))。然而CD39表达式在SIIA Treg年轻和年老动物之间的不同。CD39表达Treg没有影响在年轻小鼠衰老相关CD39表达增加外周血被MCAO逆转老化小鼠(图3 (b))。

3.4。在中风患者Treg功能受损

Treg函数量化的抑制activation-induced upregulation CD69和CD154苔麸的表面。我们因此而激活标志表情辅助T细胞和细胞毒性T细胞来源于中风患者和控制。直接体外从中风患者辅助T细胞表达CD69的表面()控制相比,而CD154表达组(之间没有差别)(数据未显示)。没有区别CD69的表达或CD154从控制与中风患者细胞毒性T细胞(CD69,CD154的,)。在CD3 / CD28激活在体外,没有CD69的差异或CD4 CD154表达在细胞表面⁺T细胞、CD8⁺T细胞被认为在中风患者和控制(数据未显示)。

Treg-mediated抑制辅助T细胞活化在中风患者受损。的比1:2和1:1亚群:PBMCs,抑制CD4 CD154表达⁺效应细胞减少中风患者与健康对照组()(图4 (b))。抑制early-activation标记CD69的T辅助细胞仍然没有改变(图4(一))。在细胞毒性T细胞亚群的影响并没有改变在中风患者(数字4 (c)和4 (d))。

因为燕等人发现任何改变在Treg的脑中风患者整个住院感染仍然是免费的,我们再分析数据根据感染状况19,26]。如图5中风的影响总Treg和子集在患者更加明显,继续开发赛期间住院治疗。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现减少数字和受损的功能亚群的中风患者的外周血。亚群的减少中风是可以在入学后,通过第五天仍具有统计学意义。这减少亚群并不是均匀地分布在所有FoxP3⁺Treg子集CD39但最为明显活跃⁺Treg人口。

Treg-mediated画眉草抑制的有效性在中风患者同意报告燕et al .,谁发现了相似的抑制使用扩散作为读出(19,26]。然而,拥抱等人无法检测的研究改变Treg函数在中风患者5]。在之前的研究中,没有获得的剂量反应曲线和抑制测量使用亚群和画眉草的控制个人只有10%。因此,测定的条件选择拥抱等人可能没有足够敏感检测Treg功能受损。我们应用一个分析基于激活T细胞应答标志表情而不是扩散。抑制的有效性CD154表达画眉草作为标记Treg抑制活动已经证明(27]。这种方法使我们能够区分Treg对CD4细胞的影响⁺和CD4⁻画眉草。

因为所有三个研究使用自体画眉草细胞应答细胞,增强抵抗苔麸Treg-mediated抑制不能排除。我们观察到主要亏损CD39表达亚群,代表功能活跃Treg子集,顺便还能转变Treg成分向幼稚的子集。因此,似是而非的Treg函数而不是画眉草在中风患者易感性受损。

数据证实了由李等最近的观察,发现一个百分比减少和抑制中风患者亚群的活动,和扩展他们的发现,证明CD39功能活跃⁺亚群主要是减少中风后(28]。此外,据我们所知,这是第一个研究解决激活的抑制细胞毒性画眉草在中风患者。与辅助T细胞的抑制受损,减少细胞毒性苔麸激活在中风患者并没有改变。

我们的定量结果,然而,被燕与两个报告et al .,谁发现FoxP3的增加⁺亚群中风后(19,26]。这些差异可能与中风有关人口招募;在我们的研究中所有患者大脑中动脉缺血和一个署≥6,而燕等人招募了所有缺血性中风患者,包括那些不太严重的影响。更重要的是,燕等人排除患有“急性卒中后感染。“既然知道stroke-induced免疫抑制患者更有可能发生在(2),这种方法可能会排除患者最严重stroke-induced免疫改变。在我们的研究中,我们也排除了住院患者感染的迹象;然而,随后的患者知道并不排除在外。评估是否可以占明显的矛盾,我们执行一个subanalysis比较患者和没有随后的感染。虽然没有达到统计学意义,亚似乎更强烈降低患者没有赛赛相比。这支持了我们的假设,不同的患者群体之间的看似矛盾的结果可能占我们的发现和数据报告的燕等。

这项研究的主要限制是我们的分析仅限于外周血和其他免疫隔间不容易访问的病人。因此我们不能排除活性亚群迁移到组织。我们的动物数据显示,年龄在老鼠的命运可以提供一个合适的模型来确定Treg子集后中风。免疫衰老已被证明也改变疾病的临床过程和影响Treg子集(29日- - - - - -31日]。我们扩展知识通过展示活动Treg人口在外周血随年龄增长循环。Treg的作用在调节SIIA仍然存在争议和实验模型之间的不同14- - - - - -18]。我们的数据表明,亚监管不同的免疫衰老期间,一个方面很少反映在当前实验中风模型。

5。结论

我们的数据表明,CD4细胞⁺CD49⁻Foxp3⁺亚群减少中风患者的外周血。在这些活动CD39⁺Treg子集是受影响最严重,发现镜像功能研究表明抑制中风病人活动派生Treg受损在体外。这些改变是否为二次免疫介导的脑损伤或减少Treg函数是否有利于中风还有待调查。Treg表达CD39的比例,随着年龄的增加,在成年和老年小鼠不同监管了重要考虑免疫衰老实验中风模型的设计。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Johanna Ruhnau Schulze Juliane同样做出了贡献。Antje Vogelgesang和亚历山大•Dressel同样做出了贡献。

确认

Antje Vogelgesang和亚历山大Dressel收到了来自欧盟的资金格兰特设想(fp7 - regpot - 2010之下,格兰特没有。264143)。Johanna Ruhnau和玛丽·海因里希由药格赖夫斯瓦尔德大学的格哈德•Domagk程序。Schulze Juliane由DFG GRK840/1-03研究生院。作者感谢斯蒂芬·克莱门斯博士,医学格赖夫斯瓦尔德大学眼科学系提供患者将接受白内障手术。他们也感谢Jens库恩博士实验放射学、医学格赖夫斯瓦尔德大学的支持在动物磁共振成像设备。DEREG老鼠繁殖对成员去约亨•Huhn实验免疫学、亥姆霍兹感染研究中心布伦瑞克,和蒂姆•Sparwasser感染免疫学研究所TWINCORE,感染实验和临床研究中心之间的合资企业医学院汉诺威和亥姆霍兹感染研究中心的汉诺威。

补充材料