文摘

Sanguisorbae基数(SR)是众所周知的草药叫“Zi-Yu”在韩国,这是干的根源地榆officinalisl . (Rosacease)。我们调查了底层机制的抑制乙醇提取的特应性皮炎(AD)老(ESR)使用2,4-dinitrochlorobenzene - (DNCB)诱导的小鼠模型。口服的ESR显著抑制DNCB-induced广告等症状抓挠行为,耳朵厚度、表皮厚度、和IgE水平。调查的影响ESR治疗脱粒IgE / Ag-activated老鼠骨骨髓来源肥大细胞(BMMCs),我们测量的释放β己糖胺酶(β十六进制,脱粒标记)。ESR减少嗜酸性粒细胞和肥大细胞的渗透到广告皮肤损伤。此外,ESR显著地抑制IgE的脱粒/ Ag-activated BMMCs。我们已经表明,ESR减少广告在小鼠和抑制症状的IgE / Ag-activated肥大细胞脱粒。我们的研究表明ESR可能作为一种潜在的治疗候选广告症状的治疗。

1。介绍

特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤病。广告会导致表皮厚度与皮肤过敏症增加血清免疫球蛋白E (IgE)水平和浸润的炎症细胞类型包括肥大细胞和嗜酸性粒细胞1,2]。广告是一个复杂的交互基于个体的先天和适应性免疫反应的遗传、环境、药理、和心理条件。

IgE分泌是广告的一个重要特征,水平升高与AD患者的疾病严重程度有关。先前的研究报告,高血清IgE水平诱导激活肥大细胞和引起过敏反应2,3]。因为肥大细胞聚合的高亲和性IgE受体(FcεRI)的表面,这是重要的促炎/过敏反应,肥大细胞被认为发挥重要作用在广告的诱导4,5]。肥大细胞激活和广告之间的联系是由肥大细胞数量的增加和激活在AD病变(6]。此外,肥大细胞产生炎症介质如前列腺素D2(PGD2),引起嗜酸性粒细胞趋化性炎症网站在AD患者的皮肤7]。

Sanguisorbae基数(SR)是众所周知的草药叫“Zi-Yu”在韩国,这是干的根源地榆officinalisl . (Rosacease) [8]。SR已经被用来作为传统草药治疗腹泻、肠道感染、慢性十二指肠溃疡,内出血,烧伤8- - - - - -10]。SR包括皂素苷和鞣花单宁(即。,pomolic acid, sanguisorbic acid dilactone, and ziyuglycoside I). SR and its active components have been demonstrated to have biological activity在活的有机体内和在体外。SR可以抑制肾脏功能障碍引起的脂多糖(LPS)内毒素在活的有机体内通过抑制亚硝酸盐/硝酸盐含量和血清诱导一氧化氮合酶的活性(间接宾语)11]。此外,据报道,老抗氧化应激和抗衰老的活动通过抑制一氧化氮(NO)的生产和活动伊诺(10,12,13]。老了H2O2全身的ROS生成在体外和MCAO-induced缺血性脑损伤在活的有机体内(14]。额外的报道SR的属性包括抗癌(15],antiasthma [16],anticoronavirus [17),和抗皱活动(18]。许多研究人员报道老抗炎活动尽管如此,antiatopic皮炎SR不报道的影响。最近,研究报道抑制SR对接触性皮炎的影响(19),我们报道的抗炎机制ESR人类角化细胞通过抑制TNF的表达α/干扰素-γ刺激趋化因子和促炎的分子通过封锁NF -κB、STAT-1和ERK激活。然而,老的生物和药理行动并不完全了解过敏性皮炎。

在这项研究中,我们调查了ESR对2的影响,4-dinitrochlorobenzene - (DNCB)诱导小鼠皮肤损伤和鼠标骨骨髓来源肥大细胞(BMMCs)来确定其治疗AD的治疗潜力。

2。材料和方法

2.1。ESR的准备

索尔根取自Yeongcheon东方草药市场(Yeongcheon、韩国)。所有样品都存入银行草药公里应用中心,东方医学研究所(KIOM;韩国大田市)。准备ESR、老干件(50.0 g)提取使用390毫升70%的乙醇在40°C摇晃孵化器24 h。我们获得了9.5 g,给我们一个收益率为19.1%。

2.2。动物

雄性BALB / c小鼠(5周)从Samtako购买生物朝鲜(韩国乌山)。老鼠每天观察一周在隔离和适应。老鼠被分为六组( 每组):(1)负控制(车辆),(2)DNCB +车辆(控制),(3)DNCB + 50毫克/公斤ESR, (4) DNCB + 100毫克/公斤ESR, (5) DNCB + 200毫克/公斤ESR,(6)和1毫克/公斤地塞米松(用)。所有组织都保持在标准条件下的温度( °C)、湿度( %),12 h照明(8:00 AM-8:00点,290 lx)、通风(每小时10 - 15倍),和饮食(Teklad全球饮食,哈伦实验室Inc .)、美国)。本研究根据指南中列出的药品进行事务的韩国食品和药物协会(KFDA)和机构的动物保健和使用委员会批准韩国合格实验室(ia11 - 00920)。

2.3。感应的广告和药物治疗

经过1周的适应,DNCB应用于背侧皮肤和双耳BALB / c小鼠诱导广告症状和皮肤损伤。完整的背脱毛后的一天,200人μL 1% DNCB溶解在丙酮:橄榄油的混合物(3:1卷/期)是应用于背侧皮肤和20μL应用于双耳(2 - 4天)。五天背脱毛后,0.2 - -0.8% DNCB溶解在丙酮:橄榄油的混合物(3:1卷/期)是应用于挑战背侧皮肤(200μL)和双耳(20μL) 2周的每周两次。同样,1% DNCB解决方案应用之前一天牺牲。ESR溶解在盐水(10毫升/公斤体重)是由口头填喂法在50岁,100和200毫克/公斤或使用地塞米松(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国;1毫克/公斤)每周3次为4周(天0-24)。实验方案图进行了总结1(一)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
影响ESR DNCB-induced广告鼠标的发展在BALB / c小鼠皮肤损伤。(一)实验安排的感应性皮炎。(b)的影响ESR DNCB-induced广告皮肤损伤的临床特征。车,消极的控制;控制,DNCB +车辆;ESR, DNCB + ESR治疗组(100和200毫克/公斤);用。,DNCB + 1 mg/kg dexamethasone treated group.
2.4。抓挠行为和耳朵厚度测量

抓挠行为是衡量将每个鼠标放到笼子里一周一次10分钟,观察和记录的行为(20.]。对于每一个鼠标,耳朵厚度测量和记录千分尺(三丰公司、川崎、日本)。减少变异,一个调查员进行测量(21]。

2.5。组织病理学分析

在研究结束的时期,每个鼠标被移除的背侧皮肤损伤,与neutral-buffered 10%福尔马林固定,石蜡的嵌入。4μ米厚的部分被苏木精和伊红染色())和甲苯胺蓝检测表皮厚度和炎症细胞(即。分别,嗜酸性粒细胞和肥大细胞)。皮肤组织病理学评估的部分发生在盲目的方式(1]。所有样本都使用一个倒置显微镜观察和数据代表五个观测(Eclipse Ti尼康,尼康,东京,日本)。

2.6。血清IgE测量

在研究结束的时期,老鼠牺牲和全血收集。血样离心机在2000 g×20分钟在4°C。血清从全血储存在−80°C到使用。血清IgE水平测量使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒根据制造商的指示(BioLegend、圣地亚哥、钙、美国)。抑制性的影响ESR基于吸光度的测定在450纳米测量使用multilabel标(SpectraMax i3、分子设备、硅谷、钙、美国)。

2.7。BMMCs

BMMCs隔绝雄性BALB / c小鼠培养10周rpmi - 1640年媒体包含谷酰胺2毫米,0.1毫米不必要的氨基酸、抗生素,10%胎牛血清(的边后卫)与20%美洲商陆mitogen-stimulated脾条件培养基(PWM-SCM)作为interleukin-3来源(IL-3)。3周后,98%以上的细胞被证实为BMMCs按照先前描述的程序(22]。

2.8。细胞生存能力分析

用细胞计数细胞细胞毒性分析工具(CCK) (Dojindo分子技术,Inc .,熊本,日本)。BMMCs (2×105细胞/)被播种到96孔板。24小时后,ESR添加浓度的10,五十,100,200μg / mL,和盘子被孵化24小时37°C的5%的股份有限公司2孵化器。CCK解决方案添加到每个细胞孵化1 h。光密度测量在570 nm使用ELISA板读者(M200无限,Tecan、Mannedorf、瑞士)。

2.9。β十六进制释放试验

β己糖胺酶(β十六进制),肥大细胞脱颗粒的标记,被水解的光度分析量化p-nitrophenyl-2-acetamido-2-deoxy -β-D-glucopyranoside (4-Nitrophenyl n -乙酰-β-D-glucosaminide (p-NAG) Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。

细胞刺激,BMMCs (5×105细胞/毫升)敏化一夜之间有100 ng / mL anti-dinitrophenyl (DNP)抗体,然后刺激15分钟25 ng / mL DNP-human血清白蛋白(HSA)。调查的影响ESR, ESR添加不同浓度的1 h添加DNP-HSA之前。收获后上层清液按照先前描述的程序(23)的百分比β十六进制释放到上清液使用以下公式计算:[上层清液/(上层清液+颗粒)]×100。

2.10。统计分析

数据分析使用GraphPad棱镜软件(版本。美国5.0 GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。结果表示为平均值±标准平均误差(SEM)和学生的评价t以及或方差分析(方差分析)。一个 小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。ESR对DNCB-Induced广告鼠标皮肤损伤的发展

调查ESR广告鼠标病变的治疗效果,我们管理的ESR广告诱导后鼠标使用DNCB皮肤损伤。局部应用DNCB-induced结壳、表皮厚度、发红,干燥的皮肤在图所示1 (b)。然而,皮肤状况显著改善ESR-administered组与对照组相比。

3.2。ESR的影响在广告老鼠抓挠行为和耳朵厚度

抓挠行为控制集团的迅速增加,成为显著不同,观察车辆组DNCB应用后14天。广告小鼠接受200毫克/公斤ESR,抓抑制强烈相比汽车集团(图2(一个))。此外,ESR显著降低DNCB-induced耳朵厚度剂量依赖性的方式。这些结果表明ESR有治疗效果,可以减少广告对小鼠症状。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
ESR对抓挠行为和耳厚度的影响在广告鼠标皮肤损伤。(一)实验诱导小鼠皮肤损伤广告。(b)耳朵厚度测量拨测厚仪。结果表示为平均值±标准平均误差(SEM) ( )。车,消极的控制;控制,DNCB +车辆;ESR、ESR DNCB + 200毫克/公斤;用。,DNCB + 1 mg/kg dexamethasone treated group. , , 与车辆; 和 与控制。
3.3。ESR对背侧皮肤厚度和嗜酸性粒细胞聚集的影响在广告鼠标皮肤损伤

多个应用程序的DNCB-induced高水平的炎症细胞浸润到皮肤增加皮肤厚度(24]。确定ESR治疗嗜酸性粒细胞减少积累广告鼠标皮肤损伤,我们执行)染色后在皮肤上口服的ESR和光学显微镜下观察组织。背组织病理学结果显示表皮增厚和嗜酸性粒细胞的背侧皮肤损伤积累BALB / c小鼠广告。100和200毫克/公斤ESR的治疗抑制嗜酸性粒细胞积累和背侧皮肤厚度减少剂量依赖性的方式(数字3(一个)和3 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
ESR对表皮厚度的影响和嗜酸性粒细胞积累DNCB-induced广告鼠标皮肤损伤。(a))彩色广告鼠标皮肤损伤(20 x,比例尺= 100μ米)和图像放大部分(右集团的形象,比例尺= 20μ米),(b)表皮厚度的确定。(c)每毫米的嗜酸性粒细胞数量部分。表皮厚度)彩色部分是在显微镜下测量和嗜酸性粒细胞的数量积累表示为100年的平均总数量在五个领域μ米2。 与控制。
3.4。ESR对肥大细胞的影响渗透和AD小鼠的血清IgE水平

血清IgE水平升高和肥大细胞浸润是广告的主要特点和疾病严重程度相关24]。评估的影响ESR肥大细胞浸润,我们染色切片横截面与甲苯胺蓝皮肤损伤。如图4,我们发现肥大细胞浸润(增加数据4(一)和4 (b))和IgE水平DNCB-treated老鼠相比汽车组(图4 (c))。然而,ESR显著的IgE水平升高降低了DNCB诱导和抑制肥大细胞浸润,剂量依赖性的方式(数字4 (b)和4 (c))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图4
ESR对肥大细胞的影响渗透和血清IgE水平DNCB-induced广告鼠标病变。(一)甲苯胺蓝染色广告鼠标皮肤损伤(20 x,比例尺= 100μ米)和图像放大部分(右集团的形象,比例尺= 20μ米)。(b)每毫米的肥大细胞数量部分。肥大细胞浸润在甲苯胺蓝染色部分表示为100年的平均总数量在五个领域μ米2。 , 与控制。
3.5。ESR对BMMC细胞毒性和肥大细胞脱颗粒的影响

肥大细胞脱粒是与广告严重程度和免疫细胞炎症网站的招聘广告患者(2]。调查的影响ESR治疗脱粒IgE / Ag-activated BMMCs,我们测量的释放β十六进制的ESR的存在与否。如图5 (b),ESR强有力地减少β十六进制释放剂量依赖性的方式。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
ESR对细胞毒性的影响,在BMMCs肥大细胞脱颗粒。(a)的细胞毒性BMMCs决心使用CCK化验。BMMCs被播种到96孔板和处理各种浓度的ESR 24 h。ESR (b)抑制的影响β十六进制在BMMCs发布。一夜之间,BMMCs被致敏anti-DNP IgE,挑战DNP-HAS有或没有ESR (Ag)。并给出了数据作为三个独立的均值±SEM实验。 与控制。

BMMCs检查ESR的细胞毒性,细胞被孵化与不同浓度ESR(10、50、100和200μ18 h和g / mL)受到CCK-8化验。ESR在200μg / mL没有明显细胞毒性影响BMMCs后24 h(图5(一个))。

4所示。讨论

广告是一种炎症性疾病,其特征是增加了细胞与Th2反应有关,包括单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞。AD的发病机制主要是由Th2免疫反应和增加IgE生产(5]。增殖、迁移和本地激活嗜酸性粒细胞是常见的广告。嗜酸性粒细胞作为免疫调节因子通过分泌多种细胞因子和趋化因子的网站吸引更多的嗜酸性粒细胞炎症。此外,嗜酸性粒细胞推动开关从急性慢性反应广告2]。ESR治疗减少嗜酸性粒细胞聚集在AD小鼠皮肤损伤(数字3(一个)和3 (c))。

高水平的血清IgE代表另一个广告的特点;因此,很可能针对IgE疾病可能会影响广告的结果。具体来说,IgE绑定到肥大细胞影响广告的发展和严重性(21]。肥大细胞扮演着一个关键角色,过敏反应通过生产和分泌的促炎介质如组胺、趋化因子、细胞因子和生长因子。肥大细胞表面,Th2细胞产生IgE, Fc的结合ε国际扶轮肥大细胞表面(25]。足球俱乐部εRI-mediated肥大细胞激活是由抗原IgE交联并导致促炎介质的脱粒和表达。足球俱乐部εRI-activated肥大细胞诱导IgE高程和增加肥大细胞在大多数广告病人;因此,肥大细胞是假设为AD的发病机制(3]。我们的研究结果表明ESR治疗抑制血清IgE水平和肥大细胞浸润DNCB-induced AD小鼠模型。

β十六进制,脱粒标记,释放以及其他促炎介质当肥大细胞被激活(23,26]。因此,我们调查了脱粒通过测量β十六进制在抗原IgE-activated BMMCs和证实,ESR治疗抑制β十六进制释放剂量依赖性的方式。

老的活性成分包括酚类化合物包括单宁和类黄酮,皂素苷,鞣花单宁(即。,pomolic酸,sanguisorbic酸双内酯,ziyuglycoside我)27]。Ziyuglycoside我和Ziyuglycoside II的主要有效成分是三萜皂甙提取地榆officinalisl,和米any studies have focused on their pharmacological activities. In addition, ziyuglycoside I is a major marker of SR to confirm the origin of the medicinal plant in Korean Pharmacopoeia. Thus, we used ziyuglycoside I as a phytochemical marker of SR in the experiment (data not shown).

在这项研究中,我们调查了ESR治疗疗效的广告使用小鼠模型和BMMCs DNCB-induced广告。ESR显著提高抓挠行为,耳朵厚度、表皮厚度、和DNCB-induced AD小鼠的血清IgE水平。我们观察到的减少嗜酸性粒细胞和肥大细胞的渗透到广告ESR治疗后皮肤损伤。此外,ESR显著地抑制IgE的脱粒/ Ag-activated BMMCs。ESR治疗的治疗效果在广告支持的有益作用ige疗法的临床研究[2,3]。

总之,这些结果表明ESR减少广告在小鼠和抑制症状的IgE / Ag-activated肥大细胞脱粒。我们的研究表明ESR可能作为一种潜在的治疗治疗AD的候选人。

缩写

ESR: 乙醇提取Sanguisorbae基数
广告: 特应性皮炎
DNCB: 2,4-Dinitrochlorobenzene
): 苏木精和伊红
足球俱乐部ε国际扶轮: 高亲和性免疫球蛋白E受体
BMMCs: 老鼠骨骨髓来源肥大细胞
β十六进制: β己糖胺酶。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

杨Ju-Hye设计研究,进行了研究,并写论文;Jae-Myung Yoo参与实验;马Won-Kyung曹和金Yeul监督这项研究。

确认

这项工作是支持的批准号K16281授予东方医学研究所(KIOM)从教育部科学技术(最高明的),韩国。