文摘

白介素17 (IL-17)是一种细胞因子与一些炎性疾病相关的多效性的影响。尽管水平升高IL-17炎性肌病中描述,它的作用在肌肉重建和再生仍是未知的。过度在骨骼肌细胞外基质降解是许多疾病的一个重要病理结果包括肌肉萎缩。在这项研究中,IL-17的角色的表达基质金属蛋白酶- 9 (MMP)在成肌细胞的细胞研究。的表达MMP-9 IL-17治疗后分析了在小鼠成肌细胞C2C12细胞线。IL-17 MMP-9产量的增加是伴随其能力抑制肌原性的C2C12细胞的分化。强力霉素(情妇)治疗保护IL-17抑制肌母细胞的肌原性的能力,此外,增加肌管肥大。淫妇阻塞的能力IL-17刺激MMP-9生产通过调节IL-17-induced ERK1/2 MAPK激活。我们的研究结果暗示MMP-9介导IL-17抑制成肌细胞分化的能力在炎性疾病和表明,宗教教义可以调节成肌细胞炎症反应通过IL-17感应。

1。介绍

白介素17 (IL-17)家族细胞因子近年来一直在深入调查。促炎细胞因子,IL-17参与免疫防御机制通过感应二次炎症介质。然而,它的含义在不同的人类炎性疾病如风湿性关节炎和肌肉发炎也证明(1- - - - - -3]。

大量的数据证实IL-17的多效性的性质。其受体(IL-17R)是广泛表达,在几乎所有的细胞类型,允许广泛IL-17对细胞过程的影响,通过后续激活许多信号转导途径,如蛋白激酶,JAK / STAT, NF -κB, MAPKs,包括ERK1/2和p38瀑布(4,5]。

促炎细胞因子被认为是骨骼肌损失的重要介质在各种慢性疾病6]。已知与炎性疾病的发展,有关IL-17还涉及肌肉疾病,如多发性肌炎和皮肌炎7,8]。然而,它在肌肉修复或再生中的作用尚未阐明。骨骼肌修复取决于卫星细胞原位。这些细胞有增殖能力,迁移到受伤的网站,和成人肌肉细胞分化成9]。在这个过程中,细胞外基质(ECM)是动态和精心改造,而ECM重组的失衡可以参与肌肉疾病的发展10]。基质金属蛋白酶(MMPs)是一个家庭的酶,可以选择性地消化ECM的单个组件10,11]。一些基质金属蛋白酶是涉及肌肉再生,包括基质金属蛋白酶2型(MMP-2)和基质金属蛋白酶9 (MMP-9)类型。在骨骼肌,MMP-2既定的表达,而MMP-9显示没有最小基底表达式(10,11]。特别是MMP-9表达和/或活动是紧密转录监管和高度诱导各种代理,包括促炎细胞因子(12]。此外,增加表达和激活MMP-9与各种相关肌病inflammation-induced骨骼肌的变化(10]。此外,upregulation MMP-9表达被描述在mdx老鼠的肌肉,杜氏肌萎缩症的动物模型(13]。尽管高表达IL-17和MMP-9据报道在炎性肌病,这些肌肉中蛋白质的相互关系仍不清楚。

强力霉素(情妇)是一种抗生素药物和四环素的已被测试在众多条件与MMP活性升高(14]。它最近被证明宗教教义可以有利于mdx老鼠主要通过减少MMP-9和TNF -α表达式[15]。也证明了宗教教义或anti-MMP-9抗体提高比目鱼肌再生和改善发展过度纤维化(16]。此外,最近的研究表明,淫妇治疗可以调节局部和全身炎症,建议其重要性在炎性肌病(17,18]。我们最近证明了IL-17抑制肌细胞生成的能力在体外(19),而MMP-9参与以及宗教教义的监管作用在这个过程中到目前为止还没有被很好地定义。

我们的发现表明IL-17增加MMP-9表达式,以及抑制C2C12成肌细胞分化。此外,这里给出的结果表明,宗教教义保护C2C12成肌细胞的能力IL-17抑制肌细胞生成。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

成肌细胞C2C12细胞线从美国购买类型文化集合(写明ATCC,罗克维尔市,MD)。细胞在生长培养基培养(GM)组成的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清(的边后卫)摩羯座科学100单位/毫升(Ebsdorfergrund、德国)和青霉素和链霉素0.1毫克/毫升(摩羯座科学)在湿润环境中37°C和5%的公司₂在空气中。肌原性的分化是由培养诱导融合性的细胞肌原性的分化培养基(MDM)组成的通用补充2%马血清代替10%的边后卫。

重组小鼠IL-17由研发提供系统(明尼阿波利斯,美国)。强力霉素是从Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。得到MEK1 2抑制剂PD98059 Calbiochem(达姆施塔特,德国)和用于25μM。

2.2。Zymography化验

MMP-9 MMP-2活动如前所述检查(20.]。简单地说,50.000细胞/一夜之间被播种在24-well盘子和培养;然后,这些细胞被洗了三次与PBS和0.5毫升的无血清培养基补充道。随后细胞培养有或没有IL-17作为每个实验表明。在诱导肌原性的分化,细胞培养三天在MDM和额外的24 h为MMP-9生成条件无血清培养基的决心。蛋白质浓度在媒体条件由BCA决定分析宏观工具包(美国赛瓦、海德堡、德国)根据制造商的指示。整除的蛋白质标准化条件媒体受到8% sds - page nonreducing条件下含0.1%明胶。凝胶与2.5% Triton x - 100和洗两次漂洗一次蒸馏H₂o .凝胶被孵化24小时在100毫米Tris-HCl CaCl pH值8.5,10毫米₂。基质金属蛋白酶的活性被染色的凝胶停止Coomassie蓝色R250 50%甲醇和10%醋酸20分钟。Zymography是由使脱色凝胶20%甲醇和5%醋酸直到透明带是可视化。量化这些地区是由使用NIH-Image J微密度分析软件。

2.3。肌管肥大指数

C2C12细胞生长在24-well盘子,直到达到90%汇合,然后受到肌原性的分化与MDM取代通用汽车。细胞培养4天的治疗。单层细胞被洗两次与PBS和固定冰冷的甲醇为2分钟,然后用结晶紫染色(0.1%)15分钟,并广泛用自来水洗净。这强烈彩色肌管和细胞核内。确定肥大指数,肌小管直径确定根据叶et al。21]。培养细胞拍摄使用10倍物镜和NIH-Image J软件是用来测量肌小管直径。至少50肌管被用来确定直径和3极震区沿着给定的长度测量肌小管直径和平均计算。

2.4。免疫印迹分析

免疫印迹分析蛋白表达进行了分析。肌凝蛋白重链抗体(MyHC) phospho-ERK1/2 (sc - 7383),和ERK1 (sc - 94)购买的圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。鼠单克隆抗体anti-HA卡梅隆博士提供的是善良的伯纳乌(CIB、西班牙)。细胞细胞溶解在裂解缓冲(50毫米Tris-HCl, pH值7.5,150毫米氯化钠,NP-40 1%)包含2毫米EDTA, 50毫米氟化钠,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国赛瓦电泳GmbH,海德堡,德国)。等量的蛋白质从每个样本被sds - page分离和转移到硝化纤维素膜(AppliChem,达姆施塔特,德国)。膜被封锁在TBS Tween-20 0.5% 4% BSA然后孵化主要抗体。膜被孵化与二次抗体结合合(Sigma-Aldrich)。标记蛋白是从AppliChem可视化使用增强化学发光试剂系统的。蛋白质乐队被微扫描量化,使用NIH-Image J软件并表示相对于微管蛋白或相应的总蛋白的信号。

2.5。rt - pcr

两个微克从C2C12细胞总RNA的孤立的使用上标2反向转录表达载体。PCR进行使用一步PCR(英杰公司)使用以下设置:94°C 5分钟,26 - 30日周期在94°C 45秒,52-54°C,持续30秒,并为90秒72°C。引物组、退火温度、周期、数量和产品尺寸为每个基因有补充表1(在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2939658)[22,23]。扩增子解决1.5%琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。乐队的强度量化使用NIH-Image J软件。

2.6。瞬时转染质粒,记者化验

包含1300个基点的记者构造pMMP-9-luc 50-flanking区域的鼠标MMP-9基因被先前描述(20.]。鼠标myogenin启动子(G133-luc)请提供Zhenguo Wu博士(香港科技大学,香港,中国)。G133-Luc及其衍生物被插入XbaI-BglII碎片从相应的生成氯霉素乙酰转移酶结构到HindIII-BglII-digested pXP2,分别为(24]。使用pSRE-Luc ERK1/2信号确定(请提供博士a . Corbi联会,马德里,西班牙),其中包含的两个副本c-fos行为(357−275核苷酸−,包含SRF结合位点和相邻Ets主题)最小Tk的上游启动子荧光素酶基因。PCMV -β牛乳糖表达载体是请提供的c·伯纳乌博士(CIB、西班牙)和用作积极控制转染效率。活跃起来从而显性负MEK1-HA标记构造是由雅克博士请提供Pouyssegur(大学Nice-Sophia Antipolis,法国)。MEK1持续活跃的突变(CA-MEK1)是由监管磷酸化的替换网站设计的,Ser218 Ser222,天冬氨酸(S218D / S222D突变)如前所述25]。pcDNA3.1空向量表达载体。

C2C12成肌细胞播种24-well板(细胞/)与不同的质粒转染使用Turbofect转染试剂根据制造商的协议(Fermentas,圣Leon-Rot,德国)。经过24小时的治疗,细胞细胞溶解和50μL被动裂解试剂和萤火虫荧光素酶活性(WI Promega,麦迪逊,美国)。β美国马牛乳糖活动(Tropix,贝德福德)测定作为内部控制转染效率。

2.7。统计分析

所有实验进行至少三次,代表结果显示。数据给出±SEM手段。统计学意义是评估使用单向方差分析其次是图基各个组之间的测试。差异被认为是重大的价值(),()之间的控制样品和样品处理。在价值观的差异被认为是重要的()之间IL-17-treated样品和强力霉素+ IL-17-treated样本。

3所示。结果

3.1。IL-17增加MMP-9生产成肌细胞的细胞

首先,我们检查IL-17能否调节MMP-9的表达和生产,一个主要的细胞外蛋白酶能降解基底膜和肌内结缔组织的几个组件26),在培养C2C12成肌细胞。C2C12细胞在无血清培养基培养越来越多的IL-17 24小时和文化生产MMP-9上层清液由明胶zymography测量。越来越多的治疗IL-17显著增强的活动MMP-9和增加MMP-9 mRNA水平(图1(一)),而它不产生可检测的变化MMP-2活动(补充图1 (a))。接下来,我们评估的影响的transactivation IL-17 MMP-9在C2C12细胞启动子。类似于zymography试验获得的结果和rt - pcr, IL-17 MMP-9-specific启动子的transactivation增加剂量依赖性的方式(图1 (b))。

3.2。MMP-9生产高度引起IL-17期间抑制C2C12肌原性的分化

确定IL-17影响MMP-9表达式在肌原性的分化,在IL-17 C2C12细胞诱导分化治疗三天后和MMP-9表达决心。提出了图2(一个)在通用和分化诱导下,MMP-9产量的增加和表达是注意到在应对IL-17治疗,由zymography和rt - pcr。此外,在C2C12分化诱导,IL-17抑制肌细胞生成标记的表达肌凝蛋白重链(MyHC)和肌肉肌酸激酶(MCK),分别由免疫印迹和rt - pcr(图2 (b)),这表明IL-17诱发MMP-9表达与抑制肌原性的C2C12细胞的分化。加强MMP-9并降低MCK表达式平行IL-17引起的肌小管萎缩,如补充图1 (b)所示。

3.3。强力霉素恢复肌生成抑制IL-17引起的

调制的MMP-9有利于改善骨骼肌再生在mdx老鼠12,16]。它已经证明了MMP抑制剂淫妇的MMP-9水平降低肱二头肌和隔膜的mdx老鼠15]。接下来,我们旨在阐明是否MMP-9调制的情妇可以保护C2C12细胞IL-17引起的肌细胞生成的抑制作用。淫妇的最佳浓度是设置为10μ克/毫升剂量依赖性实验后(数据没有显示)。淫妇(10μg / mL)改善肌细胞生成(图3(一个))通过生产更多的肥厚性肌管,由平均肌小管直径(2.45倍与细胞生长在MDM)。此外,淫妇保护肌管形成IL-17的存在,随着细胞肥大指数类似于控制。有趣的是,肌管似乎更短的IL-17比肌管形成没有IL-17治疗。淫妇的效果证实了阳性蛋白MyHC表达式。如图3 (b),MyHC高度表达的情妇在肌发生感应,同时,在IL-17面前,C2C12细胞表达MyHC只在MDM类似水平的细胞培养。此外,IL-17-induced MCK基因表达(图的镇压3 (c))是完全颠倒的情妇以及IL-17-induced镇压myogenin启动子(pG133-luc) transactivity(图3 (d))。

3.4。强力霉素抑制MMP-9 IL-17引起的

抑制MMP活性超出其能力,淫妇已被证实能抑制MMP-9蛋白表达(27]。接下来,我们决定情妇能否转录调节IL-17-induced MMP-9 C2C12细胞中表达。如图4(一)淫妇(5或10μg / mL)抑制基底MMP-9表达水平和能力IL-17增加MMP-9的分泌活动。这似乎是由于抑制转录调节、自淫妇也减少了启动子transactivation和MMP-9 mRNA表达诱导IL-17(数字4 (b)和4 (c))。此外,类似的情妇浓度没有明显修改MMP-2分泌活动(补充图1 (c))。

3.5。强力霉素抑制ERK1/2 MAPK激活IL-17引起的

后续实验解决了细胞内信号通路参与IL-17-induced MMP-9 C2C12细胞中表达。我们曾表明IL-17激活ERK1/2 C2C12细胞(19),为了澄清是否ERK1/2通路介导IL-17-induced MMP-9生产和表达式,C2C12细胞对IL-17 MEK1, 2抑制剂,PD98059和MMP-9蛋白mRNA表达测定。如图5(一个)、细胞与IL-17 MEK1 cotreatment 2抑制剂明显阻塞的增量MMP-9活动和mRNA表达IL-17引起的。

此外,IL-17-increased MMP-9-specific发起人transactivation极大地抑制了显性负(DN) MEK1启动子,虽然cotransfection MEK1与持续活跃,独立于IL-17,显著transactivated MMP-9启动子(图5 (b))。ERK1/2信号似乎是必要的和充分调解IL-17-induced MMP-9 C2C12细胞中表达。适当的表达的显性负和既定活动(Ca)突变体是暂时性的转染C2C12细胞的MEK1 anti-HA抗体(图证实了他们的反应5 (c))。它也表明,独立能力的抑制MMP的活动,淫妇抑制MAPK激活(27]。因为ERK1/2信号似乎IL-17的关键的MMP-9感应,我们决定是否淫妇IL-17影响这条通路的激活。如图5 (d)的能力IL-17诱导ERK1/2磷酸化在宗教教义的存在极大地抑制(5或10μg / mL)。这个结果平行transactivation这个信号的能力,自淫妇抑制的能力IL-17诱导的transactivation pSRE-luc记者(图5 (e)),从而表明情妇抑制IL-17-induced MMP-9通过下调ERK1/2信号转导。

4所示。讨论

骨骼肌修复是一个高度同步的过程涉及多种细胞和分子反应。炎症和再生之间的协调对有益的结果被认为是至关重要的肌肉损伤后的修复过程28,29日]。在这个过程中,骨骼肌细胞周围的细胞外基质有一个重要的角色在维持肌肉的结构,作为对肌纤维再生支架(10,30.]。因此,ECM重塑是重要的肌肉在正常和病理条件下维修。基质金属蛋白酶是关键球员骨骼肌ECM降解和再生10]。除了高水平的IL-17,高浓度的MMP-9也被观察到在骨骼肌炎性肌病(10]。然而,监管IL-17 MMP-9表达式的肌肉细胞尚未阐明。

在目前的工作,我们的结果表明,增加IL-17 MMP-9的表达式和生产C2C12小鼠成肌细胞细胞,虽然不显著影响既定表示MMP-2(图1和补充图)。表达MMP-2和MMP-9之前已经报道过在各种物种的细胞肌原性的共识的组成型表达MMP-2肌肉细胞和更有争议的MMP-9表达式(31日]。我们的结果使用C2C12细胞表明IL-17 MMP-9表达在转录和蛋白质含量增加。由于IL-17主要是促炎细胞因子,与先前的观察,这个结果在协议MMP-9表达式与炎症反应(10),以及MMP-9 upregulation在肌肉组织中似乎是一个常见的发现所有炎性肌病(31日]。此外,它是一致的丰富的证据,表明MMP-9基因表达,在很大程度上,严格监管在转录水平32]。此外,众所周知,促炎细胞因子能够激活肌肉卫星细胞,可能通过诱导MMP-9表达式(10]。

在肌原性的分化,基底MMP-9表达增加,其高表达IL-17的存在。这种效果是伴随着IL-17能力抑制肌原性的分化标记MCK的表达式,证明IL-17增强MMP-9表达与抑制肌原性的C2C12细胞的分化。可以推测慢性接触IL-17诱导MMP-9表达,可能会影响肌肉细胞的体内平衡,以及他们的ECM重塑,这可以导致肌肉炎症疾病的发展。在病理条件下,异常增加MMP-9表达式和活动可能产生过度退化的IV型胶原蛋白骨骼肌基底膜,在合作与其他基质金属蛋白酶可导致骨骼肌组织损失(10,33]。

强力霉素是最强有力的MMP抑制剂在美国食品和药物管理局/健康Canada-approved四环素,抑制MMP的活动在等离子体水平低于其抗菌效果[所需34,35]。此外,淫妇,除了它在蛋白质水解作用,具有生物角色炎症,血管生成,细胞凋亡,金属螯合离子电泳和骨代谢(36]。我们的研究结果表明,宗教教义可能救援在体外成肌细胞分化恢复IL-17抑制肌细胞生成和MMP-9归纳。此外,在myoblastic分化的诱导,淫妇似乎增加肌管质量,由肥厚性指数和MyHC表达式表示。有趣的是,尽管MMP-9抑制了改善比目鱼肌再生在活的有机体内据报道,Zimowska等人,宗教教义可能推迟C2C12分化在体外(16]。在上述研究中,作者用宗教教义在60的浓度μM是大约三倍的最高浓度利用这项研究(10μg / mL或22μ米),我们观察到5μ克/毫升(11μ米)足以诱发肌管肥大。这可能表明,淫妇浓度必须达到预期的效果,和更高的浓度可能影响肌细胞生成MMP-9过度抑制,也需要正常的肌原性的分化,MMP-9主要是分泌在十二阶段(10]。然而,在炎症过程中,增加MMP-9分泌可能干扰蛋白水解内稳态,从而削弱肌肉细胞分化,作为IL-17观察到这里。

如上所述,强力霉素也会影响不同的生物过程,可以用其来解释能力影响ERK1/2等激活细胞内信号的信号(27,37]。在这条线,IL-17显示触发许多信号转导途径,包括ERK1/2和p38 MAPKs [4]。按照我们以前的工作19),我们这里确认IL-17能够提高磷酸化的ERK1/2 C2C12细胞,我们还显示,这一途径是必不可少的IL-17 MMP-9表达式的感应。我们的研究结果表明,强力霉素强烈抑制IL-17-induced MMP-9表达和ERK1/2激活。此外,我们证实MEK1, 2-ERK1/2用化学抑制剂抑制PD98059恢复IL-17的抑制效应在C2C12肌原性的分化(19]。此外,PD98059增强C2成肌细胞细胞分化在体外(38),因此建议情妇救援C2C12肌原性的分化的表达下调IL-17 ERK1/2信号的激活增加MMP-9所必需的表达式。

有趣的是,IL-17并不影响分泌MMP-2 C2C12细胞的能力,和类似的结果是通过治疗细胞与淫妇(补充图),表明MMP-2不是一个目标基因为IL-17和淫妇。已经证明,在C2C12分化MMP-2表达主要是不变的,因为MMP-2由本构机制(这些细胞中表达39,40]。虽然在某些炎性肌病,如多肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎,MMP-2和MMP-9调节,平衡取决于疾病的类型和当地的各种因素的存在。在这方面,调节MMP-9在肌肉组织中似乎是一个常见的找到所有的炎性肌病,虽然MMP-2似乎影响程度较轻(31日]。这里给出结果,连同我们的以前公布的结果,这表明IL-17并不影响MMP-2表达式,同时抑制uPA在C2C12细胞的表达41),进一步确认复杂的角色,IL-17成肌细胞的蛋白水解酶的表达和活性。这表明MMP-9 / MMP-2不平衡可能是肌肉疾病的主要特征之一。因此,IL-17可能影响C2C12肌原性的分化增加MMP-9表达式,而情妇可以保护和保存MMP-9 / MMP-2平衡肌发生期间通过ERK1/2通过减少MMP-9表达式。值得注意的是,这将是探索感兴趣的基质金属蛋白酶之间的相对比例和组织基质金属蛋白酶抑制剂(TIPMs),因为没有可用的数据对这种模式的监管涉及IL-17肌肉炎症和再生过程中,虽然有一些报道关于他们共同监管在肌肉分化(40]。

最后,在杜氏肌肉营养不良症(DMD),主要的肌营养不良蛋白缺乏会导致一些继发性病理改变包括ECM崩溃,炎症和纤维化,所有这些需要MMP的活动。除了显示MMP-9增强卫星细胞的增殖抑制和免疫细胞环境变化以及表达重要的配体,受体和信号通路,这一组显示,抑制MMP-9大大提高了移植小鼠骨骼肌成肌细胞移植的mdx (DMD)的小鼠模型42]。与我们的结果,这个发现增加价值的重要性MMP-9肌肉再生和建议这种酶作为一种可能的目标肌肉再生和修复。

然而,IL-17 MMP-9的规定生产的影响在成肌细胞细胞及其与生理事件和/或病理条件以及强力霉素抑制IL-17-induced MMP-9表达式应该另外进一步确诊在活的有机体内研究,这将有助于确定其在肌肉疾病和再生中的作用。

5。结论

我们的数据提供了证据表明,强力霉素抑制的能力IL-17诱导MMP-9表达成肌细胞细胞通过调节ERK1/2的激活与保护能力C2C12成肌细胞细胞的抑制作用IL-17对肌原性的分化。强力霉素的规定IL-17-induced MMP-9表达可能是有用的控制蛋白水解在肌肉再生和肌肉炎症状态。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的批准号175062年教育部和科学的塞尔维亚共和国。

补充材料