文摘

寄生虫属的利什曼虫能够抑制巨噬细胞的效应功能。这些寄生虫逃避宿主防御发展自适应能力;例如,他们在NF -灭活κB复杂和抑制伊诺表达式在被感染的巨噬细胞,负责生产的主要antileishmanial物质一氧化氮(NO),支持它的复制和成功的感染。没有研究了金属配合物作为潜在的治疗某些热带疾病,如钌化合物,已知外生没有捐赠者。在目前的工作,这种化合物独联体——[俄文(bpy)₂所以₃(NO)] PF₆或RuNO显示leishmanicidal活动直接或间接promastigote形式的利什曼虫amazonensis(利什曼虫)。此外,治疗RuNO生产增加了扭转不造成的损耗利什曼虫。我们还发现了一种蛋白激酶的表达增加,进气阀打开,NF -κB在被感染的巨噬细胞和治疗。这些结果表明RuNO能够杀死的寄生虫没有释放,调节细胞的转录能力。

1。介绍

美国皮肤利什曼病(ACL)是一种流行疾病在巴西,原生动物的病原体利什曼虫braziliensis (Viannia)和利什曼虫amazonensis(利什曼虫)。ACL有几个临床形式:本地化、传播或弥漫性皮肤损伤和积极的和伤残黏膜与皮肤的伤口1];表现取决于不仅寄生虫的种类,而且宿主的免疫反应(2]。

ACL的推荐治疗是使用五价锑的如钠stibogluconate (Pentostam®)和methylglucamine antimoniate (Glucantime®) (3]。然而,治疗有一些副作用,如恶心、呕吐、肝毒性,导致病人停止治疗和支持耐药菌株的出现4]。

利什曼虫有几个机制逃避免疫应答。能力是一个重要的干扰一氧化氮(NO)生产,通过抑制诱导一氧化氮合酶的表达(间接宾语)在巨噬细胞,因此导致损耗的不,leishmanicidal的关键中介活动,能够削弱的复制l . amazonensis(5]。

伊诺的激活依赖于NF -κB转录。寄生虫属的利什曼虫可以打通NF -κB p65亚基,防止一些促炎介质的转录,因此影响伊诺表达式和生产6]。

为了生存,利什曼虫可以进一步逃避细胞毒性机制通过减少生产通过精氨酸酶表达的增加,劈开精氨酸、前体的合成(7,8]。

总之,缺乏有效的药物和可用的严重副作用,加上主人的身体无力应对这种寄生虫,一直在背后的推动力量寻找新的化疗药物利什曼虫。因此,NO-based复合物似乎是一种很有前途的方法。

因此,没有在ACL的关键作用增加了兴趣理解与金属配合物的相互作用,如与钌,旨在尽可能使用这些化合物没有供体药物在生物条件(9]。这种复杂的之前已经测试利什曼虫列示在无鞭毛体和promastigote形式抑制线粒体呼吸,杀死寄生虫(10,11]。

一些配合物如反式-[俄文(NH(没有)₃)₄L) (X)₃、[俄文(没有)Hedta]和Na₂[Fe (CN)₅没有]·H₂O₂测试的时候,非常有效的利什曼虫种虫害形式(5,12,13和其他病原体如鲁兹锥体(14),Paracoccidioides取代巴西橡胶树(15]。

钌捐赠者没有可取的属性显示治疗使用,如低细胞毒性和高水溶解度(16),和控制释放的(10]。因此,我们执行在体外化验调查复杂的直接影响独联体——[俄文(NO) (bpy)₂(所以₃))(PF₆)寄生虫及其调节行动利什曼虫来华的巨噬细胞。

2。材料和方法

2.1。利什曼虫amazonensis(利什曼虫)文化

Promastigote形式的利什曼虫(利什曼虫)amazonensis(MHOM / BR / 1989/166MJO)在199年保持媒体(GIBCO表达载体),补充10%胎牛血清(的边后卫,GIBCO表达载体),1 M玫瑰(4 - (2-hydroxyethyl) 1-piperazine ethanesulfonic酸),0.1%的人类尿液、谷酰胺0.1%,10 U /毫升青霉素和10μg / mL链霉素(GIBCO英杰公司)和10%碳酸氢钠。Promastigote文化在孵化24°C 25厘米²烧瓶5天。

2.2。一氧化氮供体

一氧化氮供体RuNO复杂的合成和表征研究[17在有机和无机化学、Ceara-UFC大学。

2.3。Antiprotozoal活动

Promastigote形式(1×10⁶199 /毫升)生长在媒体和30和60孵化μ在24°C和M RuNO复杂计算在纽鲍尔室后24 h。Promastigotes仅生长在培养基作为控制。

2.4。腹膜巨噬细胞的生存能力

巨噬细胞(3×10⁶/毫升)得到BALB / c小鼠,腹腔的resuspended RPMI 1640培养基(GIBCO)补充10%的边后卫,和分布在24-well板块公司坚持2 h的5%₂在37°C。治疗依从性后,细胞与不同浓度的RuNO复杂(10 - 640μ米);积极的控制只包含RPMI 1640和消极控制包含4% H₂O₂。治疗24小时后,MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、溴化5-diphenyltetrazolium)补充说,板是孵化4 h。MTT-formazan晶体,形成溶解在DMSO(二甲亚砜)和吸光度测量在540海里使用分光光度计18]。

2.5。噬菌作用的测定

腹膜巨噬细胞(5×10⁵/毫升)被注射了3毫升的RPMI 1640培养基(GIBCO®)补充10%的边后卫(GIBCO)和生长在24-well板块包含13毫米直径的玻璃盖玻片。细胞与200年preincubatedμL (RPMI介质2 h的依从性,,后来,细胞用生理盐水洗净去除不依从细胞。贴壁细胞被感染promastigote形式(1:5)2 h,对待RuNO复杂(30和60μ米)单独或与RPMI介质(控制)和孵化24小时37°C / 5%股份有限公司₂。细胞被染色和染色确定感染的巨噬细胞的数量和寄生虫/巨噬细胞。

2.6。Promastigote复苏

腹膜巨噬细胞(5×10⁵/毫升)中孵化24-well盘子,,2 h后,巨噬细胞被感染promastigotes (1: 5) 2 h。文化被移除细胞外寄生虫和孵化与199年文化媒体24°C,并与60细胞治疗μM RuNO复杂+ L-NAME (NG-nitro-L-arginine甲基酯)。恢复promastigotes在纽鲍尔室数为4天。

2.7。细胞因子测定

吞噬试验收集上层清液,离心460×g在4°C 7分钟,并存储在20°C细胞因子的决心。肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子α),IL - 1(白介素-)βil - 10,干扰素-γTGF -β,il - 12是由酶联免疫吸附试验(ELISA),根据制造商的说明(eBiosciences®,美国)。板块在450海里,用ELISA板读者(热Plate-TP-Reader)。

2.8。亚硝酸盐含量测定

亚硝酸盐测定的上层清液中巨噬细胞感染,然后用一氧化氮供体进行处理(19]。简而言之,在吞噬化验上层清液脱去蛋白质通过添加硫酸锌(ZnSO₄)溶液和氢氧化钠(氢氧化钠)。混合物是离心机(10845×g 5分钟4°C)。浮在表面的恢复和稀释在甘氨酸缓冲。镉颗粒在无菌蒸馏水冲洗和添加到硫酸铜(CuSO₄)解决方案,允许站5分钟,然后覆铜镉颗粒被使用在10分钟。激活颗粒被加入甘氨酸buffer-diluted上层清液,搅拌10分钟。能整除的50μL的上层清液整除被转移到96 -微型板块和同等体积的格里斯试剂是补充道。校准曲线是准备使用亚硝酸钠(NaNO₂)在不同浓度和吸光度测定标在550海里。

2.9。号抑制试验

腹膜巨噬细胞被刺激与脂多糖(LPS),和其他人受到感染和治疗60岁μM RuNO。然而,治疗前RuNO复杂,细胞与100年孵化μ米L-NAME 36°C和5%的公司₂24 h。上层清液是用来测量没有文化水平(通过测定亚硝酸盐水平(如前所述)。

2.10。免疫细胞化学Akt, NF -κB,进气阀打开

免疫细胞化学(ICC)为一种蛋白激酶,NF -κB (p65),进气阀打开进行coverslip-adherent细胞(细胞准备吞噬试验)描述的协议中采用链霉亲和素生物素标记法与LSAB工具包(DAKO日本,京都,日本)。盖玻片是孵化与崔x - 100解决方案1 h,在PBS洗,在室温下以10% BSA治疗。接下来,一夜之间,盖玻片被孵化在4°C主要抗体(anti-Akt anti-NF——老鼠κB, anti-iNOS兔多克隆抗体稀释1:200;圣克鲁斯生物技术,美国)。二次抗体治疗后(2 h,室温),辣根过氧化物酶活动被可视化治疗h₂O₂和3,3′-diaminobenzidine (DAB) 5分钟。在最后一步中,盖玻片是弱与哈利的苏木精复染色(默克公司)。对于每个案例,消极的控制由省略主要抗体。使用强度和本地化的免疫反应性主要抗体检查所有盖玻片上使用显微照相机(奥林巴斯BX41,奥林巴斯光学有限公司,东京,日本)。在图像分析研究中,显微照相机颜色代表地区的幻灯片(40 x物镜)是数字。确定一个半定量的得分、图像进行评估通过使用图像的颜色反褶积的工具软件(美国国家卫生研究院)J。像素被[分类如前所述20.]高正面(3 +),正面(2 +),低积极(1 +)和消极的(0),核染色anti-NF -κB p65磷S536抗体(Abcam目录ab86299数量,稀释1:300)和anti-Akt1磷S473抗体(EP2109Y Abcam,目录ab81283数量,稀释1:250)。盖玻片处理所述,核染色的量化是由确定的百分比标记细胞在30字段/实验条件,一式三份。

2.11。伊诺mRNA的相对量化实时逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

RNA提取了10⁶使用SV细胞总RNA孤立系统(美国Promega)后,制造商的过程。RNA浓度测定用分光光度计测量吸光度(260海里)(美国Biotek协同HT)。互补DNA合成使用500 ng的总RNA逆转录反应MMLV逆转录酶(美国表达载体)后,制造商的过程。实时rt - pcr定量mRNA分析Rotor-Gene问设备(试剂盒、德国)使用铂®SYBR®绿色qPCR SuperMix-UDG(美国表达载体),在最后的20倍μl反应混合物还包含2μ引物和100 ng的cDNA模板。引物的序列用于诱导一氧化氮合酶是iNOS-F 5′-cgaaacgcttcacttccaa-3′和iNOS-R 5′-tgagcctatattgctgtggct-3′和β肌动蛋白是b-actin-F 5′-agctgcgttttacacccttt-3′, 5′b-actin-R -aagccatgccaatgttgtct-3′。循环条件10分钟在95°C的30年代和40个周期95°C, 30年代在62°C,和30年代在72°C,其次是融化曲线分析(60到95°C 0.5°C / s)。基因表达水平与参考决定β肌动蛋白使用比较循环阈值方法。

2.12。统计分析

实验进行了一式三份。数据从三个独立的实验,获得表示为平均值±标准错误的意思。使用GraphPad棱镜进行了统计分析软件(版本5.0)。组比较采用单向方差分析和图基的测试。被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。一氧化氮供体独联体——[俄文(NO) (bpy)₂(所以₃))(PF₆)展品Antileishmanial效应

RuNO复杂的antileishmanial效果评估,确定promastigote形式的扩散l . amazonensis。寄生虫是孵化RuNO复杂的在两个不同的浓度(30和60μ米)24 h。我们观察到RuNO浓度使用明显的增殖抑制l . amazonensis与对照组相比,证明RuNO复杂antileishmanial活动(图1(一),)。

根据肝癌细胞可行性分析,我们发现RuNO复杂不是有毒10到60μM(图1 (b))。

3.2。一氧化氮供体不改变吞噬能力但影响从巨噬细胞释放Promastigote形式

是否治疗RuNO复杂可以修改巨噬细胞的吞噬能力,我们用30和60孵化这些细胞μM RuNO 24 h,然后评估吞噬指数通过确定无鞭毛体的平均数量/巨噬细胞。我们发现治疗并没有改变的百分比被感染的巨噬细胞以及无鞭毛体/巨噬细胞的数量(数字1 (c)和1 (d),)。然而,当我们决定promastigotes的复苏,我们观察到浓度显著降低寄生虫的数量与对照组相比(图中恢复过来1 (e),)。

3.3。RuNO复杂不被感染的巨噬细胞中细胞因子调节模式

旨在理解的机制RuNO复杂杀死寄生虫,我们评估了巨噬细胞在细胞因子的状况利什曼虫感染。感染巨噬细胞后,肿瘤坏死因子-α产量明显降低与控制(图相比2,)。

3.4。RuNO复杂增加一氧化氮的水平

关于没有水平,结果显示,治疗RuNO复杂显著增加亚硝酸盐水平感染巨噬细胞(图3(一个),)。确定没有发现巨噬细胞文化上层的内源性或外源性,我们用L-NAME阻塞NOS活性。我们观察到治疗RuNO复杂+ L-NAME诱导增加亚硝酸盐水平(图3 (b),)。此外,治疗导致的数量显著减少promastigotes(图中恢复过来3 (c),)。在一起,这些结果表明,没有寄生虫的死亡负责,没有来自捐赠。

3.5。RuNO复杂的一种蛋白激酶的表达增加,进气阀打开,NF -κ在巨噬细胞B (p65)

国际刑事法庭的结果显示,Akt显著增加,NF -κB,进气阀打开标签在感染巨噬细胞处理RuNO复杂(数字4(一),4 (c),4 (e),)。来证实这些结果,我们分析的百分比磷酸化p65 (P-p65)和磷酸化Akt (P-Akt)。结果显示显著增加核一种蛋白激酶磷酸化和p65感染巨噬细胞治疗RuNO复杂(数字4 (b)和4 (d),)。同样,为了更好地理解底层机制由RuNO伊诺的增加标签,我们分析它对伊诺mRNA表达的影响。结果显示,治疗显著增加伊诺mRNA表达在感染巨噬细胞(图4 (e),)。

4所示。讨论

众所周知,没有是一种寄生虫的关键分子控制负载的开发过程中ACL (21]。逃避宿主免疫力,寄生虫属的利什曼虫调节巨噬细胞的反应通过减少伊诺活动和生产消耗酶底物,以及增加必要的多胺的生产需要寄生虫的生长和分化8]。到目前为止,仍然没有已知的药物能够恢复在巨噬细胞没有水平。

在这项研究中,我们演示了在体外没有捐赠RuNO复杂显示antileishmanial活动通过释放和消除promastigote形式的l . amazonensis。我们组之前证明(14,22),没有捐赠者trypanocidal活动基于钌配合物显示有效。另一项研究也证明这样antileishmanial活动但与另一个化合物l .主要(13]。

在目前的研究中,我们证明了治疗RuNO复杂不干扰巨噬细胞的吞噬活动;然而,巨噬细胞能够杀死寄生虫。另一项研究[23)报道,在高浓度的没有生产在体外,无菌无鞭毛体l . amazonensis是敏感的。另一个没有捐赠者显示trypanocidal活动在体外在维洛细胞感染后治疗t . cruzi,它展示了治疗的有效性基于外生的使用没有捐助者(24]。作者还认为没有捐助,利用在体外和在活的有机体内,trypanocidal活动,能够诱导小鼠模型的寄生虫学的治疗。

除了没有,实验模型显示的结果利什曼虫感染是非常依赖于免疫反应。事实上,这种疾病的易感性是归因于Th2免疫反应,导致开发和乘法的寄生虫25]。另一方面,电阻建立了优惠Th1族群的激活淋巴细胞,导致许多细胞因子的生产,尤其是干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α;这些细胞因子可以激活巨噬细胞,增加伊诺活动,进而增加一氧化氮的生产(26,27]。

尽管RuNO复杂引起腹膜巨噬细胞的免疫调节,寄生虫可以调节整个免疫反应。戈麦斯et al。28也报道了巨噬细胞感染l . amazonensis生产低水平的TNF -α巨噬细胞感染相比l .主要。这就解释了低产量的TNF -α。

Kima (2007) (29日)建立promastigotes和所有物种的无鞭毛体能够抑制il - 12的生产从活跃的细胞。众所周知,两个刺激所需伊诺的表达和激活;第一个刺激干扰素-γ,这是第二个信号介导肿瘤坏死因子-紧随其后α,导致持续的生产(23]。

在我们的工作中,没有这两个高水平的细胞因子,但当ICC和rt - pcr分析,伊诺表达式被发现增加,这表明RuNO复杂的可以直接诱导酶,从而增加生产。

在目前的工作,RuNO复杂能够增加Akt的感应,从而诱发伊诺和NF -κB激活(图4)。有可能是一种蛋白激酶在我行为κB退化和易位的NF -κB到细胞核,促进伊诺生产。

一些研究报道Akt通路的重要性在上皮细胞和巨噬细胞。有人建议,这在信号转导通路中起着重要作用参与伊诺和NF -的感应κ激活,刺激的激活和释放NF -κ我通过降解κB (30.- - - - - -32]。

一些研究报道,没有积极调节进气阀打开表达式在老鼠的细胞类型和人类细胞(33,34]。李和白菜(35)报道,伊诺活动的抑制减弱伊诺的表达蛋白,添加外源性一氧化氮供体可以恢复伊诺的水平。没有通过进气阀打开表达式的增加是由于拉亚硝基化,增加水平伊诺的持续Akt激活。

我们证明RuNO治疗复杂的增加没有水平,大多数测量来自捐献者,确认RuNO复杂版本没有的能力。

事实上,通过阻断与L-NAME伊诺,我们证明,大部分没有发现(图3 (c))从RuNO复杂,这是寄生虫的死亡负责。

Genestra et al。36]表明腹膜巨噬细胞从BALB / c小鼠感染l . amazonensis24小时后显示没有水平升高。此外,巨噬细胞与L-NAME孵化24 h时,没有产量显著降低。阻止任何合成L-NAME显然是看到的,并没有逆转的精氨酸,和腹膜巨噬细胞处理L-NAME显示24小时后感染指数明显降低。这份报告表明,没有真正重要的途径建立感染。Perrella Balestieri et al。37)建议增加吞噬溶酶体导致的寄生虫数量减少生产没有通过进气阀打开。

因此,化合物的使用提供的交付没有分子,也许最好的化合物与leishmanicidal活动,可以是一个可行的替代治疗利什曼病。因此,不得捐赠用于本研究这些可能性之一,因为它能够通过释放没有杀死寄生虫,以及调节的转录能力吞噬细胞。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持Fundacao南洋杉/ SETI Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩)和Londrina州立大学协调Postgraduation (PROPPG-UEL)。a·瓦博士帮助英语论文的编辑。