文摘

背景。炎症性肠病(IBD),包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC),长期间歇性的和进步的炎症性疾病。磷脂酶D2 (PLD2)据报道,参与一些炎性疾病的发病机理。然而,PLD2的确切作用在IBD是模糊的。方法。PLD2表达决心从患者外周血细胞和炎症粘膜炎症性肠病中存在。结肠活检也从CD病人之前和之后获得英夫利昔单抗(IFX)治疗检查PLD2表达式。PLD2选择性抑制剂(CAY10594)管理日常DSS-induced结肠炎小鼠口服填喂法。从结肠炎小鼠骨髓中性粒细胞收获使用Transwell板检查迁移。结果。PLD2被发现显著增加患者的外周血细胞和粘膜发炎活跃IBD。IFX治疗可以显著减少PLD2表达式在CD患者肠道粘膜。此外,封锁PLD2 CAY10594可以明显改善DSS-induced结肠炎小鼠和促进中性粒细胞迁移。结论。PLD2 IBD的发病机制中起着至关重要的作用。封锁PLD2可能作为一种新的治疗方法用于治疗炎症性肠病。

1。介绍

炎症性肠病(IBD),包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC),长期间歇性的和进步的炎性疾病发生在胃肠道(1- - - - - -3),表现为肠粘膜炎症最终腹痛、复发性腹泻、血凳子,和失去体重4,5]。尽管IBD的潜在病因和病理仍然难以捉摸,越来越多的证据表明炎症性肠病的发病机制是异常免疫应答的结果基因易感个体的肠道微生物群(6- - - - - -8]。在急性炎症中,大量的白细胞渗透IBD的粘膜发炎,这些白细胞,以及肠道间质和上皮细胞,产生大量的促炎细胞因子,进一步导致炎性损伤肠粘膜(9]。CD4⁺T细胞,适应性免疫系统的重要组成部分,据报道,在炎症性肠病的发病机制起着至关重要的作用。研究涉及,T辅助(Th) 1-related细胞因子,如干扰素(IFN)γ和肿瘤坏死因子(TNF)α,Th17细胞因子有关,如白介素- 17 (IL), IL - 6, IL-23, Th2等相关细胞因子IL - 4, IL-5, IL-13参与炎症性肠病的诱导和发展(10]。中性粒细胞,最丰富的白细胞数量,也必不可少的保护宿主免受微生物病原体的入侵(11]。他们是具有抗菌功能的一些能力,如吞噬作用,形成中性粒细胞胞外陷阱(净),脱粒,释放活性氧(ROS) (12]。此外,中性粒细胞也可以促进上皮修复和粘膜愈合通过释放细胞因子和趋化因子所需的分辨率粘膜炎症(12,13]。

lipid-signaling酶,磷脂酶D2 (PLD2)是骑士家族中的一员,可以催化的水解磷脂酰胆碱(PC)产生信号分子磷脂酸(PA) (14]。PLD2和PA可以与几种类型的磷酸酶,激酶,蛋白质和磷脂酶,并进一步调节多种细胞功能,包括激活、增殖,凋亡,和迁移14- - - - - -17]。证据表明,PLD2参与一些疾病的发病机制,如病理性血管生成、脓毒症、哮喘、老年痴呆症和癌症(18- - - - - -21]。已经发现在基底的增强渗透性通过调节细胞骨架重组和occludin表达式(22]。抑制PLD2可能通过下调促进结肠癌细胞凋亡PI3K-AKT信号通路和结肠癌中发挥保护作用23]。此外,PLD2还诱发加重,导致脓毒症的死亡率通过抑制中性粒细胞胞外陷阱的形成和减少CXCR2的表达(18]。这些数据表明,PLD2参与炎症和结肠直肠癌的发展;然而,是否PLD2参与炎症性肠病的发病机制仍然未知。

在这项研究中,我们发现PLD2高度表达的外周血细胞和粘膜发炎IBD患者的活跃。刺激与肿瘤坏死因子-α在中性粒细胞可以显著提高PLD2表达式,IFX治疗可以逆转PLD2表达的增加。此外,抑制PLD2 CAY10694可以显著改善DSS-induced小肠结肠炎小鼠。抑制PLD2也可以通过移植促进中性粒细胞迁移CXCR2的表情。因此,我们的数据表明,封锁PLD2改善肠黏膜炎症和PLD2可以治疗炎症性肠病的治疗目标。

2。材料和方法

2.1。病人

所有的外周血和结肠活检样本收集的IBD患者从2014年7月到2015年10月在美国胃肠病学,上海第十人民医院同济大学(上海,中国)。患者外周血样本获得活动光盘(CD,),CD患者在缓解期(R-CD),患者活动加州大学(该校,),UC患者在缓解期(R-UC)和健康对照组()。结肠活检样本收集从一个cd患者(),R-CD (),该校(),R-UC ()和HC (在结肠镜检查)。CD或加州大学的最后诊断是根据临床特点,辐射和内窥镜检查,和组织学结果(见补充表在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2543070)[24]。克罗恩氏病等国际标准的标准活动指数(CDAI)和梅奥分数用来评估疾病严重程度患者CD和加州大学,分别是(25,26]。本研究为临床研究机构审查委员会批准的上海第十人民医院同济大学。前书面知情同意也获得所有科目学习。

2.2。Anti-TNF马伯治疗患者积极的CD

17名患者被诊断为活跃CD据CDAI成绩≥150分,对待anti-TNF马伯(5毫克/公斤,英夫利昔单抗(IFX);Cilag AG)、Schaffhausen、瑞士)周0,2,6如前所述[27]。所有患者在随访期间每周检查,收集和结肠活检后在12周0和第一个输液。IFX治疗的疗效评估根据内镜CDAI和粘膜愈合如前所述[27]。临床缓解期定义为CDAI得分< 150分,和临床反应的减少CDAI分数≥70分的评价时间点与基线相比指数。

2.3。粘膜活检文化在体外

结肠活检获得从cd患者(在内窥镜检查和培养)体外(2活检样本/)1毫升RPMI 1640中存在IFX或控制人类免疫球蛋白(高)(50岁μ在37°C g / mL) 5%二氧化碳湿润空气24 h。从培养的粘膜组织和提取的RNA是用来考试的PLD2存在。

2.4。老鼠

特定的无菌C57BL / 6小鼠购自上海SLAC实验动物有限公司(上海,中国)。老鼠提出具体的无菌条件下过滤空气,允许自由进入无菌水和热压处理过的食品。老鼠实验中使用在8 - 10周的年龄和20 - 25克的重量。综述了动物研究和批准的同济大学动物保健和使用委员会制度。

2.5。建立DSS-Induced小鼠结肠炎模型

DSS-induced结肠炎模型建立了使用前面描述的方法(28]。C57BL / 6,两组(每组10老鼠)有2.5% DSS的饮用水连续七天,第八天,所有的老鼠都给无菌水三天。一群老鼠是管理PLD2选择性抑制剂(CAY10694圣克鲁斯生物技术4毫克/公斤)每天口服填喂法,和另一组小鼠与PBS管理控制。其他两组的老鼠(每组10老鼠)连续十天有无菌水作为消极的控制。在10天的观察,急性结肠炎每日观察的特点,包括腹泻、血便,体重和存活率。在第十天,所有的老鼠都牺牲了;从小鼠结肠组织获得。结肠(0.5厘米)的一小部分固定在10%多聚甲醛在一夜之间用于)染色,和另一个小的一部分结肠(0.5 - -1.0厘米)是用于RNA提取中存在的分析。此外,骨髓细胞的小鼠红细胞裂解后也被孤立。中性粒细胞被孤立使用中性粒细胞从小鼠骨髓的隔离设备(Miltenyi研究,顺序:130097658)和用于流式细胞仪分析和迁移能力的分析Transwell盘子(多屏幕,5μ米)在体外。

2.6。定量实时聚合酶链反应(存在)

总RNA提取的用来进行活检或鼠标结肠组织,数量和质量是评估使用NanoVue分光光度计(美国通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西),260/280的比率在1.8和2.0之间。互补DNA(互补)合成了5 x一体化RT MasterMix (abm)根据制造商的指示。一反应是执行使用下列条件:25°C 10分钟和15分钟42°C, 85°C 5分钟紧随其后。合成cDNA存储在−20°C。执行中存在使用SYBR绿色方法根据下列条件:1分钟95°C,紧随其后的是40周期在95°C 15 30年代和40年代和60°C周期。所有样品中存在分析井进行了一式三份。所有的引物合成了ShengGong BioTeck(中国上海)和GAPDH作为内生参考基因(表1)。目标基因表达的相对水平计算的比例相对于GAPDH参考。存在分析进行使用方法(29日]。

2.7。免疫组织化学

免疫组织化学进行5 -μ米厚的部分从用来进行活检IBD患者和健康对照组。一夜之间,部分被风干,在丙酮固定了10分钟,冲洗磷酸盐(PBS) 5分钟。与想象FLEX Peroxidase-Blocking试剂孵化后10分钟,这些部分是孵化与兔子反PLD2多克隆抗体(Abcam稀释1:100)在一夜之间在4°C。在PBS洗涤后,60分钟的部分被孵化HRP-conjugated山羊anti-rabbit或山羊anti-mouse免疫球蛋白在室温下(稀释1:400)。颜色反应是发达与3、3′-diaminobenzidine和部分与苏木精复染色。消极的控制,部分处理PBS代替主要抗体。确定阳性细胞的比例,五个领域的肠道粘膜随机选择在高功率(×400)(29日]。

2.8。统计分析

数据表示为均值±SEM和分析使用SPSS统计14.0版(美国SPSS,芝加哥,IL)。进行了统计比较使用一个未配对的双尾学生的以及或单向方差分析(方差分析)。配对以及之前和之后进行分析统计IFX治疗。被认为是具有统计学意义,被认为是明显统计学意义,然后呢被认为是非常明显的统计学意义。

3所示。结果

3.1。PLD2高度表达的患者外周血细胞和粘膜发炎活跃IBD

先前的工作已经证明,PLD2参与脓毒症和慢性哮喘的发病机制18,21];我们假设PLD2还可能涉及到IBD的感应和发展。因此,收集外周血和炎症粘膜从活跃的IBD患者和健康对照组,我们发现PLD2表达显著增加外周血细胞和粘膜发炎cd和该校患者与健康对照组相比。然而,没有明显区别R-CD或R-UC患者和健康对照组。CD和UC组之间无统计学差异观察(数字1(一)和1 (b))。此外,我们比较PLD2表达相同发炎和影响粘膜炎症性肠病病人,发现PLD2表达显著增加炎症粘膜比影响控件(数据1 (c)和1 (d))。免疫组织化学染色显示PLD2阳性细胞的百分比显著增加炎症粘膜固有层中从CD或UC患者与健康对照组相比(图1 (e))。

确定表型的表达在不同的细胞亚群,PLD2 CD4,我们孤立的中性粒细胞⁺CD8 T细胞,⁺T细胞CD14⁺单核细胞和CD20⁺从健康的捐赠者,B细胞和表达中存在的PLD2进行了分析。图2(一个)表明PLD2主要表现在中性粒细胞。此外,我们分析了百分比和绝对数量的患者的外周血中性粒细胞炎症性肠病和观察到的百分比和绝对中性粒细胞的数量显著增加(补充图)。在中性粒细胞CD66b是一个特定的标记表示,免疫组织化学染色显示CD66b⁺细胞与IBD的患者明显增加炎症粘膜与HC(补充图)。然后我们孤立从外周血中性粒细胞炎症性肠病的患者,发现PLD2 mRNA表达高度增加外围IBD患者中性粒细胞与HC(图2 (b))。因此,我们的数据表明,PLD2高度表达的外围中性粒细胞炎症粘膜炎症性肠病和可能发挥重要作用在炎症性肠病的发病机制。

3.2。肿瘤坏死因子-α表达显著上调PLD2

在确认PLD2增加活跃IBD患者粘膜发炎,然后我们调查所涉及的机制增加PLD2的表达式。因为积累证据报道,多种细胞因子(例如,TNF -α、il - 6、IL-17A干扰素-γ,il - 1β)参与炎症性肠病的发病机制29日- - - - - -32),我们调查是否这些促炎细胞因子参与的upregulation PLD2表达式。外周血中性粒细胞分离得到健康的捐赠者和刺激与il - 6, IL-17A, TNF -α有限合伙人,干扰素-γ,il - 1β分别为4 h在体外。如图3(一个)肿瘤坏死因子-α极大地增强了PLD2表达在人类中性粒细胞外围,有限合伙人和il - 1β可以适度提高PLD2表达式。此外,中性粒细胞与TNF -刺激α在不同浓度不同的时间点,我们发现,肿瘤坏死因子-α可以移植PLD2表达式剂量和时间的方式(数据吗3 (b)和3 (c))。先前的研究已经证实,anti-TNF -α治疗可以改善患者的肠黏膜炎症活动炎症性肠病(33,34]。因此,我们收集了来自CD患者结肠活检之前和之后的治疗。活跃的CD患者同时接受IFX周0,2,6如前所述[27),结肠活检获得17患者达到临床缓解。PLD2表达式被发现IFX治疗后明显降低(图4(一)),而没有差别在肠道粘膜PLD2表达从CD患者在IFX治疗失败。我们进一步研究了IFX治疗能否减少PLD2结肠粘膜的表达体外。刚从cd患者结肠发炎组织收集到该校和讲究的在体外刺激与IFX或控制人类免疫球蛋白(高)24 h。如数据所示4 (b)和4 (c),PLD2的表达也显著下调IFX治疗后与控制。综上所述,这些数据表明表达PLD2增加活跃的IBD患者和anti-TNF治疗可能下调PLD2表达式在肠道粘膜。

3.3。在老鼠身上的封锁PLD2改善DSS-Induced结肠炎

进一步调查的潜在作用PLD2在肠粘膜炎症的发病机制,急性结肠炎C57BL / 6小鼠诱导2.5% DSS中描述的材料和方法。PLD2选择性抑制剂CAY10594(4毫克/公斤)当时管理每天口服填喂法显示(18)和PBS媒介也是管理的日常控制。另两组老鼠管理CAY10694或PBS每日如上所述DSS接触作为消极的控制。结肠炎的临床特点,如腹泻、血便,体重,和存活率,每日观察。10天,所有的老鼠都牺牲了,结肠组织和骨髓细胞得到深造。见补充数据(一)和(B),表达PLD2被观察到显著增加粘膜发炎和骨骨髓来源与DSS-induced急性结肠炎小鼠中性粒细胞。有趣的是,管理CAY10594明显改善肠粘膜炎症,表现为更高的存活率,且减少体重,少甚至没有血腥的凳子,低水平的病理评分与控制(图5)。从结肠组织中提取RNA来检测细胞因子表达,和促炎细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子-α,IL-23 il - 6和il - 1β封锁后,被发现显著降低PLD2 DSS-induced结肠炎,而抗炎细胞因子(例如,il - 10)是抑制PLD2后显著增加(数据6(一)- - - - - -6 (f))。此外,新鲜的结肠样本也获得和培养在体外24小时;上层清液的收集由ELISA检测细胞因子。如数据所示6 (g)- - - - - -6 (j)促炎细胞因子的水平(例如,IL-17A, TNF -α,il - 1β)被发现是下降,而抗炎细胞因子(例如,il - 10)被发现增加PLD2封锁后,表明封锁PLD2可以改善肠道粘膜炎症。

3.4。封锁PLD2提高中性粒细胞迁移

来确定PLD2调节肠道粘膜炎症,我们孤立的骨髓细胞从老鼠DSS-induced结肠炎。如数据所示7(一)和7 (b)中性粒细胞的百分比在骨髓被发现显著减少在DSS-induced结肠炎小鼠PLD2的封锁之后,表明PLD2参与中性粒细胞迁移的能力。CXCR2之前的数据表明,趋化因子受体主要表达在中性粒细胞和嗜中性粒细胞提供中介动员外周血和炎症的网站,这是由G protein-coupled受体激酶(GRK2) [35,36]。我们从骨髓中分离出中性粒细胞的老鼠DSS-induced急性结肠炎和发现CXCR2的表达显著增加在结肠发炎DSS-induced结肠炎小鼠的封锁PLD2 PLD2抑制后,GRK2表达明显减少与WT控件(数字7 (c)和7 (d))。为了进一步确定PLD2的作用,我们从野生型小鼠的骨髓分离中性粒细胞DSS-induced结肠炎和分析中性粒细胞迁移Transwell板在体外。后抑制PLD2在体外,中性粒细胞迁移的能力显著调节(图7 (e))。综上所述,这些数据表明,抑制PLD2可能提高中性粒细胞迁移能力,促进炎症性肠粘膜的动员,进一步改善粘膜炎症。

4所示。讨论

炎症性肠病的主要特征与粘膜损伤,多种炎症反应相关上皮通透性增加,细菌侵入,大量招募中性粒细胞(8]。中性粒细胞是一个主要的免疫细胞参与炎症性肠病的发病机制。在这项研究中,我们表明,PLD2主要表达在中性粒细胞,TNF -α可以移植PLD2表达式。重要的是,封锁PLD2明显改善肠粘膜炎症通过增强中性粒细胞迁移。因此,我们的数据表明,PLD2 IBD的发病机制中起着重要的作用,封锁PLD2可能是一个新的治疗IBD的管理目标。

中性粒细胞,先天免疫系统的关键部件,是细胞的第一道防御溢出到炎症组织响应入侵的病原体和功能基本介质在许多疾病37]。先天性中性粒细胞障碍患者更容易受到严重感染的细菌和真菌,表明中性粒细胞在保护宿主免受微生物是不可或缺的。慢性肉芽肿性疾病,患者中性粒细胞在ROS的产生是由于有缺陷的NADPH氧化酶的功能障碍,高潮在复发性感染和寿命缩短,进一步强调了中性粒细胞的重要性(38]。在小鼠脓毒症模型,当老鼠缺乏一些抗菌能力(例如,脱粒),小鼠死后迅速暴露在脓毒症(39]。这些研究强调了不可或缺的中性粒细胞抗菌防御在急性炎症的作用。然而,什么IBD的中性粒细胞在肠道炎症中的作用?DSS-induced小鼠结肠炎,肠道炎症已被观察到的恶化后中性粒细胞的损耗管理anti-Gr1抗体,表明中性粒细胞在结肠炎的有益作用40- - - - - -42]。此外,中性粒细胞被证明能够促进生产的一些生长因子(例如,血管内皮生长因子),proresolution脂质(如lipoxins resolvin,保护),和抗炎分子(如lipoxin A4),有助于解决粘膜炎症(11]。有趣的是,治疗lipoxin A4已经发现改善DSS-induced肠道炎症(43]。此外,先前的研究已经证实,中性粒细胞能促进上皮修复和粘膜愈合通过il - 22生成的生产(44]。在当前的研究中,我们的数据也表明,比例和中性粒细胞的数量显著增加在IBD患者外周血和粘膜发炎,进一步证明中性粒细胞炎症性肠病的发病机制中起到的关键作用。

PLD2是一种酶,催化膜PC胆碱和PA的转换。PLD2表达在几乎所有类型的白细胞和吞噬作用有关,脱粒,微生物杀死,白细胞成熟20.]。Di Fulvio Gomez-Cambronero发现PLD2的表达在中性粒细胞增加粒细胞分化(45]。在另一项研究脓毒症(18),李等人发现PLD2不足不仅增加生存也减少败血症实验期间重要器官损伤。促炎细胞因子的生产(如TNF、IL-17 IL-23)和细胞凋亡在PLD2肾脏和肝脏明显减少^−−/老鼠。PLD2^−−/中性粒细胞显著保护野生型老鼠免受sepsis-induced死亡通过增加网络的形成18]。在我们的研究中,我们表明,PLD2表达高度增加IBD患者的外周血和粘膜发炎,主要是中性粒细胞中表达。此外,抑制PLD2改善肠黏膜炎症和降低死亡率在暴露于DSS。因此,PLD2 IBD的粘膜炎症中扮演一个重要的角色。

中性粒细胞趋化性是一个重要的特性在调节炎症(46]。损伤的趋化性报道各种各样的疾病与对感染的易感性增加有关。在慢性肾脏疾病(CKD)患者,FGF23,内分泌激素,可以调节磷体内平衡,抑制中性粒细胞的激活和招聘,FGF23中和在小鼠慢性肾病模型恢复白细胞招募和宿主防御47]。证据已经证明,MAPK p38信号通路的中性粒细胞的招聘网站需要在中性粒细胞炎症和异常p38信号加剧急性肺损伤的炎症和危及生命的急性呼吸窘迫综合征(48]。此外,其他研究已经证实,中性粒细胞transepithelial迁移和之间的交互epithelial-expressed ICAM-1可以调节肠道粘膜上皮内稳态和促进伤口愈合(49]。这些数据表明,嗜中性粒细胞迁移在炎症的保护起着有益的作用。在这项研究中,我们发现封锁PLD2选择性抑制剂可以改善DSS-induced结肠炎小鼠和促进中性粒细胞从骨髓动员到肠道粘膜。CXCR2,中性粒细胞的趋化因子受体表达,调节中性粒细胞动员骨髓和外周血炎症的刺激下的网站其配体(处于受控和CXCL2)。在脓毒症的研究,IL-33可以反向CXCR2的下降表现在通过抑制中性粒细胞GRK2 [35,36]。在病毒感染中,干扰素可以抑制CXCR2-mediated中性粒细胞招募到感觉神经节(50]。在实验脓毒症模型,PLD2缺乏保护野生型老鼠对sepsis-induced死于增强中性粒细胞的招聘。CXCR2-selective拮抗剂(SB225002)废除在实验败血症PLD2赋予的保护不足,建议加强CXCR2表达式在PLD2中性粒细胞促进生存^−−/老鼠(18]。在我们的研究中,我们发现封锁PLD2可以通过移植促进中性粒细胞招募CXCR2 GRK2-dependent的方式。然而,我们还发现,PLD2表达增加外周血和炎症粘膜炎症性肠病病人,机制,增加中性粒细胞的浸润也可能归因于其他分子(如TRPC6,地震,引发,路易斯X,和MAPK p38)在肠粘膜炎症的不同阶段(51- - - - - -54]。此外,当中性粒细胞招募到粘膜发炎,他们可能从事复杂的双向交互与上皮细胞,巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和T淋巴细胞,进而调节中性粒细胞迁移在肠道炎症的高级阶段(11]。因为这些分子和免疫细胞参与肠道炎症反应,调节中性粒细胞迁移是一个复杂的网络,和外周血中性粒细胞数量的增加和粘膜发炎的结果相互调制这些分子和免疫细胞。在我们的研究中,PLD2封锁是唯一的变量在体外,这可能解释这一事实增加中性粒细胞迁移是PLD2封锁的结果。因此,我们得出结论,封锁PLD2提高中性粒细胞迁移。

总之,我们的数据表明,PLD2是小说不可或缺的监管机构在炎症性肠病的发病机制通过抑制中性粒细胞迁移通过下调CXCR2的表情。封锁PLD2可以改善肠道粘膜炎症DSS诱导的小鼠。我们的研究揭示阐明一个新的PLD2在炎症性肠病的发病机制中的作用,并封锁PLD2可能是一个新的治疗IBD的管理目标。

相互竞争的利益

作者没有任何利益冲突。

作者的贡献

广西周、林,文静,吴魏和Zhanju刘的构思和设计实验;广西周、林,文静杨,磊哥方进行实验;杨广西周、林,文静,磊哥方分析数据;广西周、林,文静,和吴魏材料/分析工具;广西周、林,文静杨,Zhanju刘写了论文。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81270470,81270470,81630017)和上海科委(14401970100)。

补充材料