文摘
蒽醌化合物的一个丰富多酚在水果、蔬菜、草药。然而,在活的有机体内醌类化合物的抗炎活性和分子机制尚未完全阐明。我们调查了蒽醌类的活动使用急性炎症和疼痛的实验条件。Anthraquinone-2-carboxylic酸(9 10-dihydro-9 10-dioxo-2-anthracenecarboxylic酸,AQCA),其中一个主要从巴西taheebo蒽醌类标识,改善各种炎症和疼痛的症状EtOH /盐酸-和乙酰水杨酸(ASA)诱发胃炎、花生四烯酸段水肿、和醋酸段腹部盘绕在身体和器官重量,没有显示毒性资料胃发炎,或血清参数。此外,AQCA抑制炎症基因的表达,如胃组织中环氧合酶- 2 (COX)和脂多糖(LPS)对RAW264.7细胞。根据报告基因分析和免疫印迹分析,AQCA抑制核转录因子的激活——(NF)κB和激活蛋白- 1(美联社)抑制通路的上游信号涉及interleukin-1 receptor-associated激酶4 (IRAK1), p38, Src,脾酪氨酸激酶(麦克米兰)。我们的数据表明,醌类化合物如AQCA作为有效的抗炎和antinociceptive组件在活的有机体内,从而导致水果和香草的免疫调节作用。
1。介绍
众所周知,慢性炎症会导致严重的疾病,如癌症和糖尿病,从而影响人类的死亡率(1]。分子和细胞因子参与这些病理生理现象包括自由基的生成、炎症细胞的炎症基因表达,和招聘2,3]。因为严重的担忧炎症的作用在人类健康和长寿,2004年,该杂志时间强调慢性炎症秘密杀手。因此,慢性炎症的预防已经成为一个重要的问题。一个众所周知的方法来减少意外和长期炎症包括摄入抗氧化剂防止氧化应激(4]。此外,抑制身体的炎症反应、特殊疗法与抗炎活动也变得可用。为这些目的,人们消费推荐taheebo等众多的功能食品和保健品,人参,蘑菇,和冬虫夏草,以及新鲜蔬菜和水果5- - - - - -7]。这些都是伟大的价值来源成分与抗氧化、平喘药,和抗炎特性如类黄酮、皂苷、生物碱、萜类化合物、蒽醌类(8- - - - - -11]。事实上,在许多不同的实验动物模型,这些食物已经证明显示许多有益的药理活性。
有价值的化合物存在于食物中,蒽醌类是我们研究的重点在理解人体抗炎作用和抑制机制。不像其他的活性成分,如类黄酮,这些化合物的作用尚未完全阐明,尽管这些在自然界发现的突出。一些报道称,一些蒽醌类,如anthrasesamones (A, B, C, D), catenarin,大黄素,大黄酸、physcion chrysophanol,显示抗炎活动通过抑制核转录因子- (NF)κB和激活蛋白- 1(美联社)激活通路在不同细胞系统,如巨噬细胞、肝星状细胞,成纤维细胞,神经胶质瘤细胞12- - - - - -15]。尽管许多研究已经报道他们的抗炎活动在体外蒽醌类函数在在活的有机体内炎症模型还没有完全检查。因此,在目前的研究中,我们旨在调查在活的有机体内anthraquinone-2-carboxylic酸(AQCA,图的效果1(一)),一个代表anthraquinone-type化合物,来自taheebo。使用炎症和疼痛的动物模型模仿人类胃炎的症状,水肿,腹痛,我们探索的治疗潜力口头管理AQCA及其抗炎机制。
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2。材料和方法
2.1。材料
Anthraquinone-2-carboxylic酸(AQCA,图1(一)),吲哚美辛(印度)、雷尼替丁(RT)、花生四烯酸,羧基甲基纤维素钠(Na CMC), phorbol-12-myristate (PMA),乙酰水杨酸(ASA)和脂多糖(LPS),大肠杆菌0111:B4)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。SB203580(某人),PP2 piceatannol(云杉)获得Calbiochem (La Jolla、钙、美国)。在这项研究中使用的所有其他化学物质从西格玛化工有限公司均为分析纯Phosphospecific或总抗体对Src(猫了。数字2101年和2102年)、脾酪氨酸激酶(麦克米兰(猫。数字2711年和2712年),p38(猫。数字4631年和9212年),c-Jun n端激酶(物)(猫。数字9251年和9252年),环氧酶- 2 (COX)(猫。4842号),interleukin-1 receptor-associated激酶4 (IRAK4)(猫。4363号),β肌动蛋白(猫。4967号)从细胞信号(美国贝弗利,MA)。RAW264.7和HEK293细胞从美国购买类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。髓过氧化酶(MPO)比色测定装备活动获得Biovision(苗必达、钙、美国)。荧光素酶结构含有NF -绑定的推广者κB和AP-1教授的礼物有年轻的钟(釜山国立大学、釜山、韩国)和Addgene(美国Cambridge, MA)。
2.2。老鼠
雄性ICR小鼠,6周大,Balb / c小鼠,7周大,买来DAEHAN BIOLINK(来自韩国忠北、韩国)和被安置在6 - 8组小鼠在12 h光/暗周期在6点(灯)。水和颗粒的饮食(Samyang、大田、韩国)提供随意。动物照顾按照指南发布的国家健康研究所的实验室动物保健和使用(NIH出版80 - 23,1996年修订)。按照指南进行了研究机构建立的动物保健和使用委员会韩国成均馆大学(水、韩国;批准ID: SKKUBBI 13-6-6)。
2.3。细胞培养
小鼠巨噬细胞细胞株RAW264.7细胞,腹膜巨噬细胞,和293 (HEK293)人类胚胎肾细胞保持RPMI1640媒体补充与100 U / mL青霉素,100μg / mL链霉素,10%的边后卫。细胞生长在37°C和5%的公司2在湿润的空气。
2.4。药物制剂
股票AQCA使用的解决方案在活的有机体内实验准备使用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)。老鼠有或没有管理inflammation-inducing代理(控制或正常组)钠口服治疗0.5% CMC独自填喂法。为在体外研究表明,这种化合物溶解在100%二甲基亚砜(DMSO)。
2.5。EtOH /盐酸-和Aspirin-Induced胃炎
胃损伤诱导了EtOH /盐酸和亚撒(600毫克/公斤),根据公布的方法(16]。禁食ICR小鼠()口服治疗AQCA(3和30毫克/公斤)或雷尼替丁(40毫克/公斤)一天每8 h的三倍。上届政府后30分钟,400年μL 150毫米HCl的60%的乙醇注入口服药。每个动物麻醉后与过量的聚氨酯1 h坏死性代理商的管理。胃切除,然后轻轻冲洗下运行的自来水。胃大弯了,在一块板子上,和该地区(毫米2)使用pixel-counter粘膜腐蚀性损伤测量。建立aspirin-induced胃溃疡是以前公布的方法(17]。禁食ICR小鼠()服用AQCA intragastrically(3和30毫克/公斤)。30分钟后,老鼠口服服用阿司匹林(600毫克/公斤),参加了在牺牲前3个小时。每个动物麻醉过量的聚氨酯后3小时以内坏死性代理商的管理。胃切除,然后轻轻冲洗下运行的自来水。
2.6。组织学分析Aspirin-Treated胃
组织样本取自小鼠的胃在8 h后挑战与阿司匹林(600毫克/公斤)在PBS和10%福尔马林固定,然后嵌入石蜡。大约4μm薄组织部分被苏木精和伊红染色的组织病理学检查之前报道(18]。
2.7。MPO化验
MPO活性测定使用MPO活性比色测定装备。胃和胰腺中均质4卷包含0.1% NP40 PBS。溶解后,样本在13000×g离心10分钟去除不溶性物质。可溶性物质被稀释在MPO分析缓冲区。MPO基质添加,样本孵化25°C 60分钟,然后停止添加混合。孵化是持续了一个额外的10分钟停止反应。TNB(三硝基苯磺酸)试剂包含DTNB [5, 5′-dithiobis - (2-nitrobenzoic酸)]探针和TCEP(三羟甲基氨基甲烷(2-carboxyethyl)盐酸磷化氢液)是补充道。MPO的存在为412 nm。MPO活性表达为U / g组织。MPO活动的一个单位被定义为MPO的数量而产生足够的氨基乙磺酸氯胺消耗1μ在25°C M TNB /分钟。
2.8。花生四烯酸段小鼠疼痛的模型
测试AQCA是否能改善疼痛的性质由花生四烯酸诱导,先前报道(19,20.],ICR小鼠()是口头使用AQCA(3和30毫克/公斤)或吲哚美辛为7天(5毫克/公斤)。最终的治疗后,花生四烯酸(2% (w / v))是应用于老鼠的耳朵(25μL / ear)如前所述21]。水肿的厚度与定压测厚仪测量1 h与花生四烯酸治疗后。评估hypoalgesic功效,抑制AQCA对耳部水肿的影响计算如下: 在哪里是耳朵的厚度药物治疗组,耳朵的厚度正常对照组,耳朵的厚度控制。
2.9。醋酸段腹部打滚
ICR小鼠(/组)口服治疗AQCA(0、3、30和60毫克/公斤)或消炎痛(10毫克/公斤)。60分钟治疗期后,小鼠腹腔注射(i.p)与醋酸(5%),5分钟后,腹部的数量记录一段20分钟痛苦地扭动着。
2.10。急性毒性试验和测量血清参数
三个老鼠口服接种AQCA(1克/公斤)或阿司匹林(300毫克/公斤)7天。然后,死亡率和身体重量的变化每天监测,直到完成。所有的动物都从每组被牺牲和重要器官的重量和胃溃疡的形成是检查。离心分离血清样本获得的血液在4000 rpm 15分钟在4°C,然后被分成埃普多夫管。分离血清储存在−20°C,直到他们被用于分析。水平的血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和胆固醇与罗氏模块化测量光度自动分析器。
2.11。半定量或定量的mRNA分析反向Transcriptase-Polymerase连锁反应
确定炎症基因表达的水平,总RNA分离胃组织或LPS-treated RAW264.7细胞存在与否AQCA或雷尼替丁试剂盒试剂(Gibco),根据制造商的指示。RNA是储存在−70°C到使用。信使rna量化是由实时rt - pcr与SYBR预混料交货Taq(豆类生物有限公司、志贺、日本),根据制造商的指示,和一个实时热循环(美国Bio-Rad大力神,CA)报道之前(22]。半定量rt - pcr反应与之前报道进行了少量修改。结果表示为相对于GAPDH最优密度的比值。的引物得到Bioneer(大田、韩国)和描述如表1。
2.12。组织/细胞溶解产物的制备和免疫印迹
胃组织或RAW264.7细胞被洗3次在寒冷的PBS包含1毫米原钒酸钠,然后在裂解缓冲细胞溶解(20毫米Tris-HCl, pH值7.4,2毫米EDTA, 2毫米ethyleneglycotetraacetic酸,50毫米β二硫苏糖醇甘油磷酸酯1毫米原钒酸钠1毫米,特里同x - 100 1%, 10%的甘油,10μ10 g / mL抑肽酶μ1毫米benzimide g / mL抑肽素,2毫米PMSF) 30分钟,旋转,在4°C。组织溶解产物被离心澄清在16000 g×10分钟在4°C和储存在−20°C,直到需要。
用免疫印迹组织或细胞溶解产物进行分析。蛋白质(25μg / lane) 10% SDS-polyacrylamide凝胶分离和转移通过electroblotting聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。膜被封锁在室温下60分钟Tris-buffered盐水中含3%的边后卫,氟化钠20毫米,2毫米EDTA, 0.2%渐变20。膜是60分钟孵化与特定的抗体主要在4°C,洗3次相同的缓冲区,和额外的60分钟孵化HRP-conjugated二级抗体。cox - 2的总和磷酸化水平,Src,麦克米兰,p38 IRAK4,β肌动蛋白是可视化使用ECL系统(Amersham,小都,白金汉郡,英国),先前报道(23]。
2.13。荧光素酶报告基因活性测定
HEK293细胞(1×106细胞/毫升)转染有1μ克的质粒含有NF -κB-Luc或AP-1-Luc以及β牛乳糖使用表面(PEI)方法在12-well板根据以前的报告(24]。短暂,转染细胞的存在与否对AQCA PMA (20 ng / mL)与记者裂解细胞溶解在培养皿中缓冲区。溶菌产物在最大速度离心10分钟的埃普多夫微型离心机。十μL的上层的分数与50孵化μ荧光素酶的底物,和相对荧光素酶活性测定Luminoskan上升(热Labsystems男孩,芬兰赫尔辛基)。荧光素酶活动正常化β牛乳糖活动。
2.14。统计分析
本文中展示的所有数据表示为±SD的实验方法。结果进行统计比较,分析了使用方差分析/菸害的事后测试或克鲁斯卡尔-沃利斯/ Mann-Whitney测试。一个值< 0.05被认为是一个统计上的显著差异。所有的统计测试进行了使用计算机程序SPSS(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。类似的实验数据也获得了使用一个额外的独立组在活的有机体内实验进行了使用相同数量的老鼠。
3所示。结果与讨论
我们建立的条件下,我们可以观察到显著增加胃损伤和炎症细胞(中性粒细胞)渗透在盐酸/ EtOH -和aspirin-induced胃炎(数字1(一)和1 (b))。此外,急性期疼痛的症状很明显是建立在花生四烯酸段耳朵水肿(图2(一个)(图)和醋酸段腹痛模型2 (b))。评估AQCA的治疗活动是否独立于它的毒理学资料、身体和器官的毒性参数权重,对胃的刺激,和肝脏毒性标记测量(图3)。此外,炎症组织的分子分析表明cox - 2的表达在转录和翻译水平显著调节(数字4(一)和4 (c)cox - 2表达),上游信号事件,包括p38的磷酸化,Src,物,麦克米兰和IRAK4退化,也引发了治疗盐酸/ EtOH或阿司匹林(数字5(一个)和5 (b))。
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正如所料,口头管理AQCA(30毫克/公斤)显著改善炎症引起的胃损伤HCl / EtOH或阿司匹林73或78%,也显示了标准的化合物(RT)、雷尼替丁histamine-2受体拮抗剂规定治疗消化性溃疡的临床疾病和胃食管返流(25)(图1(一)和1 (b))。炎性细胞浸润引起阿司匹林后也完全减少AQCA管理(3和30毫克/公斤)(图1 (b)(B)),根据测量MPO的活性,关键炎症酶分泌激活中性粒细胞、巨噬细胞和小胶质细胞,产生高度活性氧造成额外伤害(26]随后粘膜损伤胃组织也明显减少AQCA治疗组(30毫克/公斤)(图1 (c)),这意味着不管这种化合物抑制胃炎症刺激代理。重要的是,AQCA(3和30毫克/公斤)显著抑制耳部水肿由花生四烯酸的形成,一个活跃的痛觉衬底的前列腺素E2(铂族元素2考克斯-)生成酶(27),类似于标准药物吲哚美辛的活动与已知COX-inhibitory属性(图2(一个)),这表明AQCA可以阻止COX-induced炎症反应通过直接抑制COX活动或间接抑制COX表达途径。同意这个,醋酸段打滚也显著地抑制了AQCA(30和60毫克/公斤),分别高达57和72%(图2 (b)),而消炎痛(10毫克/公斤)强有力地抑制打滚了85%,这意味着考克斯抑制是AQCA的抑制机制之一。这些结果表明,AQCA等蒽醌类的口服药物时有效。的确,口头管理大黄素(3-methyl-1 6 8-trihydroxyanthraquinone)的活性成分之一的根和根茎感冒palmatum已经使用了2000多年在中国,被发现产生抑制活动在食源性肥胖老鼠的代谢紊乱(28]。大黄酸(4,5-dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic酸),另一个主要的蒽醌化合物来自同一个工厂,已被证实能改善肝脂肪变性与非酒精性脂肪肝病(29日]。然而,没有足够的证据完全解释在活的有机体内蒽醌治疗活动,各种各样的在活的有机体内模型进一步研究的价值必须采用蒽醌类作为功能性食品配料。
尽管蒽醌类是众多食用来源丰富的组件,急性毒性测试被认为是必要的评估在活的有机体内AQCA的药理作用。为此,1克/公斤AQCA口头管理,以及各种毒理学参数检查。如图3AQCA似乎并没有引起任何副作用,因为没有改变身体和器官重量(数字3(一个)和3 (b)),没有胃刺激与阿司匹林(300毫克/公斤)口头管理(图3 (c)),并没有改变在肝毒性参数如天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、胆固醇(图3 (d))。这些结果强烈表明AQCA施加特定的药理作用没有意想不到的副作用。很少有报道与一个蒽醌化合物急性毒性测试;然而,我们的数据(图3)表明,AQCA是一种安全有效的保健品。
我们的在活的有机体内疗效数据对花生四烯酸段耳朵水肿(图2(一个))和醋酸段腹部扭动(图2 (b))表明AQCA-mediated抗炎活动与考克斯或COX-linked通路。因此,我们研究是否AQCA抑制cox - 2的表达,这是与炎症密切相关的症状。如图4(一),增加水平的cox - 2在盐酸/ EtOH-treated小鼠的胃是剂量依赖性降低AQCA治疗。考虑到雷尼替丁也抑制cox - 2 mRNA表达(图4(一)),看起来盐酸/ EtOH-induced组织损伤触发细胞cox - 2的表达。事实上,我们以前确认cox - 2在盐酸/ EtOH-induced胃炎的病理生理作用条件的改善效果与选择性cox - 2抑制剂治疗万络(30.)和类黄酮山柰酚,也抑制cox - 2的表达(粪et al .,提交)。进一步支持这些发现,AQCA有效抑制伊诺的表达,TNF -α,cox - 2在LPS-treated RAW264.7细胞(图4 (b))和抑制cox - 2蛋白的水平在同等条件下(图4 (c)),这意味着AQCA主要抑制炎症介质的表达在转录水平。事实上,NF -κB和AP-1活动,所评估的荧光素酶测定(31日),与PMA刺激下,一个已知的刺激激活PKC等各种炎症信号酶物,p38, IKK, IRAK1 [32),显著降低了50μAQCA的M(图4 (d)),表明NF -活动通过信号通路κB和AP-1激活。
积累在我们实验室结果表明,Src,麦克米兰,IRAK1, IRAK4,细胞外signal-regulated激酶(ERK), p38和物上游信号酶NF -很重要κB和LPS-treated AP-1激活巨噬细胞(33- - - - - -36]。此外,这些酶也如盐酸/ EtOH-treated各种炎性组织中胃,有限合伙人/ caerulein-treated胰脏器官,有限合伙人/ D-galactosamine-treated肝脏[34,37),表明这些酶导致在活的有机体内除了炎症过程在体外事件。在这些信息的基础上,我们研究是否AQCA监管上游炎症信号酶的激活。正如所料,p38的磷酸化,Src,麦克米兰和IRAK1退化明显,显著地抑制盐酸/ EtOH-treated和aspirin-treated胃的小鼠口服接种AQCA(数字5(一个)和5 (b))。同意这个,p38的抑制剂(SB203580(某人)],Src (PP2),麦克米兰(piceatannol(云杉)]也抑制TNF的表达α,进气阀打开,cox - 2,类似于应对AQCA(图5 (c))。此外,许多报告表明p38的角色,Src,麦克米兰,IRAK1 NF -κB和AP-1激活(38- - - - - -41]。早先我κBα磷酸化(5分钟)LPS-treated RAW264.7细胞与早期NF -的激活有关κB是麦克米兰磷酸化(紧密相连42]。之前报道,p38充当一个积极的球员通过激活炎症调节macrophage-mediated AP-1 [40]。Src被认为是一种强烈的NF -激活κB引起prooxidants toll样受体4 (TLR4)信号。此外,早期的肌动蛋白细胞骨架的重排在LPS刺激的激活与NF -κB通过upregulation Src活动(43]。它也表明NF - IRAK1刺激κB和AP-1通路LPS-stimulated巨噬细胞(44]。综上所述,这些研究结果清楚地表明,抑制这些酶的AQCA导致其抗炎行动。尽管如此,考虑到p38的磷酸化,Src,麦克米兰和退化管理IRAK1上游事件包括激活MKK3/6,肌动蛋白聚合,E3连接酶活性(39,40,43),其中一个或者其中的一些可能的目标化合物。此外,是否由花生四烯酸和醋酸诱发疼痛的活动是由IRAK1尚未探索。因此,我们将进一步确认和验证的具体目标(s) AQCA采用激酶试验和过度使用全长基因的假定的目标酶。此外,角色IRAK1将检查在急性疼痛。
总之,这项研究的结果表明,AQCA显然是能够抑制各种在活的有机体内炎症和疼痛的症状没有改变急性毒性等参数的身体和器官重量、胃刺激,和血清肝毒性参数。AQCA能够表达下调炎症基因表达的水平到Src封锁,麦克米兰,p38,物,和IRAK1,从而阻止NF -κB和AP-1激活。AQCA以来的主要组件之一是许多蔬菜和水果,我们建议AQCA或AQCA-rich保健品开发功能食品与抗炎作用。
缩写
| AQCA: | Anthraquinone-2-carboxylic酸 |
| NF -κB: | 核因子-κB |
| AP-1: | 激活蛋白1 |
| 物: | c-Jun n端激酶 |
| 麦克米兰: | 脾酪氨酸激酶 |
| 我κBα: | 抑制剂的κBα |
| IRAK4: | Interleukin-1 receptor-associated激酶4 |
| EtOH: | 乙醇 |
| cox - 2: | Cyclooxygenase-2 |
| 有限合伙人: | 脂多糖。 |
免责声明
作者仅负责内容和论文的写作。
利益冲突
作者报告没有利益冲突。
作者的贡献
Kim Jae Gwang公园,Seung Cheol,云金圆了同样的工作。
承认
本研究支持格兰特朝鲜卫生技术研发项目,卫生和福利部,大韩民国(HI12C0050)。