文摘

是一种常见的炎症过程与众多的血管疾病有关。我们假设针对发炎内皮通过耦合肽具有高亲和力P-selectin dexamethasone-loaded表面脂质这种高度会增加他们的特定的绑定激活内皮细胞(EC)和减少细胞的激活。我们开发和特点dexamethasone-loaded脂质这种指向P-selectin (PLN-Dex)和监控他们的抗炎效果在体外使用培养的EC (EA.hy926细胞)和在活的有机体内使用鼠标的急性炎症模型(脂多糖(LPS) C57BL / 6小鼠静脉注射)。我们发现专门PLN-Dex绑定激活EC的表面由EC有效内化,减少促炎基因的表达,从而防止通过激活单核细胞粘附和轮回/ EC。静脉注射的小鼠急性炎症,肺部PLN-Dex积累了相当高的水平(而不属预定目标的这种)和显著降低mRNA表达il - 1等关键促炎细胞因子水平β、il - 6和MCP-1。总之,新开发的nanoformulation PLN-Dex功能在体外和在活的有机体内,减少选择性内皮细胞激活和随之而来的单核细胞浸润明显减少肺部的炎症,急性炎症的小鼠模型。

1。介绍

血管内皮细胞构成单层衬砌的所有血管和被认为是体内最大的旁分泌器官(1]。在许多生理功能由内皮细胞(EC)血管张力的控制和血管的渗透性和维护nonthrombogenic和循环血细胞(nonadhesive表面2,3]。早期损伤的电子商务功能是一个关键步骤在多种疾病的发病机制,包括心血管、血液、疾病,肾,肺,感染,肿瘤疾病(4- - - - - -6]。

各种病理介质包括感染、炎症分子(细胞因子/趋化因子),活性氧物种,不同的抗原,或物理压力产生激活的EC,转导细胞粘附分子的表达增加。因此,电子商务及其相关surface-exposed细胞粘附分子代表一个有吸引力的和可访问的目标治疗各种炎症。

潜在的分子的目标EC P-selectin (CD62P),诱导细胞表面粘附分子中激活内皮病理改变脉管系统(7]。P-Selectin位于膜分泌颗粒的血小板和内皮细胞(8与凝血酶)和细胞刺激,组胺,或其他分子,重新分配到质膜,它介导白细胞招募(9]。蛋白质迅速从表面激活EC内化并返回到trans-Golgi网络,从它的分泌颗粒(排序10]。发现P-selectin是一种内化的受体(11)代表其适用性适当的目标细胞内交付治疗药物进入电子商务。

先前的研究显示使用P-selectin作为治疗目标的可行性在临床前研究中对不同的炎症性疾病。因此,管理一个P-selectin重组配体(rPSGL-Ig)球囊损伤后新生内膜增生,减少通过抑制炎症和血栓性反应猪冠状动脉(12]。同一组测试了P-selectin重组Zucker糖尿病鼠模型中的配体报道,一个静脉注射抑制炎症和抑制CD45-positive白细胞浸润和动脉损伤后新生内膜形成13]。在不同的研究中,针对P -寡糖和L-selectin抑制中性粒细胞的涌入的腹膜腔急性炎症小鼠模型(14]。同样,注入sialyl-Lewis X, P-selectin配体,大大减少肺损伤和中性粒细胞积累的组织,而无关紧要的低聚糖没有显著影响(15]。

金本位地塞米松药物抗炎治疗,一个强有力的糖皮质激素用于免疫介导的炎症性疾病的治疗,有效地抑制了许多炎症介质和细胞因子/趋化因子的表达:肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)、2、il - 6 (16]。地塞米松具有复杂的作用机制涉及与多样化的目标细胞溶质和核。类似于自然糖皮质激素激素皮质醇,地塞米松与胞液糖皮质激素受体(GR),启动易位到细胞核,它与特定DNA结合响应元素和激活基因转录。或者,GR复杂的胞质中的其他转录因子,可以像NF -κB或AP-1,防止他们的易位在细胞核和抑制促炎的分子的表达17]。

我们可以安全地假定提高地塞米松交付到EC可能导致更有效的和特定的影响。然而,系统管理地塞米松没有激活内皮细胞的亲和力并生成一些不必要的严重副作用在健康细胞和组织,如免疫抑制代谢改变,骨质疏松症、胃肠道出血和溃疡、高血压、高血糖和肾上腺机能不全18]。因此,长期管理不是一个选择,目前,使用糖皮质激素特别是作为桥接治疗类风湿性关节炎等慢性疾病的急性期(19]。

作为一个战略提供靶向内皮,药物或他们的运营商可以共轭配体亲和内皮表面因素。不同surface-exposed蛋白质,特别是调节激活EC(即表面。,E-selectin, ICAM-1, and VCAM-1) were employed to target dexamethasone to endothelium using delivery vehicles functionalized with specific ligands, with the purpose of modulating the inflammatory process [20.,21]。Dexamethasone-loaded脂质体携带RGD肽积累LPS-induced炎症网站和提供保护作用优于不属预定目标的Dexamethasone-loaded脂质体在大鼠关节炎模型(22]。肾小球炎症小鼠模型,dexamethasone-loaded脂质体涂E-selectin抗体展览一个~ 4倍高吸收肾脏发炎和不属预定目标的脂质体和减少60 - 70%的炎症标记物相对于控制(23]。功能化的dexamethasone-loaded右旋糖酐纳米凝胶ICAM-1识别抗体增加他们的肺积累LPS-induced内毒素小鼠模型和阻止炎性分子的超表达VCAM-1和ICAM-1肺溶解产物(21]。

为了增加特异性的地塞米松EC,在这项研究中,我们测试了脂质是否这种封装地塞米松和导演专门对激活EA.hy926细胞(人类endothelium-derived永久细胞系)暴露P-selectin减少炎症过程。我们设计了脂质这种(LN)封装效率高疏水性药物地塞米松(LN-Dex)和耦合肽具有高亲和力P-selectin(之前描述的24)表面上的LN-Dex (PLN-Dex)。我们报告PLN-Dex,绑定和内化,培养EA.hy926细胞,减少一些炎性分子的表达和降低了单核细胞粘附和跨细胞的轮回。在炎症的小鼠模型,管理PLN-Dex积累高亲和力的肺,它显著减少促炎的分子水平,il - 1β、MCP-1引发。据我们所知,这是第一个研究表明P-selectin-directed脂质这种可用于选择性的抗炎药与内皮细胞激活网站。

2。材料和方法

2.1。试剂

试剂得到下列来源:地塞米松、大豆油、甘油,透析袋(截止大小10 kDa), 3 - 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化,地塞米松,脂多糖大肠杆菌血清型O111: B4,重组肿瘤坏死因子-α(TNF -α)从Sigma-Aldrich化学(德国);光谱/为什么透析袋(500 - 1000年截止Da)光谱实验室(频谱欧洲BV、布雷达、荷兰);鸡蛋磷脂酰胆碱(EPC) 1 2-distearoyl -sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N -[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](Mal-PEG-DSPE), 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N——(丽丝胺若丹明B磺酰)(铵盐)(Rhodamine-PE),和1,2-distearoyl -sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N -(氨基(聚乙二醇)-2000)(PEG-DSPE)两代情极性脂质(雪花石膏,铝/美国);和杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM), RPMI介质,胎牛血清(FCS)、青霉素G,与链霉素Gibco BRL(马里兰州盖瑟斯堡/美国);细胞培养板由康宁(纽约/美国);轮回钱伯斯来自配角欧洲有限公司(Badhoevedorp、荷兰)。三羟甲基氨基甲烷(2-carboxyethyl)磷化氢液(TCEP)是购自热科学(美国马萨诸塞州);2′7′双(2-carboxyethyl) 5 (6) -carboxyfluorescein acetoxymethyl酯(BCECF-AM)从生活技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德);Amicon离心过滤列截止100 kDa来自微孔。肽具有高亲和力的P-selectin (CGGSSLVSVLDLEPLDAAWL)合成了GeneCust (Dudelange、卢森堡)。去离子的水(18.2 MΩ/厘米)从微孔内部使用Milli-Q系统生成。

2.2。制备Dexamethasone-Loaded脂质这种(LN-Dex)

LN-Dex是准备采用超声破碎法方法如前所述[25]。简单地说,有机和水相分别准备。有机相,由EPC(10毫米),phospholipidic挂钩的衍生品(PEG-DSPE (150μ和Mal-PEG-DSPE(200米)μ米))、大豆油(50μL)和地塞米松(Dex) (250μg)溶解在氯仿,使用真空旋转蒸发器蒸发。包含1毫升的水相双重蒸馏水和甘油(100μL)添加到有机相,用水浴中5分钟,40 V强度使用UP200H探测类型超声发生器(Heidolph)。脂质这种(LN)获得进一步使用Amicon离心机离心过滤单元100 kDa为了单独Dex-entrapped这种自由(nonentrapped)敏捷和消除任何有机溶剂的痕迹。控制,LN没有地塞米松。显微镜研究,LN与Rhodamine-PE添加荧光标记1摩尔%的比例。

2.3。脂质这种耦合P-Selectin识别肽(PLN)

P-selectin绑定肽序列CGGSSLVSVLDLEPLDAAWL,含有氨基酸半胱氨酸,后跟一个链接器形成的氨基酸序列GGSS和LVSVLDLEPLDAAWL [24)是加上马来酰亚胺组的远端挂钩(Mal-PEG-DSPE) sulfhydryl-maleimide交互,如前所述[26]。在耦合,肽被激活之前通过添加还原剂(TCEP缓冲区)二硫化打破债券和混合在室温下2小时。TCEP过剩是被透析(使用纤维素酯膜截止500 - 1000 Da),一夜之间在4°C对耦合缓冲区(10毫米Na₂HPO₄10毫米不₂阿宝₄2毫米EDTA 30毫米,pH值:6.7)。然后,添加肽是(摩尔比2:1、肽:maleimide-PEG-DSPE) LN或LN-Dex悬浮液和6个小时在室温下混合在一起。在此之后,饱和非耦合马来酰亚胺组,半胱氨酸(1毫米)增加了30分钟。净化步骤,混合使用Amicon离心机离心过滤单元100 kDa为了单独的非耦合的这种肽,半胱氨酸和自由(nonentrapped)敏捷。在这一步中,甘油过剩被超滤膜过滤或保留(27]。脂质这种的大小是由光子相关光谱使用Nicomp亚微米粒子分析仪型号380 (Nicomp本月Corp .,圣芭芭拉分校,美国)和多峰分布如前所述25]。肽的量耦合在LN的表面是由高效液相色谱采用量化UHPLC-Agilent 1290无穷Zorbax Eclipse + C18柱(2.1×100毫米,3.5μ米)。0.1%的流动相由梯度组织组织在水中(a)和0.1%乙腈(B) (B直到分钟7 60%和40%是倒生的比例为40%和60%时B然后再切换在60%和40% B分钟9)。流量为0.25毫升/分钟和检测器波长被设定为220海里。的耦合量肽是间接地通过测量非耦合的数量决定,自由肽如前所述[28]。裹入地塞米松的数量是1290年由UHPLC-Agilent无穷列Zorbax Eclipse + C18(2.1×100毫米,3.5μ米)。流动相是混合物(50的比例:50)10毫米不组成₂阿宝₄,pH值:3,乙腈。地塞米松是检测到242海里使用0.25毫升/分钟的流量。

2.4。细胞培养

人类内皮细胞系(EA.hy926细胞株)(从美国购买类型文化集合)生长在杜尔贝科融合修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清,100 U青霉素,和100年μg / mL,链霉素37°C公司5%₂孵化器使用培养皿(60毫米直径)或24-well板块(4×10的密度⁴细胞/)。EA.hy926培养细胞的特征表明,他们表达典型的电子商务特点:形态,他们似乎不是polygonal-shape密切的单层细胞和表达血管性血友病因子(29日]。

THP-1细胞,单核细胞细胞系(一种Dimitris Kardassis教授的礼物,克里特大学医学院,伊拉克里翁,希腊)生长在悬挂在RPMI 1640包含5%灭活胎牛血清的培养基,在37°C, 5%的公司₂,分手(1:5)每周两次(30.]。

2.4.1。可视化的PLN绑定和使用共焦显微镜由EA.hy926细胞内化

这个目的,EA.hy926细胞被播种在盖玻片24-well板完全生长介质的密度7×10⁴细胞/ 24小时,然后,增加P-selectin的表面表达,与肿瘤坏死因子-细胞被激活α(20 ng / mL) 18个小时。

结合研究EA.hy926略与4%多聚甲醛固定细胞(PFA),然后孵化1小时暂停Rhodamine-PE贴上PLN或LN(控制)。洗后,这些细胞被安装Roti-Mount FluorCare DAPI(德国罗斯GmBH)显微镜幻灯片。

内化研究激活EA.hy926细胞孵化与荧光标记PLN的悬架和不属预定目标的LN对不同时间间隔(30分钟,2、4或8小时),用PBS洗净,然后用4%多聚甲醛固定安装在幻灯片,如上所述。使用共焦激光扫描显微镜载玻片的可视化倒置显微镜(徕卡TCS SP5)使用纳米兴奋和纳米罗丹明和发射波长纳米兴奋和纳米DAPI-stained核发射波长。图像处理使用LAS AF软件(版本2.6)。

2.4.2。定量测定与EA.hy926 PLN绑定和吸收细胞用流式细胞术

量化全球细胞协会(PLN绑定和吸收),激活EC被播种到板材12-well 24小时,激活TNF -α(20 ng / mL) 18个小时,然后用Rhodamine-labeled PLN孵化和LN 2小时。调查EA.hy926 PLN协会的特异性激活细胞,竞争进行了研究。1小时的细胞被preincubated超额P-selectin绑定肽(~ 25倍更高浓度的肽肽耦合表面PLN)相比之前与PLN孵化。与PBS洗涤三次后,培养EA.hy926细胞脱离使用5毫米EDTA的盘子,用PBS,颗粒状,和分析一个不负责任的人流式细胞分析仪(贝克曼库尔特),使用蓝色激光激发在488 nm和排放在585/42 nm FL2-H通道。

2.4.3。RNA隔离、逆转录和实时PCR

EA.hy926细胞被播种在浓度为400.000 /在6-well盘子,允许增加24小时,然后孵化与TNF - 8小时α(20 ng / mL)和1μM敏捷免费或封装到PLN (PLN-Dex)或LN (LN-Dex)或控制PLN(没有敏捷)。细胞总RNA分离使用试剂盒试剂。合成第一链cDNA进行雇佣1μ克总RNA和MMLV逆转录酶(英杰公司)根据制造商的协议。量化后的mRNA进行放大的cDNA使用LightCycler 480实时PCR系统(罗氏)SYBR绿色化学,引物在表1人类基因和表2对老鼠的基因。优化放大条件2.5毫米MgCl₂,退火60°C,在72°C和扩展了40周期。使用比较相对量化了方法和表达为任意单位。mRNA水平正常化β肌动蛋白mRNA水平。

2.4.4。单核细胞粘附试验

融合性的培养EA.hy926细胞(24-well板块)和肿瘤坏死因子- coincubatedα(20 ng / mL)和1μM敏捷或者免费或封装到PLN-Dex LN-Dex或控制PLN(没有敏捷)8小时。单核细胞(THP-1细胞)被孵化10荧光标记μ7米2′′双(2-carboxyethyl) 5 (6) -carboxyfluorescein acetoxymethyl酯(BCECF-AM) 30分钟37°C RPMI 1640培养基,随后通过离心洗。

EA.hy926细胞与温暖的PBS和洗(三次)然后用荧光标记单核细胞(10孵化⁶细胞/毫升)30分钟37°C。不依从单核细胞被洗了温暖的PBS和细胞(EA.hy926细胞和附着单核细胞)细胞溶解与裂解缓冲和分析TECAN分光光度计的激发和发射波长480 nm和520 nm,分别。

2.4.5。单核细胞轮回分析

的影响PLN-Dex轮回的人类单核细胞通过激活EA.hy926细胞使用Boyden钱伯斯被古典轮回分析评估。EA.hy926细胞被播种在插入过滤器使用0.1%明胶和confluency他们暴露6 h 20 ng / mL TNF -α和1μM敏捷或者免费或封装到PLN LN (PLN-Dex LN-Dex, resp)或控制PLN / LN(没有敏捷)。单核细胞被标记和BCECF-AM EA.hy926孵育细胞单层16 h。轮回的单核细胞是由血清梯度(1% FCS在参议院和10% FCS在下议院)。众议院的单核细胞迁移以及那些坚持在过滤器的下部使胰蛋白酶化和洗PBS和荧光测量使用TECAN分光光度计的激发和发射波长480 nm和520 nm,分别。

2.5。动物研究

2.5.1。的动物模型

在这项研究中,雄性C57BL / 6小鼠从查尔斯河实验室使用。所有的动物都能访问标准啮齿动物饮食和水随意并保存在一个温控室在24°C和12小时光/暗周期。炎症是C57BL / 6小鼠诱导静脉注射注入脂多糖的大肠杆菌血清型O111: B4的浓度为0.5毫克/公斤。被小心地避免动物痛苦的在每个阶段的实验。

2.5.2。测定的荧光标记PLN或LN体外成像

老鼠(20 - 25克的重量)静脉注射(注射)无菌PBS或有限合伙人(0.5毫克/公斤),4小时后注射100μL (1μ摩尔Rhodamine-labeled PLN或LN的脂质)。五个小时后注射LPS、动物与氯胺酮麻醉/甲苯噻嗪,通过开放心脏穿刺抽血,灌注冷PBS通过左心室肝脏穿刺时允许排除血液系统。心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏和大脑被收获,它们的荧光成像系统分析的新光谱卡尺(560 nm激发波长590 nm波长发射)。荧光辐射效率的图像量化每个事件激发强度的荧光发射光芒:(p /秒/厘米²/ sr) / (μW /厘米²)使用的(ROI)函数4.3.1的生活形象。软件。然后,组织在液态氮冷冻和储存在−80°C,直到进一步的化验。组织匀浆得到利用沉默破碎机从Heidolph M高速搅拌器。

2.5.3。PLN-Dex管理效果的评估炎性分子的表达

老鼠注射。有限合伙人(0.5毫克/公斤),100年μL自由地塞米松(1毫克/公斤,敏捷)或敏捷封装在脂质这种[PLN-Dex(0.5毫克/公斤地塞米松),LN-Dex(0.5毫克/公斤地塞米松)]或空PLN。3小时后,类似的浓度自由地塞米松或这种被注入到老鼠。在24小时后注射。管理,动物被麻醉,通过开放心脏穿刺抽血,灌注冷PBS通过左心室肝脏穿刺时允许排除血液系统。心脏、肺、肝、脾、肾、大脑和收获,在液态氮冷冻,储存在−80°C,直到进一步的化验。组织匀浆得到利用沉默破碎机从Heidolph M高速搅拌器。rt - pcr对炎性分子(il - 1β肿瘤坏死因子-α执行、il - 6和MCP-1)如前一节所述。显示在表使用的引物2。

2.6。统计分析

结果表示为均值±SD和实验进行了至少一式三份。动物实验包括三至七老鼠/组。统计差异评估利用克鲁斯卡尔-沃利斯非参数独立分析,其次是Bonferroni Dunn-Sidak,图基事后测试。差异被认为是统计上的显著水平。

3所示。结果

3.1。对脂质这种

在这项研究中使用的脂质这种方法得到开发和特点在一项研究25]。动态光散射的物理化学特性显示LN-Dex和PLN-Dex的大小纳米和分别nm,多分散性指数在0.083和0.13之间。高效液相色谱数据表明,与特异性肽P-selectin耦合表面的脂质浓度的这种μg肽/μ总脂质(相当于摩尔%的总肽与LN孵化)。地塞米松的截留效率为脂质这种由高效液相色谱法%,对应于22所示μg地塞米松/μ摩尔总脂质。确定血清PLN-Dex的大小的影响,这种被孵化在PBS缓冲,pH值:7.4,补充50%胎牛血清的24小时。在这种情况下,PLN-Dex的大小海里,表明暴露PLN-Dex血清大小变化不明显。PLN-Dex稳定性的解释在血清的存在phospholipidic挂钩的衍生品的这种表面上阻碍血清蛋白的大量吸附在表面和纳米颗粒的聚集。同时,我们测试时间存储在4°C的影响的大小,发现PLN-Dex不是大幅修改6个月后,当一个增加的大小%是观察。多分散性指数在0.08和0.18之间。

3.2。绑定和吸收P-Selectin靶向脂质这种(PLN)激活EA.hy926细胞

在初步研究中,我们评估,通过流式细胞术,表面P-selectin TNF的表达α激活人类EA.hy926细胞。结果发现,% P-selectin激活EC是积极的。因此,进一步的研究,TNF -α激活EA.hy926细胞被用来评估目标nanoemulsion P-selectin的绑定和吸收。

PLN P-selectin表达人类的具体绑定激活EA.hy926细胞评估通过共焦显微镜使用荧光标记这种。获得的图像显示的数量PLN TNF -表面α激活EA.hy926细胞显著增加相比,不属预定目标的LN的绑定(图1(一))。

虽然具体的绑定nanoformulations EA.hy926激活细胞表面的保证选择性为目标至关重要,这种可能会增加潜在的细胞内化封装药物的治疗效果。

全球协会(绑定和吸收)的Rhodamine-PE标记不属预定目标的(LN)和P-selectin靶向脂质这种(PLN) TNF -α激活EA.hy926细胞进行流式细胞术在孵化后2小时37°C。结果表明,当TNF -α激活与PLN EA.hy926细胞被孵化,Rhodamine-positive细胞的数量达到一个值%以上的价值获得控制LN(图使用1 (c))。

测试的特异性PLN协会EA.hy926细胞preincubated过度的自由肽在孵化前PLN和LN。这个条件显著降低的细胞吸收PLN (肿瘤坏死因子- %)α激活细胞(数据1 (b)和1 (c)),确认绑定通过P-selectin PLN EA.hy926细胞发生特定的机制,由这种表面亲和肽耦合。

可视化,通过共焦显微镜,Rhodamine-labeled PLN孵化与TNF -α在37°C激活EA.hy926细胞不同时间间隔了逐渐增加的细胞内荧光30分钟(图8小时1 (d))。

3.3。PLN-Dex减少促炎细胞因子的基因表达激活EA.hy926细胞

我们研究了地塞米松的抗炎活动是否有效封装后保存成这种。因此,地塞米松治疗效果,免费或加载到不属预定目标的LN (LN-Dex)或P-selectin PLN (PLN-Dex)对肿瘤坏死因子-目标αEA.hy926激活细胞,被量化评估等炎症标记物的mRNA水平il - 1β肿瘤坏死因子-α、il - 6、引发MCP-1和咆哮。最初,我们发现与肿瘤坏死因子- EA.hy926细胞的培养α8个小时所有的促炎细胞因子的表达水平明显增加(图分析2)。

实验表明,TNF的孵化α激活EA.hy926细胞空PLN没有任何重大影响炎症标记物的mRNA水平调查,发现在治疗水平显著降低与敏捷或敏捷加载到这种自由。正如预期的那样,自由敏捷的信使rna表达水平显著降低TNF -αil - 6,引发,咆哮EA.hy926细胞,激活与肿瘤坏死因子-α培养细胞缺乏敏捷治疗(图2)。Dex-loaded脂质nanoemulsion (LN-Dex)也减少了il - 1β肿瘤坏死因子-α,引发MCP-1,咆哮mRNA表达水平,2.2 - 2.3,2.4,和3.0倍,分别。如图2,免费敏捷或加载到不属预定目标的这种降低大多数炎症标记物的表达水平在我们的研究评估。然而,最强的治疗效果检测当激活细胞治疗与地塞米松P-selectin针对这种被加载(PLN-Dex)的mRNA水平il - 1β肿瘤坏死因子-α、il - 6、引发和咆哮显著降低了4.4,2.5,3.9,3.7,和4.0倍,分别。

3.4。PLN-Dex功能作用抑制单核细胞粘附和轮回/通过激活EA.hy926细胞

是否,除了减少一些促炎细胞因子的基因表达,TNF - PLN-Dex引起的抗炎效果α激活EA.hy926细胞是由一系列功能效应,抑制单核细胞粘附和通过激活EC轮回,据报道,单核细胞粘附和轮回进入皮下空间炎性疾病的早期发病机制中的关键事件(31日]。

荧光标记单核细胞的粘附TNF -α激活EA.hy926细胞高度增加(3.7倍),而单核细胞粘附到未激活的EA.hy926细胞(图3(一个))。单核细胞粘附激活EA.hy926细胞抑制了1.61倍的免费敏捷1μM浓度(图4(一))。相同浓度的敏捷纳入PLN-Dex诱导显著抑制单核细胞粘附(1.8倍)。空PLN这种LN-Dex也减少了单核细胞粘附(约1.4倍),但效果并不显著。

人类单核细胞通过EA.hy926轮回细胞单层被经典的轮回分析评估使用Boyden钱伯斯节中描述2。EA.hy926细胞的活化与肿瘤坏死因子-α显著增加单核细胞轮回的4.1倍相比,未激活的EA.hy926细胞条件(图3 (b))。

Coincubation TNF -α激活EA.hy926细胞1μM PLN-Dex显著降低的单核细胞通过EA.hy926轮回细胞单层的2.39倍。虽然免费敏捷、LN-Dex和空PLN轮回略减少单核细胞,这种效应并不显著(图3 (b))。虽然类似的浓度的免费地塞米松能够减少单核细胞粘附EA.hy926细胞,单核细胞轮回过程不能减少同样的待遇。自由的不同影响敏捷的附着力和轮回过程可以解释为不同孵化时间在两个实验:单核细胞粘附,孵化EA.hy926细胞用于只有30分钟,而轮回实验16小时。因此,不同培养时间的两个实验可以解释的局限性免费地塞米松在减少长期的炎症过程的时候,功能化PLN-Dex被证明是有效的在减少THP单核细胞粘附和轮回。虽然PLN抑制单核细胞轮回高于LN(1.54倍和1.15倍,图4 (b)),这种差异没有统计学意义。

3.5。Biodistribution PLN急性炎症的小鼠模型的研究

为了诱发小鼠急性炎症,动物是静脉输液注射LPS(0.5毫克/公斤),4个小时后,Rhodamine-PE标记PLN或LN的静脉注射。老鼠牺牲1小时后这种管理,通过心脏穿刺血管被,器官是可视化体外通过荧光光学成像雇用一个新光谱系统。器官的biodistribution量化荧光辐射效率(每事件激发荧光发射辐射强度(p /秒/厘米²/ sr) / (μW /厘米²)使用的(ROI)函数4.3.1的生活形象。软件。

按照我们之前的研究LN biodistribution [25),我们观察到最高的积累对LN和PLN发生在肝脏的老鼠注射PBS控制(928.3×10⁸和820.6×10⁸、职责)或有限合伙人(1132×10⁸和1430×10⁸职责),四组(数据之间没有显著差异4(一)和4 (b))。有趣的是,PLN积累LPS-injected小鼠的肺是明显高于LN积累在肺部相同的小鼠模型(74.35×10⁸和26.12×10⁸),而在PBS-injected老鼠PLN和LN积累在肺部相似(15.15×10⁸和10.4×10⁸)。分析了其他器官(肾、脾、脑和心脏),类似的观察biodistribution有限合伙人,PBS-injected老鼠和PLN之间没有显著差异观察和LN,可以观察到的数据4(一)和4 (b)。

肺部PLN的积累显著增加是由于激活的血管对血管内皮细胞和肺毛细血管和超表达P-selectin的质膜。大量研究文献表明,P-selectin后小鼠肺中高度表达的有限合伙人管理(32,33]。通过确定mRNA表达il - 1水平的促炎的标志β溶菌产物的肺,肝脏,肾脏,LPS-injected老鼠的大脑,我们发现增加了il - 1β最高水平相比PBS-injected老鼠,两组之间的区别是肺部溶解产物(图中观察到5(一个))。这可以解释明显高于积累PLN LPS-injected肺的老鼠,比nonfunctionalized LN和PBS-injected老鼠。

3.6。抗炎作用的PLN-Dex LPS-Injected老鼠

老鼠输液注射LPS(0.5毫克/公斤)和100年μL自由地塞米松(1毫克/公斤,敏捷)或脂质这种[PLN-Dex(0.5毫克/公斤地塞米松),LN-Dex(0.5毫克/公斤地塞米松),或空PLN)。3小时后,免费地塞米松或脂质这种被注入到老鼠。抗炎作用进行了24小时后,有限合伙人管理。高mRNA水平的促炎细胞因子(il - 1分析β肿瘤坏死因子-α、il - 6和MCP-1)证实了强大的炎症效应LPS诱导的小鼠急性炎症(图模型5 (b))。管理PLN-Dex LPS-injected老鼠显著降低肺mRNA水平的il - 1β、il - 6和MCP-1(由三倍、4.4倍和2.37倍,分别地),而未经处理的LPS-injected老鼠(图5 (b))。同一PLN-Dex治疗降低TNF的mRNA水平α减少了2.24倍,虽然这并没有统计学意义。有趣的是,无论是免费敏捷还是LN-Dex能够表现出显著的影响在减少四个炎症标记物的表达水平进行了分析。与获得的结果在体外在内皮细胞,敏捷显著降低TNF -自由α和il - 6 mRNA水平和LN-Dex TNF -有所下降α水平,抗炎效果的两个治疗中没有观察到在活的有机体内实验。相反,一个强大的抗炎效果PLN-Dex都被观察到在体外和在活的有机体内实验。

虽然不显著,但空P-selectin目标PLN稍微降低il - 1的mRNA水平β、il - 6和MCP-1 28.3%, 25%,和27.8%,分别。这是根据大量的临床前研究,结果表明,政府针对减少半个重要的炎症标记物的抗体或P-selectin [12- - - - - -15]。

4所示。讨论

鉴于内皮中起关键作用的开发和发展血管炎症和由其战略地位很容易进行治疗药物静脉注射,欧盟代表药理干预的一个理性目标。我们假设细胞粘附分子P-selectin人们是一个适当的分子目标指向表面激活内皮细胞的质膜由于其高表达激活EC在急性炎症反应(34)和慢性炎症血管内皮上覆动脉粥样硬化病变(35]。P-selectin mRNA的表达ApoE-deficient小鼠主动脉的强烈与病变的进展,表明P-selectin成像和靶向治疗策略是一个很好的候选人在动脉粥样硬化(24]。E-selectin相比,其他selectin EC表面上表示这是内化在溶酶体通过内吞作用和目的,P-selectin是内化EC利用不同的途径,即通过核内体、trans-Golgi网络(TGN)和存储颗粒(10,11]。从早期的核内体,利用P-selectin TGN一半时间20 - 25分钟,6到7倍的低密度脂蛋白受体;因此,膜表面的P-selectin表达式是非常动态的(11]。针对纳米颗粒对P-selectin可能使用一个路由的优势内部化,避免溶酶体降解的药物裹入到纳米颗粒,从而造成更好的胞质交付封装药物(如地塞米松)。

在这项研究中,我们发展和脂质携带肽的这种特征与亲和力P-selectin (PLN)作为抗炎药物地塞米松的人们。我们报告在这里P-selectin目标这种绑定和被激活EC, EA.hy926细胞,以更高的速度与nonfunctionalized LN相比,证明PLN的吸收是由肽耦合表面的这种。此外,TNF - PLN内化α激活EA.hy926细胞逐渐增加的时间8小时,确认胞质内的这种的存在。由于地塞米松的作用机制是细胞内通过绑定到胞液糖皮质激素受体(17],内化P-selectin针对这种可能增加敏捷合并在这个配方的治疗效果,观察到在先前的研究[21,22]。

实际上,纳米粒子内化的EC取决于许多因素相关在活的有机体内剪切应力等有针对性的一部分,内吞作用,细胞内贩卖(36,37]。例如,PECAM-1靶向纳米颗粒显示不同的内化率依赖于流剪切应力:急性剪应力,典型的静脉血管,刺激的有针对性的人们而慢性剪切应力,与肌动蛋白纤维应力的形成,减少他们的内吞作用37,38]。因此,这些因素可能会影响PLN-Dex定位能力和内化在活的有机体内,未来的研究需要完成破译这些重要的方面。

的抗炎效应Dex-loaded这种在TNF -监控α激活EA.hy926细胞。最重要的一个群体的细胞因子、炎症介质和随着时间的推移,他们中的一些被认为是炎症过程的标记。在我们的研究中,PLN-Dex显著减少了基因表达的重要的促炎细胞因子(例如,TNF -α,il - 1β、il - 6、引发MCP-1和咆哮)与肿瘤坏死因子- EA.hy926细胞激活α。这个结果证实封装的地塞米松保持这种药物的治疗特点,会使目标的方法。数据显示一个类似的信使rna表达水平降低了炎症蛋白质(尽管不是统计学意义在某些情况下)敏捷配方。这可能用这一事实来解释,在细胞培养条件下,8小时的潜伏期后,细胞可以接受免费的敏捷和不属预定目标的LN-Dex由一个未指明的机制和敏捷交付细胞的浓度足以产生观察抗炎效果。另一方面,为了增加效率的目标交付敏捷的EC PLN-Dex,应该尝试进一步增加针对通过优化的特异性肽的密度与P-selectin亲和力这种表面。促炎细胞因子分析已知增加内皮炎症,促进白细胞招募和轮回的皮下空间,两个早期炎性疾病的发病机制中的关键事件(39]。

在进一步的实验中,我们测试是否与dexamethasone-loaded EA.hy926激活细胞的治疗这种功能参与单核细胞粘附和轮回。孵化的激活与PLN-Dex EA.hy926细胞显著减少通过内皮细胞单层单核细胞粘附和轮回。然而,类似的自由地塞米松浓度减少只有单核细胞粘附和没有轮回的过程,这一事实可以解释为不同时间点的调查(30分钟,16小时粘附和轮回实验,分别地)。因此,自由敏捷的治疗效果在减少细胞轮回炎症过程是有时限的。这个结果证实与我们先前的研究显示,这种脂质这种配方封装药物的长时间释放,使它们适合长期治疗效果(25]。

的在体外结果进一步证实了在活的有机体内研究中,使用鼠标LPS-induced急性炎症模型。的器官biodistribution分析管理P-selectin-targeted nanoformulations显示明显高于积累在肺部,相比不属预定目标的这种。这表明LPS诱导激活血管EC衬里肺部血管,增加P-selectin的表达在质膜上。肺脉管系统包含在一个广泛的毛细血管网络,主要展品~ 30%体内内皮表面和接收超过50%的整个心输出量(40]。因此,代理与内皮亲和力积聚在肺部静脉注射后,即使他们panendothelial目标因素相对均匀分布在所有类型的体内EC (21,41]。

事实上,P-selectin激活血小板也表达了炎症过程中发挥重要作用。有趣的是,先前建立,静脉注射管理有限合伙人不会增加表面的表达P-selectin小鼠血小板(42- - - - - -45]。对于这一现象的一个可能的解释是,血小板不CD14表达有限合伙人需要绑定到其表面(42]。按照这个,在我们的实验中,我们没有发现任何特定绑定的荧光标记PLN血小板治疗的老鼠静脉注射有限合伙人(数据没有显示)。

此外,它已经证明,静脉注射LPS诱导系统性炎症在所有器官特别是肺(46,47]。确认静脉注射LPS诱导的急性炎症的主要器官的老鼠,我们决定,通过定量rt - pcr, mRNA水平的il - 1β溶菌产物的肺、肝脏、肾脏、大脑和发现显著增加水平相比PBS-injected老鼠;最高的il - 1β在肺mRNA水平检测。

静脉注射0.5毫克/公斤PLN-Dex管理有显著积极影响降低mRNA水平等重要的促炎细胞因子il - 1β、il - 6和MCP-1小鼠的肺中急性系统性炎症,尽管LN-Dex政府没有显著的影响。在初步研究中,我们观察到静脉输液管理0.5毫克/公斤免费敏捷没有显著疗效减少促炎细胞因子分析;因此,我们决定增加浓度为1毫克/公斤在我们的研究中。自由敏捷的管理(1毫克/公斤)的mRNA水平无显著影响研究细胞因子/趋化因子,即使使用的浓度是双重的浓度相比敏捷压铸PLN-Dex和LN-Dex(0.5毫克/公斤)。总的来说,在活的有机体内结果验证在体外培养的内皮细胞,获得的数据显示,P-selectin靶向脂质这种富含地塞米松有显著抗炎效应通过减少促炎的分子的基因表达。PLN-Dex治疗小鼠抗炎效应观察可以解释为地塞米松由这种综合效应,加上表面P-selectin EC的阻止这种目标,此前据报道,有助于减少炎症过程(12,13]。我们的结果与先前的研究表明,敏捷封装到溶菌酶葡聚糖纳米凝胶针对细胞粘附分子ICAM-1块LPS-induced肺部炎性细胞粘附分子的过度表达,当小鼠静脉输液管理(21]。

在这项研究中描述的方法可以使未来的适用性许多强有力的抗炎药,今天不让它的临床试验,因为缺乏特异性和随之而来的严重的副作用。P-selectin的地方和特定疾病过度炎症肺内皮使P-selectin成为一个优秀的目标分子的疗法。这种策略可能是多种疾病的临床意义与炎症组件P-selectin过表达,是动脉粥样硬化的情况或类风湿性关节炎。

5。结论

地塞米松的靶向激活内皮细胞的脂质这种被加上P-selectin-specific肽作为导航设备有选择地减少促炎基因的表达,减少单核细胞粘附并通过内皮细胞单层和轮回在体外在培养的内皮细胞激活和在活的有机体内在小鼠模型的肺急性炎症。此研究表明,潜在的特异性药物输送针对disease-induced内皮细胞表面分子作为血管炎症的治疗策略。

伦理批准

老鼠的实验机构伦理委员会的批准,按照欧盟的指导方针,进行附件指令86/609,附录A的欧洲公约保护脊椎动物用于实验和其他科学(ETS没有。123),斯特拉斯堡,2006年。

相互竞争的利益

作者报告没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢加芙Mesca技术援助。这项工作是由UEFISCDI(执行单位资助教育、研究、开发和创新)PN ii -俄罗斯- te - 2014 - 4 - 1837项目和PN - ii - ID - pce - 2011 3 - 0928项目(CARDIOPRO项目ID: 143年,ERDF RTDI共同融资投资的竞争力和罗马尼亚学院)。本文致力于罗马尼亚学院150周年。